CN112913572A - 用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物 - Google Patents

用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物 Download PDF

Info

Publication number
CN112913572A
CN112913572A CN201911238260.1A CN201911238260A CN112913572A CN 112913572 A CN112913572 A CN 112913572A CN 201911238260 A CN201911238260 A CN 201911238260A CN 112913572 A CN112913572 A CN 112913572A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cordyceps militaris
culturing
culture
ginkgo
link
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911238260.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112913572B (zh
Inventor
陈衫润
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Zhongrun Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hongrun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hongrun Biotechnology Co ltd filed Critical Hongrun Biotechnology Co ltd
Priority to CN201911238260.1A priority Critical patent/CN112913572B/zh
Publication of CN112913572A publication Critical patent/CN112913572A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112913572B publication Critical patent/CN112913572B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/20—Culture media, e.g. compost
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/066—Clavicipitaceae
    • A61K36/068—Cordyceps

Abstract

一种用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物。所述用于培养蛹虫草菌的方法包括将一蛹虫草菌菌株培养于一包含有银杏种仁的培养基中。所述培养产物是通过所述用于培养蛹虫草菌的方法制得，所述药学组成物包含所述培养产物。使用含有银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的固态培养能有效地提升蛹虫草菌子实体的生长速度以及所具有的虫草素、总糖以及总酚类化合物的含量。

