CN103865903B - 一种耐高温碱性木聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐高温碱性木聚糖酶，属于酶制剂制备技术领域。以产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌701为出发菌株经液体深层发酵制备。本发明的耐高温碱性木聚糖酶酶比活力为350-420IU/ml；适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0。比现有的耐高温碱性木聚糖酶酶活力高，耐温度高，耐碱性强，酶作用最适pH值范围宽泛，特别适合造纸、食品和饲料等领域的工业化需求。

Description

一种耐高温碱性木聚糖酶
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，特别是一种耐高温碱性木聚糖酶。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素是植物半纤维素的主要成分，它们共同作用构成了植物细胞壁的支撑骨架，在三者之中半纤维素占据了植物干重的35%以上，半纤维素也是多种复合聚糖的总称，其主要成分为木聚糖，它是一种复杂的多聚五碳糖。木聚糖的主链是通过β-1-4糖苷键把多个吡喃木糖基连接起来，侧链上连接着不同的取代基，这样有乙酰基、葡萄糖醛酰基、L-阿拉伯糖基等（Collinsetal.,2005）。所以木聚糖的完全降解就需要多种酶的共同参与。一般将木聚糖分为硬木木聚糖和软木木聚糖。硬木木聚糖主要是由0-乙酰-4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖聚合而成，以β-1-4糖苷键相连。软木聚糖由阿拉伯4-0-甲基葡萄糖醛酰木糖残基聚合而成（Begetal，2001）。有的分类方法也把木聚糖分为可溶性木聚糖和不可溶性木聚糖。
木聚糖酶（1,4-β-D-xylanase:EC3.2.1.8）是一种重要的工业用酶，在分解木聚糖时起生物催化作用，可以将木聚糖分解成多糖或单糖的蛋白质或RNA。木聚糖酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生木聚糖酶。
由于木聚糖酶在工业上潜在的应用价值，在近十年内引起了人们的更多注意，其中碱性木聚糖酶主要应用于纸浆和造纸企业。碱性木聚糖酶在造纸行业中的应用主要包括制浆、协助漂白、改纤维性质、废纸脱墨等方面。
在工业生产中，制浆过程是在碱性的条件下，用高温蒸煮的方法除去木质素，为使溶解制浆纤维素纯度达到98%，这就需要大量的氢氧化钠处理纸浆，造成了严重的环境污染，为此许多学者转而尝试生物处理制浆，而用于制浆漂白的木聚糖酶应是耐热和耐碱的。冯建良等（Kimuraetal.2000）用木聚糖酶预处理麦草与常规化学法制浆进行了比较试验，木聚糖酶预处理提高了原料的脱木素程度，还可以降低制浆的卡伯值。木聚糖酶在辅助漂白方面有较广泛而深入的研究，且取得了很大成果。研究发现，无论是针叶木浆、阔叶木浆或是竹浆、草浆，木聚糖酶均可以降解纸浆中残余的木质素，提高了白度(ALBALAAetal,2006；MeekandLipman,1922)。用于纸浆漂白的木聚糖酶必须具有耐高温特点，Khasin等得到了一个来源于碱性菌株BacillussterarothermophilusT26木聚糖酶，该木聚糖酶在pH9.0及65℃时对纸浆有最好的漂白效果（Khasinetal,1993），很多木聚糖酶不具备这样的特点，限制了商业化应用。全世界每年产生的废纸数量是惊人的，废纸回收后再利用工作就变得尤为重要了，可以使在资源重复利用的同时也保护了环境。1991年，由韩国学者首次报道了应用木聚糖酶能将油墨从新闻废纸浆中脱除。此后，人们开始研究利用木聚糖酶进行废纸脱墨，以减轻或消除化学脱墨带来的环境污染（曹军卫等，2004）。
目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美洲的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中加拿大有约10%的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于制浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业上应用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50℃左右，众所周知，纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖酶产品在此领域的应用受到极大的限制，另外，在饲料和食品领域，木聚糖酶应用在饲料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高温条件下能够保持较高的酶活，因此，研究开发耐高温的木聚糖酶产品将会带来良好的经济效益和社会效益。
从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶产酶菌，是一个有效获得高产木聚糖酶菌株的一个最有效的手段。自从木聚糖酶具有生物漂白功能以来，人们把更多的目光投向了碱性木聚糖酶，筛选了很多具有应用前景的碱性木聚糖酶的生产菌株，分离了很多碱性木聚糖酶。1973年，Horikoshi等首次发现了来自碱性细菌中的木聚糖酶（HorikoshiandAtsukawa,1973），从碱性细菌Bacillussp.No.C25922中纯化得到木聚糖酶，它的最适PH为6-8。之后，发现了来自碱性细菌BacillusNo.C2125的2个木聚糖酶：木聚糖酶A及木聚糖酶N，其中木聚糖酶A在pH12时也有一定的酶活（Hondaetal,1985）。Dey等（Deyetal,1992）分离的嗜碱嗜热菌Bacillussp.(NCIM59)，能产生2个没有纤维素酶活性的木聚糖酶，它们具有很好的耐碱性，最适pH为10.0。Nakamura等报道了来源于碱性菌株Bacillussp.41M21的胞外木聚糖酶J它的最适pH为9.0（Nakamuraetal，1993）。大多数真菌产生的木聚糖酶一般为酸性木聚糖酶，但也有例外，Taneja等筛选到一株嗜碱真菌AspergillusnidulansKK299，它产的木聚糖酶的最适pH为8（Tanejaetal，2002），并且该酶对硬木木聚糖比软木木聚糖有更高的亲和性。
