CN106086113A - 一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法 - Google Patents

一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法。该方法通过制备米糠液，配置米糠培养基，发酵制备阿魏酰低聚糖。本发明采用发酵的方法制备阿魏酰低聚糖，使得微生物产酶与酶解过程合一，省去了酶制剂生产过程中的分离纯化工序，降低了成本，提高了产率。同时，微生物生长过程中对淀粉、蛋白质等成分的利用解决了酶解过程中水解物质的处理问题，资源得到合理利用，并减少了环境污染。本发明的方法简单易行，制备的阿魏酰低聚糖产率高，易于纯化。

Description

一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法
技术领域
本发明涉及一种低聚糖发酵制备方法，特别涉及一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法。
背景技术
我国是稻谷的主要生产国，稻谷产量约占全球稻谷生产的37％，米糠是稻谷加工的主要副产物。在国外，米糠被誉为“天赐营养源”，联合国工业发展组织把米糠称为“一种未充分利用的资源”，具有非常高的保健开发价值。米糠含有多种营养元素和生理性活性物质，其中含有一定量的阿魏酸，经过酶解可并进一步制备获得阿魏酰低聚糖，阿魏酰低聚糖(FOs)具有卓越的生物活性。
阿魏酰低聚糖是一类广泛存在于禾本科植物中的不同糖链位置上的羟基与阿魏酸(FA)羧基酯化形成的功能性低聚糖。FOs对低密度脂蛋白的氧化具有强烈的抑制作用，因此，有望成为生产降血脂、防止动脉硬化药物的新原料；FOS能够清除自由基、抑制脂质氧化、减轻氧化损伤等，因此可以作为功能性食品的配料，从而起到保健作用；FOs能够促进体内益生菌的增殖，因此可将其添加到食品中，以食物的方式进入肠道，改善肠道内微生物的生态环境，对人体便秘及癌症的发生有一定的治疗和预防作用；FOs具有抗氧化和抑菌作用，故可作为食品保鲜剂，延长食品的货架期。所以，其应用前景十分广阔，有巨大的发展空间和市场需求。
由于FOs较强的生物活性，其高效制备方法也成为多数学者关注的热点。功能性低聚糖的制备途径通常有以下4种：在天然原料中提取；糖基转移，包括化学转移和酶转移；糖基聚合，包括化学聚合与酶聚合；多糖降解，包括化学降解和酶法降解。阿魏酰低聚糖的制备方法与功能性低聚糖类似，且制备的原料以禾本科植物为主，目前主要采用物理法、化学法和生物法。
物理法是利用机械降解的方式处理原料，使原料中糖苷键断裂以形成所需产物，其中微波降解是低聚糖制备的主要方法。该方法利用物料在高温下生成的水合氢离子及其形成的有机酸作用，水解半纤维素聚合物，释放水溶性物质，这些水解产物多为低聚糖。微波降解为制备低聚糖最主要的物理方法。Rose等利用微波处理法，在玉米麸中提取得到阿魏酰-阿拉伯糖基低聚木糖，研究表明微波处理温度和处理时间对FOs的产量影响显著，温度过高或时间过长均会降解FOs，使其产量下降。物理法制备FOs因需严格控制处理条件，否则会造成FOs分解，故较少使用。
化学法是利用化学试剂水解原料中的半纤维素，生成不同水解程度的低聚糖，该方法是早期制备FOs的常用方法。黄汝清等采用草酸蒸煮处理玉米皮制备阿魏酰低聚糖；Allerdings等亦采用0.05mol/L的三氟乙酸水解玉米麸IDF获得FOs；Schooneveld-Bergmans等利用氢氧化钙和氢氧化钡等而家氢氧化物处理麦麸获得FOs，在处理过程中，溶剂浓度及处理时间对FOs产量影响显著，高温或高浓度的氢氧化物均使FOs降解。但化学法存在化学物质残留问题，且高温或高浓度的氢氧化物均可使FOs降解，产率下降，制得的产品难以在食品和医药行业使用，且其副产物易造成环境污染。
生物酶法是利用生物酶试剂的水解作用，打开原料细胞壁多糖，获得FOs的方法。植物细胞壁多糖因植物种类不同其单糖组成不同，如米糠等禾本科植物多以木糖聚合而成，而甜菜半纤维素由半乳糖聚合而成。Yuan Xiaoping等在优化的木聚糖酶水解麦不溶性膳食纤维制备FOs的工艺条件下，获得1.5mmo1/L的FOs；Katapodis等利用Thermoascusaurantiacus产生的木聚糖酶水解玉米获得FOs。姚惠源等利用B.subtilis木聚糖酶对小麦麸皮中阿魏酰低聚糖的制备进行研究，产物中FOs的浓度达到1.546mmol/L，盛情情等以纤维素酶水解米糠提取阿魏酰低聚糖，提取量达到28.48μmol/g；潘晓海等以纤维素酶辅助木聚糖酶制备阿魏酰低聚糖，浓度达2.127mmol/L。除了上述生物酶降解法制备FOs，也有学者采用生物酶催化合成制备FOs，Jessica等在正己烷、2-丁酮和氢氧化钠缓冲系统中，使用8％阿拉伯糖、9％木糖和11％棉子糖为基质，催化合成FOs。生物酶降解法制备FOs具有反应温和的优点，但由于禾本科植物中的阿魏酸，绝大部分存在于不溶性膳食纤维中，通过酯键与木聚糖共价交联。因此，生物酶降解法制备FOs需要先从原料中制取不溶性膳食纤维，这样做既增加生产环节，也产生大量废水，增加生产成本。