Description

用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物
技术领域
本发明是有关于一种用于培养蛹虫草菌(Cordyceps militaris)的方法，其包括：将一蛹虫草菌菌株培养于一包含有银杏种仁(Ginkgo biloba kernels)的培养基中。
背景技术
蛹虫草菌(拉丁学名：Cordyceps militaris；中文别名：蛹草、蛹虫草、北冬虫夏草、北虫草以及蚕蛹虫草)属于子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)，主要分布于北温带地区，常见于中国东北地区大兴安岭以及长白山一带。它是一种虫生病原性真菌(entomopathogenic fungus)，广泛寄生于鳞翅目(Lepidoptera)昆虫、鞘翅目(Coleoptera)昆虫以及膜翅目(Hymenoptera)昆虫的幼虫(larvae)与蛹(pupae)，其子实体(fruit body)单生或数个，从宿主头部或节部长出，呈橙黄色，高约2至5cm，头部呈棒形，长约1至2cm，粗约0.3至0.5cm。
蛹虫草菌已被使用作为传统中草药(Chinese herbal medicine,CHM)，其主要利用部位为子实体。近年来，自蛹虫草菌所分离出的活性成分[诸如，甘露醇(mannitol)(又称虫草酸)、腺苷(adenosine)、虫草素(cordycepin)以及多糖体(polysaccharide)等]已被证实具有各种不同的生物活性。例如，有许多报导指出，甘露醇具有抗氧化(anti-oxidation)活性，多糖体具有抗癌、抗发炎(anti-inflammation)、增强免疫功能(immune function)、降血糖(hypoglycemic)、降血脂(hypolipidemic)的活性以及降低胆固醇的能力(abilityto lower cholesterol)，而虫草素则具有抗肿瘤以及抗真菌(anti-fungi)的活性。
为了大量生产蛹虫草菌，目前已发展出许多人工培养方法，将蛹虫草菌接种至柞蚕(Antheraea pernyi)、家蚕(Bombyx mori)或蓖麻蚕(Samia cynthia subsp.ricini)等昆虫的活虫蛹内。然而，此方法需要具备适合的寄主昆虫并在一固定温度与湿度的培养环境下进行培养，所需技术与成本较高，因而无法被广泛地应用。为了降低成本，近年来已有研究改采含有颗粒状谷物(例如，稻米、小麦、大麦、玉米、大豆或农业废弃物等)的固态培养基来进行培养，然而，所培养出的蛹虫草菌子实体中含有的活性成分含量较低(都兴范等人，2003，辽宁农业科学，(4)26-28)。因此，发展出新的蛹虫草菌培养技术以提高子实体的产量与活性成分的含量即成为一个极为重要的研发课题。
为了提升人工培养所得的蛹虫草菌中活性成分的含量，已有许多研究是利用添加有中草药的培养基来培养蛹虫草菌。例如，CN103981105 B中揭示一种蛹虫草生长培养基，其包括高粱粉24-26重量份、银杏叶粉4-6重量份、蛋白胨0.04-0.06重量份、甘露糖0.04-0.08重量份、磷酸二氢钾0.02-0.04重量份、葡萄糖0.04-0.06重量份、硫酸镁0.02-0.03重量份、维生素B1 0.0005-0.001重量份，以及水30-40重量份。在此篇中国专利案的实施例中，使用此培养基所得的蛹虫草菌子实体被证实含有18％-25％的虫草酸。
CN 102246960 B揭示一种虫草银杏功能性食品及其制备方法与用途。该虫草银杏功能性食品是通过下列方法而被制得：将银杏种仁(又称为银杏果或白果)去壳后研磨成浆，添加1至5倍的水，继而煮沸以使其糊化(gelatinization)。之后，依序添加0.2-5.0％(w/v)的淀粉酶(amylase)、0.1-4.0％(w/v)的淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)以及0.2-3.0％(w/v)的蛋白酶(protease)来分别进行三阶段的水解处理，而得到一银杏种仁水解液。接着，将虫草菌种接种至该银杏种仁水解液中进行培养历时5至10天来予以活化，接着再次接种至银杏种仁水解液中进行培养历时3至8天，而得到虫草菌的接种源。然后将该虫草菌接种源以3-10％(v/v)的接种量接种至该银杏种仁水解液并予以培养历时3至10天，而得到一虫草银杏发酵液。之后，将该虫草银杏发酵液进行浓缩干燥与磨碎处理，而得到该虫草银杏功能性食品。在此篇中国专利案的实施例中，该虫草银杏功能性食品经成分分析而被显示除了含有虫草菌的活性成分——类黄酮(flavonoids)、虫草酸、虫草素与萜类化合物(terpenoids)——以外，还含有银杏的活性成分——银杏酸(ginkgolic acid)与银杏内酯(bilobalide)。该虫草银杏功能性食品进一步经动物实验以及抗氧化能力测定而被证实具有降血压以及抗氧化的效用。
虽然已存在有上述文献报导，本领域中仍然存在有一需要去发展出可以提升蛹虫草菌子实体产量以及活性成分含量的培养方法以供产业界所需。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种用于培养蛹虫草菌的方法，其包括：将一蛹虫草菌菌株培养于一包含有银杏种仁的培养基中。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中所述银杏种仁未经水解处理。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中以所述培养基的总重量为计算基础，所述银杏种仁具有一范围落在1至100％(w/w)的含量。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中所述培养基进一步包含有一选自于下列群组中的天然物质：白米、糙米、黑米、糯米、大豆、黑豆、红豆、绿豆、小麦、大麦、黑麦、荞麦、燕麦、玉米、薏仁、山药、马铃薯、甘藷、树薯、芋头、葛郁金、莲、蘑芋、食用美人蕉、菊芋、高粱、蚕蛹、麸皮、米糠以及它们的组合。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中所述天然物质为糙米。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中以所述培养基的总重量为计算基础，所述天然物质具有一范围落在大于0至99％(w/w)的含量。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中所述培养基进一步包含有一选自于下列群组中的碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、木糖醇、菊糖、海藻糖、果胶、淀粉以及它们的组合。
本发明用于培养蛹虫草菌的方法，其中所述培养基进一步包含有一选自于下列群组中的氮源：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白胨、酵母提取物、酵母粉、牛肉提取物、脱脂牛奶、聚蛋白胨、胰化蛋白胨、玉米浸液、谷氨酸钠以及它们的组合。
在第二个方面，本发明提供一种培养产物，它是通过一如上所述的用于培养蛹虫草菌的方法而被制得。
在第三个方面，本发明提供一种药学组成物，它包含有一如上所述的培养产物，以及选择性地一药学上可接受的载剂。。
本发明的药学组成物，其中所述培养产物进一步被进行一水提取处理，而得到一经水提取的产物。