中国专利CN101701205A公开了一种耐碱性木聚糖酶XynE2及其基因和应用，所产耐碱性木聚糖酶最适pH值7.8，最适温度65℃；中国专利CN102586134B公开了一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及其应用，所产木聚糖酶最适pH值6.0，最适温度70℃；中国专利CN102321558A公开了一种耐高温木聚糖酶的高产菌种及利用该菌发酵产耐高温木聚糖酶的方法及得到的酶，所产耐高温木聚糖酶最适pH值7.0，最适温度60℃。
由此看来，国际及国内诸多专家、学者及科研工作人员不惜资金、人力和时间，加大了对耐高温、耐碱性木聚糖酶的研发力度，旨在将生物技术在造纸、食品、饲料等领域的应用推向一个更高、更新、更强的新时代，无论是新菌种的获得，还是采用基因重组技术，虽然耗费了如此之大的财力及精力，但结果不尽人意，很难达到耐高温、耐碱性木聚糖酶的研发目标及要求，要么耐温不耐碱；要么耐碱不耐温；要么耐碱耐高温范围不宽泛；要么木聚糖酶不纯并有纤维素酶活性；要么作用底物不适等等，制备一种耐碱性更强、耐温度更高、耐碱耐高温范围宽泛、不具有纤维素酶活性且适合造纸、食品和饲料等领域的耐高温碱性木聚糖酶仍是本领域技术人员不懈的追求和研发方向。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有耐高温碱性木聚糖酶的产品缺陷，以产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌（Bacillusthermophilus）701为出发菌株，并通过优化培养基组成和发酵工艺制备出一种耐高温、耐碱性强、作用条件宽泛、不具有纤维素酶活性的适合造纸、食品和饲料等领域的耐高温碱性木聚糖酶。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述耐高温碱性木聚糖酶的酶学性质如下：
（1）温度：该酶温度适应范围较宽，适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；
（2）pH：该酶适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0；
（3）酶活性：发酵液碱性木聚糖酶酶比活力较高，为350-420IU/ml；
（4）热稳定性：该酶在70℃条件下保存1h后仍能保持80%以上酶活，75℃条件下保存1h后保持70%以上酶活；
（5）存储稳定性：该酶在室温下保存12个月后酶活损失小于3.0%。
所述耐高温碱性木聚糖酶的制备方法如下：
将保存完好的嗜热芽孢杆菌701的斜面菌种经活化和逐级扩大培养（包括一、二、三级种子培养以及一级种子罐培养）得到种子液，以6%接种量接入发酵罐，培养温度37-45℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至37-45℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温碱性木聚糖酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药剂粉。
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,琼脂15-20g，中草药剂粉5-10g，蒸馏水l000mL，pH值5-11，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
以重量份数计，称取黄芪20-30份，党参10-18份，柴胡10-15份，黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10%。
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。
所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，中草药剂粉1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1-0.3%，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药剂粉1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，桦木木聚糖0.1-0.8%，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0x108个/ml；
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药剂粉30-50g，海藻糖30-40g，桦木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值5-11，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节pH值5-11，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH5-11，121-123℃灭菌30-40min备用。