生物发酵法是一种新兴的制备方法，酶法制备FOs中所用酶制剂多通过微生物发酵，经分离纯化等工序获得。微生物生长过程是对培养基中营养成分的消耗过程，筛选发酵菌株并对发酵条件进行控制，可获得代谢产物。生物发酵法是利用菌株发酵产生淀粉酶、蛋白酶的同时亦可生成半纤维素酶，因而在其水解淀粉、蛋白质的同时可将原料中的半纤维素水解，释放FOs；同时，微生物可水解产物作为其生长所需的营养成分消耗。生物发酵法在FOs制备中的应用，使得微生物产酶与酶解过程合一，省去了酶制剂生产过程中的分离纯化工序，降低了成本，提高了产率。同时，微生物生长过程中对淀粉、蛋白质等成分的利用解决了酶解过程中水解物质的处理问题，资源得到合理利用，并减少了环境污染。
目前采用发酵法制备FOs的研究报道较少，以米糠为原料、食用真菌为发酵菌株制备FOs的研究国内外并未见。
发明内容
本发明的目的在于提供一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法。
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过70-100目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量25-75g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加10-20g葡萄糖，10-20g乳糖和10-20g蛋白胨；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种食用菌进行液态发酵，控制起始发酵pH3.8-4.3，发酵温度23-28℃，摇床转速80-120r/min，发酵6-10天，制得阿魏酰低聚糖。
所述食用菌为榆黄蘑。
所述食用菌的接种量为40-100亿cfu/L培养基。
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，
(1)米糠经烘干或自然风干后，粉碎过70-90目筛子筛分后，制成固体培养基；
(2)接种食用菌发酵进行固体发酵90-120天，制得阿魏酰低聚糖。
所述食用菌为榆黄蘑。
所述食用菌的接种量为80-180亿cfu/Kg培养基。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用发酵的方法制备阿魏酰低聚糖，使得微生物产酶与酶解过程合一，省去了酶制剂生产过程中的分离纯化工序，降低了成本，提高了产率。同时，微生物生长过程中对淀粉、蛋白质等成分的利用解决了酶解过程中水解物质的处理问题，资源得到合理利用，并减少了环境污染。本发明的方法简单易行，制备的阿魏酰低聚糖产率高，易于纯化。
附图说明
图1是榆黄蘑发酵米糠过程中阿魏酰低聚糖含量变化。
图2是FOs和阿魏酸对·OH的清除能力。
图3是FOs和阿魏酸对DPPH·的清除能力。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1榆黄蘑发酵米糠制备阿魏酰低聚糖
母种培养基(PDA)：200g的马铃薯，洗净去皮，加水1000ml煮沸30min,纱布过滤，再加15g葡萄糖，充分溶解后分装三角瓶，121℃灭菌20min，取出冷却备用。
米糠将进行烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分。
发酵培养基：50g米糠加水1L、15g葡萄糖、15g乳糖、15g蛋白胨、1gKH2PO、1gMgSO4·7H2O、0.1gVB1。
母种培养：向装液量为50mL/250mL三角瓶中，分别接种榆黄蘑的1g母种菌块，在25℃，摇床转速100r/min条件下培养6d。
向装液量为60mL/250mL三角瓶中，种接种量11％(或40-100亿cfu/L培养基)，在25℃，摇床转速100r/min下培养6d。
酶液制备：在米糠发酵的第2、4、6、8、10天时取出发酵液，在高速冷冻离心机中，0-4℃下，10000r/min条件下离心15min，上清液即为粗酶液。