本发明的有益效果在于：使用含有银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的固态培养能有效地提升蛹虫草菌子实体的生长速度以及所具有的虫草素、总糖以及总酚类化合物的含量。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：
图1显示使用具有不同的银杏种仁含量的培养基来进行固态培养所得到的蛹虫草菌子实体中的虫草素含量，其中“＊”表示：当与对照组作比较，p＜0.05；
图2显示使用具有不同的银杏种仁含量的培养基来进行固态培养所得到的蛹虫草菌子实体中的总糖含量，其中“＊”表示：当与对照组作比较，p＜0.05；以及
图3显示使用具有不同的银杏种仁含量的培养基来进行固态培养所得到的蛹虫草菌子实体中的总酚类化合物含量，其中“＊”表示：当与对照组作比较，p＜0.05；
图4显示使用含有银杏种仁的培养基以及银杏种仁水解液来进行培养所得到的蛹虫草菌菌丝体中的总酚类化合物含量，其中“＊”表示：当与水解对照组作比较，p＜0.05；以及
图5显示使用含有银杏种仁的培养基以及银杏种仁水解液来进行培养所得到的蛹虫草菌菌丝体中的总类黄酮含量，其中“＊”表示：当与水解对照组作比较，p＜0.05。
具体实施方式
为了清楚地说明本发明的目的，将被了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一熟悉本领域者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
为了提升蛹虫草菌子实体(fruit body of Cordyceps militaris)的产量以及其中所具有的活性成分的含量，申请人经研究发现，使用含有银杏种仁(Ginkgo bilobakernels)的培养基来进行蛹虫草菌的固态培养(solid culture)能有效地提升蛹虫草菌子实体的生长速度以及所具有的虫草素(cordycepin)、总糖(total carbohydrates)以及总酚类化合物(total phenolic compounds)的含量。
于是，本发明提供一种用于培养蛹虫草菌的方法，其包括：将一蛹虫草菌菌株培养于一包含有银杏种仁的培养基中。
如本文中所用的，术语“培育(cultivation)”以及“培养(culturing)”可被交换地使用。
有关培养蛹虫草菌的操作过程与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考中国台湾宜兰大学生物技术与动物科学系的杨淳翔所著硕士论文[名称：“光线对北虫草二次代谢物及wc-1基因表现之影响(Effectsof light on the secondary metabolite and wc-1 gene expression in Cordycepsmilitaris)”]。
如本文中所用的，术语“银杏种仁(Ginkgo biloba kernels)”、“银杏果(ginkgofruit)”以及“白果(ginkgo nut)”可被交换地使用，并且意指银杏种子(seed)经去除肉质种皮(sarcotesta)与硬质种皮(sclerotesta)后的部分。
依据本发明，该银杏种仁未经水解处理(hydrolysis treatment)。所述水解包括酸-碱催化水解(acid-base-catalyzed hydrolysis)以及酶水解(enzymatichydrolysis)。所述酶水解所使用的酶包括，但不限于：纤维素酶(cellulase)、木聚糖酶(xylanase)、木质素酶(ligninase)、淀粉酶(amylase)、淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)、蛋白酶(protease)、脂酶(lipase)以及葡萄糖醛酸糖苷酶(glucuronidase)。
依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该银杏种仁具有一范围落在1至100％(w/w)的含量。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基中含有约87.5％(w/w)的银杏种仁。在本发明的另一个较佳具体例中，该培养基中含有约70.0％(w/w)的银杏种仁。在本发明的又一个较佳具体例中，该培养基中含有约43.8％(w/w)的银杏种仁。
依据本发明，该培养基进一步包含有一选自于下列群组中的天然物质：白米(milled rice)、糙米(brown rice)、黑米(black rice)、糯米(waxy rice)、大豆(soybean)、黑豆(black bean)、红豆(red bean)、绿豆(green bean)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黑麦(rye)、荞麦(buckwheat)、燕麦(oat)、玉米(corn)、薏仁(Job’s tears)、山药(yam)、马铃薯(potato)、甘薯(sweet potato)、树薯(cassava)、芋头(taro)、葛郁金(arrowroot)、莲(lotus plants)、蘑芋(elephant foot yam)、食用美人蕉(ediblecanna)、菊芋(Canada potato)、高粱(sorghum)、蚕蛹(silkworm chrysalis)、麸皮(wheatbran)、米糠(rice bran)以及它们的组合。较佳地，该培养基进一步包含有糙米。
依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该天然物质具有一范围落在大于0至99％(w/w)的含量。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基中含有约18.8％(w/w)的糙米。在本发明的另一个较佳具体例中，该培养基中含有约7.5％(w/w)的糙米。
依据本发明，该培养基进一步包含有一选自于下列群组中的碳源：葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麦芽糖(maltose)、果糖(fructose)、糖蜜(molasses)、半乳糖(galactose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)、木糖醇(xylitol)、菊糖(inulin)、海藻糖(trehalose)、果胶(pectin)、淀粉(starch)以及它们的组合。较佳地，该培养基进一步包含有葡萄糖。
依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该碳源具有一范围落在0.1至5％(w/w)的含量。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基含有约0.88％(w/w)的葡萄糖。
依据本发明，该培养基进一步包含有一选自于下列群组中的氮源：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、尿素(urea)、蛋白胨(peptone)、酵母提取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、大豆蛋白胨(soy peptone)、牛肉提取物(beef extract)、脱脂牛奶(skim milk)、聚蛋白胨(polypeptone)、胰化蛋白胨(tryptone)、玉米浸液(corn steep liquor)、谷氨酸钠(monosodium glutamate)以及它们的组合。较佳地，该培养基进一步包含有蛋白胨以及酵母提取物。