发酵液碱性木聚糖酶比活力为350-420IU/ml，对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃、55℃下，60分钟酶活没有下降。60℃与65℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。70℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。75℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。
本发明耐高温碱性木聚糖酶可在造纸漂白中应用。
本发明提供的产耐高温碱性木聚糖酶的嗜热芽孢杆菌701是从湖南省雪丽造纸厂采集土样分离出一株嗜热芽孢杆菌HYX0021，经反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变筛选获得，特性是耐高温、耐碱性强。
本发明提供的产耐高温碱性木聚糖酶的菌株具体为嗜热芽孢杆菌701。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072），保藏号为CCTCCNO：M2013537，分类命名为嗜热芽孢杆菌701（Bacillusthermophilus701）。
本发明提供的嗜热芽孢杆菌701是革兰氏阳性，杆菌，好氧，产芽孢，在LB固体培养基上37℃培养24h，菌落呈圆形，菌落直径约为1.0-2.0㎜，乳白色，表面光滑，不透明，边缘不规则扩展。周生鞭毛，能运动，无荚膜，有芽孢，菌体大小为(0.7～0.9)μm×(3～3.5)μm，芽孢（0.6～0.9）μm×（1.0～1.5）μm，椭圆状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。液体培养基中生长时，形成皱醭。酪蛋白水解实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、硝酸盐还原实验均为阳性；菌体能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用乳糖以及甘露醇；H2S、接触酶实验、吲哚试验实验均为阴性。
有益效果：
1.本发明的耐高温碱性木聚糖酶酶比活力为350-420IU/ml；适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0。比现有的耐高温碱性木聚糖酶酶活力高，耐温度高，耐碱性强，酶作用最适pH值范围宽泛，特别适合造纸、食品和饲料等领域的工业化需求。
2.本发明耐高温碱性木聚糖酶的制备方法采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了嗜热芽孢杆菌701的抗应激能力，致使菌株产酶能力最大限度地显现。并且本发明对嗜热芽孢杆菌701培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强嗜热芽孢杆菌701的代谢功能，使得本发明所产耐高温碱性木聚糖酶酶活力高、作用条件宽泛、稳定性强、适于工业化生产。
3.本发明耐高温碱性木聚糖酶的制备方法中培养基的重要组成部分中草药粉剂采用酶解工艺和水提醇沉工艺相结合，不仅显著提高了各种中草药的有效成分，增强了中草药的作用效力，而且还为微生物发酵提供了难得的营养物质(如中药多糖等)。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
耐高温碱性木聚糖酶酶活力的测定（3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法）
1.试剂和溶液
1.1所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水,化学药品除特别要求外,均为分析纯。
1.2DNS试剂
称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
1.30.1mol/L，pH5.0醋酸—醋酸钠缓冲液
吸取冰醋酸1.8ml,加适量水，加醋酸钠5.78g，溶解,定容至1000ml,调节PH至5.00±0.01后使用。室温下存放2个月有效。
1.40.1%即1mg/ml木糖标准溶液
无水木糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。
1.51.0%木聚糖溶液
称取木聚糖1.00g于烧杯中，用2ml0.5mol/L氢氧化钠润湿成糊状，加40ml缓冲液，于60～70℃水浴中加热溶解，冷凉后用0.5mol/L醋酸（约2ml）调pH5.0，转入容量瓶中,加缓冲液(4.3)定容至100ml。如果冰箱中放置时间长了出现沉淀，使用前应在热水浴中热溶。
1.6木糖标准曲线的绘制
吸取1mg/ml木糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。以吸光度为纵坐标，木糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与木糖量的关系。
2.待测酶样品的处理
直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
3.酶活力测定
取15ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀)(1.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致,50℃水解10min.