榆黄蘑发酵产生酶的酶活测定：
(1)淀粉酶活性测定：参照GB/T 5521—2008测定方法。酶活定义：以1mL酶液在1min、50℃水解可溶性淀粉产生1mol葡萄糖定义为一个酶活单位，U/mL。(2)蛋白酶活性测定：参照GB/T 23527—2009测定方法。酶活定义：1ml酶液在40℃、中性条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为1各酶活力单位，
(3)纤维素酶活性测定：采用DNS比色法测定纤维素酶活性。酶活定义：1mL酶液在1min、50℃水解滤纸产生1mol葡萄糖定义为一个酶活单位，U/mL。
(4)木聚糖酶活性测定：参考GB/T 23874-2009测定方法。酶活定义：37℃下，pH5.5，1min、从浓度为5mg/mL木聚糖溶液中生成1μmol的还原糖所需的酶量为一个酶活单位，U/mL。
9.淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的活性都是发酵到第6天时酶活力达到最大，木聚糖酶随着发酵时间的延长活性逐渐增强，发酵到第8天时活性最高。
表1榆黄蘑发酵米糠过程中的酶活性变化
在米糠处理液中发酵时，榆黄蘑发酵可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶，FOs产量发酵时间延长提高，当发酵到第8天产量最高，之后开始减少，如图1所示。
阿魏酰低聚糖高效清除羟自由基和DPPH自由试验
羟自由基清除方法测定：采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8.8mmo1/L H202 0.5mL，9mmo1/L Fe2+0.5mL，9mmo1/L水杨酸-乙醇溶液0.5mL)中加入一系列不同浓度的阿魏酰低聚糖溶液2mL，并以蒸馏水作为对照，与试剂空白液比较，在510nm处测定吸光度，按下面计算清除率，阿魏酸用作参考物质。式中：A0是空白对照液的吸光度；A是加入样品液的吸光度。
DPPH自由基清除方法测定：将阿魏酸低聚糖样品配成不同浓度的溶液备用，同时用95％的乙醇配制2×10-4mol/L的DPPH·溶液，避光保存备用。分别取2mL不同浓度的试样于试管中，加入2mL所配制的DPPH·溶液，混合均匀，30min后倒入比色皿中在517nm处测定其吸光度值A2，同时测2mL样品液+2mL乙醇的吸光度值A1，以及2mL DPPH·溶液2mL水的吸光度值A0，阿魏酸作参考物质
在较高浓度(≥4mg/mL)时，FOs对·OH和DPPH·的具有高效的清除能力，当浓度达到10mg/mL时，FOs对·OH和DPPH·的清除率达到98.47％和98.30(如图2和3所示)。FOs具有明显的自由基清除能力，是一种很有潜力的天然抗氧化剂，用作保健食品将会有着良好的应用前景。
实施例2榆黄蘑发酵固体米糠制备阿魏酰低聚糖
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，
(1)米糠经烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分后，制成固体培养基；
(2)接种榆黄蘑发酵进行固体发酵90-120天，制得阿魏酰低聚糖；所述食用菌的接种量为80-180亿cfu/Kg培养基。
实施例3榆黄蘑发酵米糠制备阿魏酰低聚糖
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量65g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加15g葡萄糖，8g纳米青金石粉末，15g乳糖和15g蛋白胨；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种榆黄蘑进行液态发酵，控制起始发酵pH4，发酵温度25℃，摇床转速100r/min，发酵8天，制得阿魏酰低聚糖；所述榆黄蘑的接种量为60亿cfu/L培养基。
本实施例由于加入了纳米青金石粉末，与实施例1相比，效果更好，产率提高5％。
实施例4榆黄蘑发酵米糠制备阿魏酰低聚糖
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量65g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加15g葡萄糖，8g马唐干粉末，15g乳糖和15g蛋白胨；所述马唐干粉末为新鲜马唐叶片烘干，磨成粉末，过80目筛制成；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种榆黄蘑进行液态发酵，控制起始发酵pH4，发酵温度25℃，摇床转速100r/min，发酵8天，制得阿魏酰低聚糖；所述榆黄蘑的接种量为60亿cfu/L培养基。