依据本发明，以该培养基的总重量为计算基础，该氮源具有一范围落在0.1至5％(w/w)的含量。在本发明的一个较佳具体例中，该培养基含有约0.44％(w/w)的蛋白胨以及约0.44％(w/w)的酵母提取物。
本发明亦提供一种培养产物，它是通过一如上所述的方法而被制得。
该培养产物除了如上所述被证明具有经提升的活性成分，该培养产物进一步被进行一水提取处理所得到的经水提取的产物通过α,α-二苯-β-苦味基肼基(DPPH)自由基清除能力[α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging ability]的分析而被证实具有抗氧化活性(antioxidation activity)，并且经由活体外试验而被证实可以有效地抑制酪胺酸酶活性(inhibition of tyrosinase activity)。
因此，本发明亦提供一种药学组成物，其包含有一如上所述的培养产物，以及选择性地一药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。
较佳地，该培养产物进一步被进行一水提取处理，而得到一经水提取的产物。
依据本发明，水提取处理的方法可以采用熟习本领域者所详知且惯用的技术来进行。在此方面，可以参照，例如，中国台湾宜兰大学生物技术与动物科学系的杨淳翔所著硕士论文(同上述)。
可了解到的是，有关提取方法的操作条件会进一步随着所使用的蛹虫草菌的处理方式以及水与蛹虫草菌的用量比例等因素而被变动，以便达致最佳的提取效果。而这些操作条件的选择是熟习本领域者能例行性地自行决定的。
依据本发明的药学组成物可利用熟习本领域者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道的(parenteral)、口服的(oral)或局部的(topical)投药的剂型(dosageform)，这包括，但不限于，注射品(injection)[例如，无菌的水溶液或分散体(dispersion)]、无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)以及类似物。
依据本发明，该药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例仅是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.在下面的实施例中所使用的马铃薯右旋糖肉汤培养基(potato dextrosebroth medium,PDB)是购自于Laboratorios CONDA。
2.在下面的实施例中所使用的马铃薯右旋糖琼脂培养板(potato dextrose agarplate,PDA)是通过对PDB培养基添加以1.5％的琼脂(agar)(NEOGEN,USA)而被制得。
一般实验方法：
1.统计学分析：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据是以“平均值(mean)±平均值的标准误差(standard error of the mean,SEM)”来表示。所有的数据是通过史徒登氏t-试验(Student’s t-test)来作分析，俾以评估各组之间的差异性。若所得到的统计分析结果是p＜0.05，表示有统计学显著性(statistical significance)。
实施例1.使用含有银杏种仁(Ginkgo biloba kernels)的培养基来进行蛹虫草菌(Cordyceps militaris)的固态培养(solid culture)
A、制备蛹虫草菌菌株的接种源(inoculum)：
在本实施例中所使用的蛹虫草菌菌株BCRC 34380是购自于中国台湾的财团法人食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)。
首先，将蛹虫草菌菌株BCRC 34380接种至一PDA培养板中，并于一恒温振荡培养箱(22℃)内进行培养历时15-20天。接着，将该PDA培养板中所形成的蛹虫草菌菌丝体(mycelium of Cordyceps militaris)切块，加入至100mL的PDB培养基中，继而于25℃下以一均质机(厂牌
Figure BDA0002305470530000092
型号Simple Blend 100)来进行均质处理。之后，将所得到的均质物(homogenate)以一为10至15mL的体积接种至一含有150mL PDB培养基的培养瓶中，继而于一恒温振荡培养箱(22℃、150rpm)内进行振荡培养历时5至7天，所形成的培养物被拿来作为蛹虫草菌菌株的接种源。
B、蛹虫草菌的固态培养：
首先，将在上面第A项当中所得到的蛹虫草菌的接种源分成5组，其中包括5个实验组(亦即实验组1至4)以及1个对照组。接着，将各组的接种源以一为5至10mL的体积分别接种至具有下面表1所示的配方的培养基中，继而于一恒温培养箱(25℃)进行避光培养历时7至10天。待所形成的蛹虫草菌菌丝体完全覆盖培养瓶中的固态底物的表面后，将恒温培养箱的温度降低至20℃，继而于一光照14小时与黑暗10小时的环境下进行培养历时60天，借此诱导蛹虫草菌子实体(fruit body of Cordyceps militaris)形成。
表1.各组的培养基的配方
Figure BDA0002305470530000091
注：银杏种仁与糙米分别是购自于中国泰州市集泰农产品有限公司与中国台湾皇家谷堡实业有限公司。其中，该银杏种仁含有大约70％(w/w)的水分。
之后，申请人观察各组所形成的蛹虫草菌子实体，结果发现，实验组1至4的子实体皆可明显被观察到，其中又以实验组2的蛹虫草菌子实体的数量与高度是显著地多于其他各组。相对地，对照组仅观察到菌丝体聚集而成的原基(primordia)表面有些微突起(数据未显示)。
这个实验结果显示，使用含有银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的固态培养能有效地提升蛹虫草菌子实体的生长速度。
实施例2.本发明的蛹虫草菌子实体的成分分析
A、制备蛹虫草菌子实体的经水提取的产物：
首先，收取在上面实施例1中所得到的各实验组的蛹虫草菌子实体，于烘箱中予以干燥历时24至48小时，继而进行研磨处理以得到蛹虫草菌子实体粉末。将各组的蛹虫草菌子实体粉末分别与二次水(ddH2O)以一重量比为1:10的比例予以混合，继而于一灭菌釜(autoclave)内以121℃以及1.2大气压力下进行高温高压提取历时30分钟。之后，在100℃下使用一超声波振荡器(厂牌DELTA，型号DC-300H)并以一为40kHz的频率予以振荡处理历时30分钟。以滤纸将所得到的粗提取物予以过滤后，收集滤液并于烘箱中予以干燥，借此而得到呈粉末状的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物。
之后，秤取10mg的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物并添加至1mL的二次水中，继而于100℃下使用一超声波振荡器并以一为40KHz的频率来对所得到的混合物进行振荡处理历时30分钟。接着，于25℃下以5,000rpm来进行离心历时10分钟，继而收取上清液并以一孔径为0.22μm的滤纸予以过滤，借此而得浓度约为10mg/mL的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物的待测溶液，以供用于下面的实验。