反应步骤及试剂、溶液用量见下表:
试样 空白
1.加底物(1.5)1.8ml 1.加底物(1.5)1.8ml
2.50℃预热3min 2.50℃预热3min
3.加酶液0.2ml 3.50℃水解10min
4.混合 4.加DNS试剂3ml
5.50℃水解10min 5.混合
6.加DNS试剂3ml 6.加酶液0.2ml
7.混合 7.混合
8.沸水浴中10min 8.沸水浴中10min
9.冷却定容至15ml 9.冷却定容至15ml
10.空白调零540nm下测定 10.空白调零540nm下测定
4.酶活力单位计算
酶活力＝(S×D×1000)/（0.2×10）×1.7μg/ml(g).min式中：
S—测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量，mg数；
D—酶液或酶粉稀释倍数；
1000—mg和μg之间的换算系数；
0.2—测定所取酶液量，ml数；
10—反应时间，min数；
1.7—方法换算系数。
5.酶活力单位定义及换算
5.1本方法酶活定义:在本测定条件下，每分钟水解木聚糖产生1μg还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。
国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解木聚糖产生1μmol还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。
5.2u与国际单位IU的换算关系：
1u＝1÷150IU（μmol糖/ml(g).min）
150:木糖的分子量
实施例2
一种耐高温碱性木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的嗜热芽孢杆菌701的斜面菌种接种于斜面培养基，45℃培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g,琼脂20g，中草药剂粉10g，蒸馏水l000mL，pH值10，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
以重量份数计，称取黄芪30份，党参18份，柴胡15份，黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，然后降温至60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶添加量为混合物料总重量的10%。
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β-葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β-淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度43℃，培养时间15h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度43℃，培养时间15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度45℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:2,罐压0.05Mpa,培养时间20h；
所述一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，中草药剂粉2%，海藻糖3%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值10，123℃灭菌40min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精15%，酵母粉0.8%，中草药剂粉2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.5%，桦木木聚糖0.8%，不足部分纯净水补足，pH值10，123℃灭菌40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度45℃，搅拌速度700rpm，通风量（V/V）1:3,培养时间15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将步骤（2）中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至45℃，恒温培养20h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30%；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在10；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药剂粉50g，海藻糖40g，酵母粉8g，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，桦木木聚糖15，消泡剂1g,纯净水l000mL，pH值10，121℃灭菌20min；
所述补料培养基重量组成为：麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，中草药剂粉5-10%，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123℃灭菌30-40min。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值10，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH10，123℃灭菌40min备用。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温碱性木聚糖酶。
所述调配过程不添加任何防腐剂，可以加入浓缩酶液总重量5%中草药剂粉。
实施例3碱性木聚糖酶的热稳定性分析