本实施例由于加入了马唐干粉末，与实施例1相比，效果更好，产率提高6％。
对比例1松乳菇发酵米糠制备阿魏酰低聚糖
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量65g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加15g葡萄糖，15g乳糖和15g蛋白胨；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种松乳菇进行液态发酵，控制起始发酵pH4，发酵温度25℃，摇床转速100r/min，发酵8天，制得阿魏酰低聚糖；所述松乳菇的接种量为60亿cfu/L培养基。
本实施例与实施例1相比，效果差，产率降低85％。
对比例2松乳菇发酵米糠制备阿魏酰低聚糖
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量65g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加15g葡萄糖，15g乳糖和15g蛋白胨；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种堇紫珊瑚菌进行液态发酵，控制起始发酵pH4，发酵温度25℃，摇床转速100r/min，发酵8天，制得阿魏酰低聚糖；所述堇紫珊瑚菌的接种量为60亿cfu/L培养基。
本实施例与实施例1相比，效果差，产率降低85％。
对比例3松乳菇发酵米糠制备阿魏酰低聚糖
一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过80目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量65g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加15g葡萄糖，15g乳糖和15g蛋白胨；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种马勃进行液态发酵，控制起始发酵pH4，发酵温度25℃，摇床转速100r/min，发酵8天，制得阿魏酰低聚糖；所述马勃的接种量为60亿cfu/L培养基。
本实施例与实施例1相比，效果差，产率降低87％。
发明人做了大量实验，发现只有榆黄蘑发酵效果好，其他真菌发酵效果很差，不能形成生产能力。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)制备米糠液：将米糠进行烘干或自然风干后，粉碎过70-100目筛子筛分，加入水中搅拌，制成固含量25-75g/L的米糠液；
(2)配置培养基：向1L米糠液中添加10-20g葡萄糖，10-20g乳糖和10-20g蛋白胨；
(3)发酵制备：利用步骤(2)制备的培养基接种食用菌进行液态发酵，控制起始发酵pH3.8-4.3，发酵温度23-28℃，摇床转速80-120r/min，发酵6-10天，制得阿魏酰低聚糖。
2.根据权利要求1所述的米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌为榆黄蘑。
3.根据权利要求1所述的米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌的接种量为40-100亿cfu/L培养基。
4.一种米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)米糠经烘干或自然风干后，粉碎过70-90目筛子筛分后，制成固体培养基；
(2)接种食用菌发酵进行固体发酵90-120天，制得阿魏酰低聚糖。
5.根据权利要求4所述的米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌为榆黄蘑。
6.根据权利要求4所述的米糠发酵制备阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，所述食用菌的接种量为80-180亿cfu/Kg培养基。
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