此外，为供比较，对照组培养基表面所形成的蛹虫草菌菌丝体与原基被收集并依照上面的步骤而被制备成待测溶液，继而被拿来进行相同的实验。
B、虫草素(cordycepin)含量的测定：
为了解本发明的蛹虫草菌子实体中的虫草素含量，依据上面第A项所得到的各组的待测溶液被拿来进行高效能液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。
本实验所使用的HPLC分析仪器如下：HITACHI CM5000系列液相层析系统(厂牌HITACHI，型号CM5000)以及PrimaideTM UV侦测器(厂牌HITACHI，型号1410UV)。HPLC的各项操作参数与条件被显示于下面的表2中。
表2.HPLC的操作参数与条件
Figure BDA0002305470530000111
为供比对，将适量的虫草素(购自于Sigma-Aldrich)溶于15％(v/v)的甲醇水溶液中而制备成一系列不同浓度的虫草素溶液(15.6-250.0μg/mL)来作为校正标准品，并进行相同的HPLC分析。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示于图1中。
从图1可见，实验组1至4的蛹虫草菌子实体中的虫草素含量皆显著地高于对照组，并且虫草素含量会随着培养基的银杏种仁含量增加而提升。这个实验结果显示，使用含有银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的固态培养能有效地提升培养所得的蛹虫草菌子实体内的虫草素含量。
另外，申请人将上面实施例1中的对照组在培养60天后所形成的原基拿来持续进行培养。结果发现，还需额外培养历时10至20天后才能形成完整的蛹虫草菌子实体。之后，该蛹虫草菌子实体被拿来进行上面第A项与第B项当中所述的提取与分析，而分析结果显示，该蛹虫草菌子实体中的虫草素含量仅有837.76(μg/g)，仍低于实验组1[亦即976.86(μg/g)]。
C、总糖(total carbohydrates)含量的测定：
为了解本发明的蛹虫草菌子实体中的总糖含量，申请人使用酚-硫酸法(phenol-sulfuric method)来对依据上面第A项所得到的对照组以及实验组1至3的待测溶液进行总糖含量的测定。
首先，取1mL的待测溶液，继而添加以1mL的5％酚溶液(phenol solution)以及5mL的浓硫酸并予以混合均匀，然后在室温、避光环境下予以静置反应历时30分钟。最后，于490nm的波长下以分光光度计(spectrophotometer)(MACY，型号V-1100)来读取所形成的反应混合物的吸光值(OD490)。由此所测得的OD490数值接着根据预先以具有不同已知浓度(0、0.0625、0.125、0.25以及0.4mg/mL)的葡萄糖标准品相对于它们自身的OD490数值所作出的相关曲线(correlation curve)而被换算成总糖浓度(mg/mL)，再除以该待测溶液的浓度而被换算成每克蛹虫草菌子实体的经水提取的产物中的总糖含量(mg/g)。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示于图2中。
从图2可见，实验组1至3的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物中的总糖含量皆显著地高于对照组，并且总糖含量会随着培养基的银杏种仁含量增加而提升。这个实验结果显示，使用含有银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的固态培养能有效地提升培养所得的蛹虫草菌子实体内的总糖含量。
D、总酚类化合物(total phenolic compounds)含量的测定：
为了解本发明的蛹虫草菌子实体中的总酚类化合物含量，依据上面第A项所得到的对照组以及实验组1和2的待测溶液被拿来进行总酚类化合物含量的测定。
首先，取0.1mL的待测溶液，继而添加以0.1mL的2N弗林-希尔卡脱试剂(Folin-Ciocalteu reagent)(购自于Merck)以及2.5mL的去离子水(deionized water)并予以充分混合均匀。接着，加入0.5mL的20％碳酸钠水溶液(sodium carbonate solution)以及适量的去离子水而得到一总体积为10mL的混合物，然后于室温下进行避光作用历时20分钟。之后，对该混合物取出1mL并于735nm的波长下以分光光度计来量测吸光值(OD735)。由此所测得的OD735数值接着根据预先以具有不同已知浓度(0.1、0.2、0.4、0.6以及1.0mg/mL)的没食子酸溶液(配于70％甲醇溶液)相对于它们自身的OD735数值所作出的相关曲线(correlation curve)而被换算成总酚类化合物浓度(mg/mL)，再除以该待测溶液的浓度而被换算成每公克蛹虫草菌子实体的经水提取的产物中的总酚类化合物含量(mg/g)。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示于图3中。
从图3可见，实验组1与实验组2的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物中的总酚类化合物含量皆高于对照组所具者。特别地，实验组2的总酚类化合物含量约为对照组所具者的2倍。这个实验结果显示，使用含有银杏种仁的培养基来培养蛹虫草菌的方法能有效地提升培养所得的蛹虫草菌子实体内的总酚类化合物含量。
实施例3.本发明用于培养蛹虫草菌的方法与现有方法的效用比较
为了了解本发明用于培养蛹虫草菌的方法相较现有技术所揭示者在提升蛹虫草菌的活性成分[包括酚类化合物以及类黄酮(flavonoids)]上是否具有更优异的功效，申请人参照CN 102246960B当中所述方法来制备银杏种仁水解液，并将之拿来与本发明所使用的未经水解的银杏种仁培养基进行比较。
A、蛹虫草菌菌丝体的固态与液态培养：
首先，有关银杏种仁水解液的制备是参照CN 102246960B当中的实施例1当中所述的方法来进行。之后，将在上面实施例1中所得到的蛹虫草菌的接种源分成2组，其中包括1个实验组以及1个水解对照组。接着，将实验组的接种源以一为10mL的体积接种至如上面表1当中的实验组4所述的培养基中，水解对照组的接种源则以一为10mL的体积接种至100mL的银杏种仁水解液中，并继而将各组置于一恒温培养箱(25℃)进行避光培养历时10天，而得到各组的蛹虫草菌菌丝体。
B、制备蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物：
首先，收集在上面第A项中所得到的各组的蛹虫草菌菌丝体，于烘箱中予以干燥历时24至48小时，继而进行研磨处理以得到蛹虫草菌菌丝体粉末。将10g的各组的蛹虫草菌菌丝体分别与10倍体积的RO水混合，继而于一灭菌釜(autoclave)内以121℃以及1.2大气压力下进行高温高压提取历时30分钟。之后，在100℃下使用超声波振荡器并以一为40kHz的频率予以振荡处理历时30分钟。以滤纸将所得到的粗提取物予以过滤后，收集滤液并于烘箱中予以干燥，借此而得到蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物。