对酶的热稳定性进行了分析，将实施例2粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液40℃、45℃、50℃、55℃下，60分钟酶活没有下降。60℃与65℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。70℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。75℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％，与现有技术相比达到同样的酶活，耐受温度较高。
实施例4碱性木聚糖酶pH稳定性分析
对酶的pH稳定性进行了分析，将实施例2粗酶液分别置于pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液pH值6.0、7.0、8.0、9.0下，60分钟酶活没有下降。pH值5.0与10.0下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。pH值4.0与11.0下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。同样条件下达到同样酶活耐pH值比现有技术菌株明显宽泛。
实施例5本发明碱性木聚糖酶用于麦草浆的漂白
1.酶处理条件
浆浓5%；温度75℃；处理时间60min；pH值11；酶用量20IU/g。
2.次氯酸漂白条件
浆浓6%；温度40℃；漂白时间120min；漂液为次氯酸钠，浓度为26.25g/L；用氯量为5%、2.5%。
3.纸浆经酶处理及次氯酸盐漂白结果如表1所示，其中h-0：未经酶处理、只用次氯酸漂白的纸浆；h-1：经酶处理、未用次氯酸漂白的纸浆；h-2、h-3：经酶处理、在漂白机里用次氯酸钠漂白的纸浆；h-2、h-0漂白条件完全相同。
从表1中的结果分析：未漂浆经酶处理，可显著改善麦草浆的次氯酸盐漂白性能，当漂白用量为5%时，漂白原浆经酶处理比未经酶处理票后纸浆白度提高18.4%，当漂到65.0%左右时，原浆漂白用氯量为5%，经酶处理的纸浆比对照组可节省用氯50%。
表1：经不同处理后漂白纸浆的结果
编号 h-1 h-2 h-3 h-0
酶用量（IU/g） 20 20 20 —
得率（%） 98.98 95.98 96.9 —
KMnO4值 9.89 9.98 9.74 —
KMnO4值下降（%） 7.26 6.68 8.94 —
用氯量（%） — 5.0 2.5 5.0
残氯（g/L） — 0.30 0.071 0.036
氯耗（%） — 90.69 97.77 98.87
终点pH值 11 8.62 8.38 8.19
白度（%） — 84 65.6 65.6

Claims (6)

1.一种耐高温碱性木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶的酶学性质如下：
(1)温度：适用温度范围为40-75℃，最适反应温度65℃，在75℃酶活完全稳定；
(2)pH：该酶适用反应pH值范围为5.0-11.0，在pH值为11.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为10.0；
(3)酶活性：发酵液碱性木聚糖酶酶比活力为350-420IU/ml；
(4)热稳定性：该酶在70℃条件下保存1h后仍能保持80％以上酶活，75℃条件下保存1h后保持70％以上酶活；
(5)存储稳定性：该酶在室温下保存12个月后酶活损失小于3.0％；
所述木聚糖酶由嗜热芽孢杆菌CCTCCM2013537经液体深层发酵制备，方法如下：将保存完好的嗜热芽孢杆菌CCTCCM2013537的斜面菌种经活化和一、二、三级种子培养以及一级种子罐培养逐级扩大培养得到种子液，以6％接种量接入发酵罐，培养温度37-45℃，搅拌速度200-700rpm，通风量1:1-3V/V,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将种子罐种子液以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至37-45℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温碱性木聚糖酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5％中草药剂粉；
所述中草药剂粉的制备方法如下：称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药剂粉；
所述混合酶制剂的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
2.如权利要求1所述的一种耐高温碱性木聚糖酶，其特征在于，制备木聚糖酶时种子培养基重量组成为：酵母粉0.3-0.5％，葡萄糖1-1.5％，蛋白胨0.3-0.5％，牛肉膏0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，硫酸钙0.1％,氯化镁0.2％,柠檬酸钠0.1-0.3％，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123℃灭菌30-40min。
3.如权利要求1所述的一种耐高温碱性木聚糖酶，其特征在于，制备木聚糖酶时种子罐培养基重量组成为：麦芽糊精5-15％，酵母粉0.4-0.8％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，蛋白胨0.1-0.5％，玉米浆0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，柠檬酸钠0.1-0.5％，桦木木聚糖0.1-0.8％，不足部分纯净水补足，pH值5-11，121-123℃灭菌30-40min。
4.如权利要求1所述的一种耐高温碱性木聚糖酶，其特征在于，制备木聚糖酶时种子罐发酵液菌体浓度为7.0×108-8.0×108个/ml。
5.如权利要求1所述的一种耐高温碱性木聚糖酶，其特征在于，制备木聚糖酶时发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药剂粉30-50g，海藻糖30-40g，桦木木聚糖5-15g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值5-11，121℃灭菌20min。
6.如权利要求1所述的一种耐高温碱性木聚糖酶在造纸漂白中的应用。
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