之后，秤取10mg的蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物并添加至1mL的RO水中，继而于100℃下使用超声波振荡器并以一为40KHz的频率来对所得到的混合物进行振荡处理历时30分钟。接着，于25℃下以5,000rpm来进行离心历时10分钟，继而收取上清液并以一孔径为0.22μm的滤纸予以过滤，借此而得浓度约为10mg/mL的蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物的待测溶液，以供用于下面的成分分析。
C、总酚类化合物含量的测定：
有关各组的蛹虫草菌菌丝体中的总酚类化合物含量是依据上面实施例2第D项当中所述的方法来进行测定。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示于图4中。
从图4可见，实验组的蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物中的总酚类化合物含量显著地高于水解对照组所具者。这个实验结果显示，使用含有未经水解的银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的培养在提升培养所得的蛹虫草菌中的总酚类化合物含量上的功效是优于使用银杏种仁水解液所具者。
D、总类黄酮含量的测定：
有关各组的蛹虫草菌菌丝体中的总类黄酮含量大体上是参照M.Nagy and D.
Figure BDA0002305470530000141
(1996),Pharmazie,51:100-101当中所述的方法来进行。简言之，对依据上面第B项所得到的待测溶液各取0.5mL，并添加1.5mL的95％乙醇以及2.8mL的去离子水。之后，加入100μL的10g/mL AlCl3.6H2O以及0.1mL的1M醋酸钾(potassium acetate)并予以充分混合均匀，接着静置历时40分钟。之后，于415nm的波长下以分光光度计来量测吸光值(OD415)。由此所测得的OD415数值接着根据预先以具有不同已知浓度(0、12.5、25、50以及100μg/mL)的槲皮素(quercetin)相对于它们自身的OD415数值所作出的相关曲线(correlation curve)而被换算成总类黄酮浓度(μg/mL)，再除以该待测溶液的浓度而被换算成每公克蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物中的总类黄酮含量(μg/mL)。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示于图5中。
从图5可见，实验组的蛹虫草菌菌丝体的经水提取的产物中的总类黄酮含量显著地高于水解对照组所具者。这个实验结果显示，使用含有未经水解的银杏种仁的培养基来进行蛹虫草菌的培养在提升培养所得的蛹虫草菌中的总类黄酮含量上的功效是优于使用银杏种仁水解液所具者。
综合以上实验结果可知，无论是蛹虫草菌的菌丝体或子实体，使用含有银杏种仁的培养基来进行培养的方法皆能有效地提升活性成分的含量，并且此效用是显著优于先前技术所揭示的使用银杏种仁水解液的方法。换言之，对银杏种仁进行水解反而会对此效用造成负面影响。
实施例4.本发明的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物在抗氧化效力(antioxidant efficacy)上的评估
为了了解本发明的蛹虫草菌子实体是否具有抗氧化能力，申请人将在上面实施例2所得到的实验组2的待测溶液拿来进一步进行α,α-二苯-β-苦味基肼基(DPPH)自由基清除能力[α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging ability]的分析。
实验方法：
首先，取0.1mL的实验组2的待测溶液，继而添加以0.9mL的含有1mM DPPH的甲醇溶液并予以充分混合均匀，所形成的混合物被置于室温下进行避光作用历时30分钟。之后，取出所形成的混合物，并于517nm的波长下以分光光度计来量测吸光值(OD517)。另外，以0.1mL的纯水作为空白对照组并进行相同的实验。若所测得的吸光值(OD517)越低，代表清除DPPH自由基的能力越佳。
DPPH自由基清除率(radical scavenging rate)(％)是通过将所测得的吸光值(OD517)代入下列公式(I)而被计算出：
A＝[1－(B/C)]×100 (I)
其中：A＝DPPH自由基清除率(％)
B＝实验组2所测得的OD517吸光值
C＝空白对照组所测得的OD517吸光值
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
实验结果显示，实验组2的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物具有一为63.78％的自由基清除率，这表示：本发明的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物具有抗氧化能力。
实施例5.本发明的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物在抑制黑色素生成(inhibition of melanogenesis)上的效用评估
为了了解本发明的蛹虫草菌子实体在抑制黑色素生成上的效用，申请人将在上面实施例2所得到的实验组2的待测溶液拿来进行抑制酪胺酸酶活性(inhibition oftyrosinase activity)的测试。
首先，将0.68g的磷酸二氢钾(monopotassium phosphate)溶于适量的纯水中，继而使用氢氧化钾来将pH值调整为6.5，接着使用纯水来将总体积调整至100mL，借此而得到一pH值为6.5的50mM磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution)。接着，将适量的酪胺酸(L-tyrosine)(购自于ACROS Organics)配于该磷酸盐缓冲溶液中，而得到一浓度为1mg/mL的酪胺酸溶液备用。
之后，使用该磷酸盐缓冲溶液来将实验组2的待测溶液的浓度稀释为0.5mg/mL，接着取出1mL，添加以500μL的酪胺酸酶(42.96U/mL)(购自于Sigma-Aldrich)以及460μL的酪胺酸溶液并予以混合均匀，所形成的混合物被置于37℃下进行避光作用历时30分钟，然后于475nm的波长下以分光亮度计来量测吸光值(OD475)。另外，1mL的磷酸盐缓冲溶液被用来作为空白对照组并进行相同的实验。若所测得的吸光值(OD475)越低，代表抑制酪胺酸酶活性的能力越佳。
酪胺酸酶活性的抑制率(％)是通过将所测得的吸光值(OD475)代入下列公式(II)而被计算出：
D＝[1-(E/F)]×100 (II)
其中：D＝酪胺酸酶活性的抑制率(％)
E＝实验组所测得的OD475吸光值
F＝空白对照组所测得的OD475吸光值
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项「统计学分析」当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
实验结果显示，实验组2的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物具有一为53.74％的酪胺酸酶活性的抑制率，这表示：本发明的蛹虫草菌子实体的经水提取的产物具有抑制酪胺酸酶活性的能力。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此本发明意欲仅受如随文检附的权利要求所示者的限制。

Claims (11)

1.一种用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：该方法包括将一蛹虫草菌菌株培养于一包含有银杏种仁的培养基中。
2.根据权利要求1所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：该银杏种仁未经水解处理。
3.根据权利要求1所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：以该培养基的总重量为计算基础，该银杏种仁具有一范围落在1至100％(w/w)的含量。
4.根据权利要求1所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：该培养基进一步包含有一选自于下列群组中的天然物质：白米、糙米、黑米、糯米、大豆、黑豆、红豆、绿豆、小麦、大麦、黑麦、荞麦、燕麦、玉米、薏仁、山药、马铃薯、甘藷、树薯、芋头、葛郁金、莲、蘑芋、食用美人蕉、菊芋、高粱、蚕蛹、麸皮、米糠以及它们的组合。
5.根据权利要求4所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：该天然物质为糙米。
6.根据权利要求4所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：以该培养基的总重量为计算基础，该天然物质具有一范围落在大于0至99％(w/w)的含量。
7.根据权利要求1所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：该培养基进一步包含有一选自于下列群组中的碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、木糖醇、菊糖、海藻糖、果胶、淀粉以及它们的组合。
8.根据权利要求1所述的用于培养蛹虫草菌的方法，其特征在于：该培养基进一步包含有一选自于下列群组中的氮源：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白胨、酵母提取物、酵母粉、牛肉提取物、脱脂牛奶、聚蛋白胨、胰化蛋白胨、玉米浸液、谷氨酸钠以及它们的组合。
9.一种培养产物，其特征在于：它是通过一根据权利要求1至8中任一权利要求所述的用于培养蛹虫草菌的方法而被制得。
10.一种药学组成物，其特征在于：它包含有一根据权利要求9所述的培养产物，以及选择性地一药学上可接受的载剂。
11.根据权利要求10的药学组成物，其特征在于：该培养产物进一步被进行一水提取处理，而得到一经水提取的产物。
CN201911238260.1A 2019-12-06 2019-12-06 用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物 Active CN112913572B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911238260.1A CN112913572B (zh) 2019-12-06 2019-12-06 用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911238260.1A CN112913572B (zh) 2019-12-06 2019-12-06 用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112913572A true CN112913572A (zh) 2021-06-08
CN112913572B CN112913572B (zh) 2022-08-02

Family

ID=76161278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911238260.1A Active CN112913572B (zh) 2019-12-06 2019-12-06 用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112913572B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115067152A (zh) * 2022-06-28 2022-09-20 广东省科学院动物研究所 一种人工培养冬虫夏草子实体的培养基和培养方法
CN115474507A (zh) * 2022-11-07 2022-12-16 天水众安生物科技有限责任公司 一种利用小麦仁栽培虫草的培养基以及栽培虫草的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1281050A (zh) * 1999-07-15 2001-01-24 沈阳药科大学 银杏细胞培养生产银杏多糖
KR20070104293A (ko) * 2006-04-20 2007-10-25 (주) 한국은행잎 버섯 재배용 배지 및 그 제조방법
CN101554121A (zh) * 2009-05-15 2009-10-14 江苏省农业科学院 一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法
TW201200143A (en) * 2010-06-30 2012-01-01 Bio Ray Biotechnology Co Ltd A method to improve cordycepin of Solid-state cultivation
CN102337318A (zh) * 2011-07-26 2012-02-01 南京林业大学 银杏抗氧化活性肽及其制备方法
CN103981105A (zh) * 2014-05-29 2014-08-13 熊艳 一种高产虫草酸蛹虫草培养方法
CN108117430A (zh) * 2016-11-26 2018-06-05 刘启乐 一种提高虫草素含量的虫草培养基及其制备方法
CN108551973A (zh) * 2018-03-08 2018-09-21 贵州安顺金黔虫草有限公司 一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1281050A (zh) * 1999-07-15 2001-01-24 沈阳药科大学 银杏细胞培养生产银杏多糖
KR20070104293A (ko) * 2006-04-20 2007-10-25 (주) 한국은행잎 버섯 재배용 배지 및 그 제조방법
CN101554121A (zh) * 2009-05-15 2009-10-14 江苏省农业科学院 一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法
TW201200143A (en) * 2010-06-30 2012-01-01 Bio Ray Biotechnology Co Ltd A method to improve cordycepin of Solid-state cultivation
CN102337318A (zh) * 2011-07-26 2012-02-01 南京林业大学 银杏抗氧化活性肽及其制备方法
CN103981105A (zh) * 2014-05-29 2014-08-13 熊艳 一种高产虫草酸蛹虫草培养方法
CN108117430A (zh) * 2016-11-26 2018-06-05 刘启乐 一种提高虫草素含量的虫草培养基及其制备方法
CN108551973A (zh) * 2018-03-08 2018-09-21 贵州安顺金黔虫草有限公司 一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115067152A (zh) * 2022-06-28 2022-09-20 广东省科学院动物研究所 一种人工培养冬虫夏草子实体的培养基和培养方法
CN115474507A (zh) * 2022-11-07 2022-12-16 天水众安生物科技有限责任公司 一种利用小麦仁栽培虫草的培养基以及栽培虫草的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112913572B (zh) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Optimization for the production of water-soluble polysaccharide from Pleurotus citrinopileatus in submerged culture and its antitumor effect
TWI623616B (zh) 黑酵母菌、生產β－葡聚糖之培養基與方法、黑酵母菌培養物與含其組成物
KR100199920B1 (ko) 동충하초속균의 배양방법
CN103156052A (zh) 液体深层发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺
CN112913572B (zh) 用于培养蛹虫草菌的方法、培养产物及药学组成物
Choi et al. Enhancement of anti-complementary and radical scavenging activities in the submerged culture of Cordyceps sinensis by addition of citrus peel
Han et al. Solid‐state fermentation of cornmeal with the basidiomycete Ganoderma lucidum for degrading starch and upgrading nutritional value
CN112807253A (zh) 一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品
Huang et al. The quality improvement of solid-state fermentation with Cordyceps militaris by UVB irradiation
Li et al. Enhancement of diepoxin ζ production in liquid culture of endophytic fungus Berkleasmium sp. Dzf12 by polysaccharides from its host plant Dioscorea zingiberensis
CN112691125B (zh) 一种用于美白或者抗衰老的药物组合物及其制备方法、护肤品
Kim et al. Hyperglycemic effect of submerged culture extract of Ceriporia lacerata in streptozotocin-induced diabetic rats
CN107893033B (zh) 烟曲霉sqh4及在生物转化法制备花旗松素中的应用
Khondkar et al. Sugar profile of extracellular polysaccharides from different Tremella species
CN105766377B (zh) 一种提高黑木耳黄酮含量和种类的培养方法
Doğan et al. Parts from life-cycle of H. erinaceus: response surface methodology approach to optimize extraction conditions and determination of its antioxidant, antidiabetic and antimicrobial effect
CN111449239A (zh) 一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物及其制备方法
TW201825668A (zh) 生產β-葡聚糖之培養基與方法、黑酵母菌培養物與含其組成物
JP2747206B2 (ja) 高血糖改善用組成物
TWI687170B (zh) 用於培養蛹蟲草菌的方法
Wu et al. Effect of the main ingredients of Rhizoma gastrodiae on mycelial biomass and exopolysaccharide productions by submerged culture of Grifola frondosa
CN104278070A (zh) 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法
KR20030052058A (ko) 기능성 쌀의 제조방법, 그 방법으로 제조된 기능성 쌀 및그 기능성 쌀 성분을 함유하는 식용 조성물
Berovič et al. Submerged cultivation of Ganoderma lucidum biomass in stirred tank reactor
KR101557028B1 (ko) 찹쌀을 이용한 홍국쌀의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210917

Address after: 9 Lane 209, Zhongshan Road, erjiali 21, Liujia District, Tainan, Taiwan, China

Applicant after: Chen Shanrun

Address before: Tainan City, Taiwan, China

Applicant before: HONGRUN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231218

Address after: Room 112, Building 9, No. 99 Hongqi Avenue, Hailing District, Taizhou City, Jiangsu Province

Patentee after: Jiangsu Zhongrun Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: No. 9, Lane 209, Zhongshan Road, No. 21, Erjia Village, Liujia District, Tainan City

Patentee before: Chen Shanrun