CN112807253A - 一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物发酵领域，具体而言，涉及一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品。一种裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在基础培养基中培养裂褶菌，培养20小时以上，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。对裂褶菌培养20小时以上后，加入铁皮石斛水提物继续培养，该制备方法通过生物发酵的方法制备得到的产品不会引入太多的副产物，节约分离和提纯的工艺，降低工艺成本。该制备方法得到的发酵产物中多糖的含量较高，使发酵产物的抗氧化能力、清除自由基的水平和弹性蛋白酶抑制水平得到提升，可以用于护肤品。

Description

一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品
技术领域
本申请涉及生物发酵领域，具体而言，涉及一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品。
背景技术
裂褶菌，学名Schizophyllum commune Fr；其提取的蘑菇葡聚糖能提升巨噬细胞活性，从而增强免疫力，在医药和化妆品领域有广泛应用。
本申请提供一种裂褶菌的发酵产物的制备方法，旨在拓宽裂褶菌的发酵产物的用途。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品，其旨在提高裂褶菌发酵产物的抗氧化性。
本申请提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：
在基础培养基中培养裂褶菌，培养20小时以上，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。
对裂褶菌培养20小时以上后，加入铁皮石斛水提物继续培养，该制备方法通过生物发酵的方法制备得到的产品不会引入太多的副产物，节约分离和提纯的工艺，降低工艺成本。该制备方法得到的发酵产物中多糖的含量较高，使发酵产物的抗氧化能力、清除自由基的水平和弹性蛋白酶抑制水平得到提升，可以用于护肤品。
在本申请第一方面的一些实施例中，在基础培养基中培养裂褶菌，培养20-30小时，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。
在本申请第一方面的一些实施例中，培养所述裂褶菌的条件为：在25-30℃、150-180r/min下培养。
在本申请第一方面的一些实施例中，铁皮石斛水提物的制备方法如下：在55-65℃下超声提取0.5-2h；过滤后取滤液。
在本申请第一方面的一些实施例中，所述铁皮石斛和水的质量比为1:30-50。
在本申请第一方面的一些实施例中，在基础培养基中培养裂褶菌的步骤中，所述裂褶菌的加入体积为所述基础培养基体积的8-12％。
在本申请第一方面的一些实施例中，铁皮石斛水提物的原料铁皮石斛与所述基础培养基的质量比为(0.1-5):100；
在本申请第一方面的一些实施例中，基础培养基包括0.3-0.5wt％酵母浸膏、0.05-0.1wt％硫酸镁、0.1-0.3wt％磷酸二氢钾以及3-5wt％葡萄糖。
本申请第二方面提供一种裂褶菌发酵产物，裂褶菌发酵产物通过上述的裂褶菌发酵产物的制备方法制得。
本申请第三方面还提供一种护肤品，护肤品包括基质和上述的裂褶菌发酵产物。
本申请实施例提供的护肤品具有上述发酵产物的优点，具有较佳的抗氧化能力、清除自由基的水平和弹性蛋白酶抑制能力的水平。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了比色法测总糖含量标准曲线。
图2示出了比色法测还原糖含量标准曲线。
图3示出了实施例和对比例的裂褶菌发酵产物的DPPH自由基清除能力。
图4示出了实施例和对比例的裂褶菌发酵产物的ABTS+·自由基清除能力。
图5示出了实施例和对比例的裂褶菌发酵产物的弹性蛋白酶抑制能力。
图6示出了实施例和对比例的裂褶菌发酵产物的酪氨酸酶抑制能力。
图7示出了对比例10中不同样品的发酵产物对DPPH自由基清除能力。
图8示出了对比例10中不同样品的发酵产物对ABTS+·自由基清除能力。
图9示出了对比例10中不同样品的发酵产物对弹性蛋白酶抑制能力。
图10示出了对比例10中不同样品的发酵产物对酪氨酸酶的抑制率。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品进行具体说明。
一种裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在基础培养基中培养裂褶菌，培养20小时以上，然后向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。
在本申请的一些实施例中，在基础培养基中培养裂褶菌，20-28小时之后，向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。在本申请的一些实施例中，铁皮石斛在加入基础培养基之前需要对其进行预处理。
在本申请中，裂褶菌发酵产物的制备方法主要包括：
铁皮石斛的预处理制备铁皮石斛水提物：铁皮石斛鲜条经干燥后粉碎、过40目筛得到铁皮石斛粉末；取一定量的铁皮石斛粉末，添加铁皮石斛粉末重量30-50倍(例如可以为30倍、35倍、40倍、45倍、50倍等)的水，于55-65℃(例如可以为55℃、58℃、59℃、60℃、62℃、65℃等)下，超声提取0.5-2h(例如可以为0.5h、1h、1.5h或者2h等)，过滤后取滤液得到铁皮石斛水提物。
发明人发现只有铁皮石斛水提物才能对裂褶菌培养后的发酵产物中的多糖有益处。
在本实施例中，在培养之前对裂褶菌菌种活化和扩大培养，具体包括：将裂褶菌转接于斜面的基础培养基进行活化，在28℃，160r/min条件下培养5-7天直至菌丝长满斜面；随后将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3天，得到裂褶菌种子液。
在本申请的一些实施例中，裂褶菌的加入体积为基础培养基体积的8-12％。例如，裂褶菌种子液与基础培养基体积占比为8％、10％、12％等等；可以理解的是，在本申请的其他实施例中，如果不考虑产率等因素，裂褶菌种子液与基础培养基体积比可以不为上述值。
作为示例性地，基础培养基包括以下组分：
酵母浸膏0.3-0.5wt％、硫酸镁0.05-0.1wt％、磷酸二氢钾0.1-0.3wt％以及葡萄糖3-5wt％。
例如，基础培养基包括以下组分：酵母浸膏0.3wt％、硫酸镁0.05wt％、磷酸二氢钾0.1wt％、葡萄糖3wt％，pH自然(pH6.0左右)。
在本申请的其他实施例中，基础培养基可以根据裂褶菌的生长习性等进行配置，可以采用其他配方。
在含有铁皮石斛水提物的培养基中培养裂褶菌；在本申请的一些实施例中，先在基础培养基中培养裂褶菌，20-28小时之后，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养。
如果在开始培养之初就加入铁皮石斛水提物，不仅不会增加发酵产物的抗氧化性能，反而会降低抗氧化性能。此外，如果在培养基中以其他形式加入铁皮石斛，例如铁皮石斛粉料，发酵产物的抗氧化性能也并不会升高。
先在基础培养基中培养裂褶菌20小时以上再加入铁皮石斛水提物，才有利于提高发酵产物中多糖的含量，进一步地，在一些实施例中，发酵20-28小时之后，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养。发酵20-28小时之后，加入铁皮石斛水提物继续培养，更益于多糖的生成。
承上所述，培养裂褶菌20-28小时之后再向基础培养基中加入铁皮石斛水提物然后继续培养。继续培养的时间可以为100-130h(例如可以为100h、110h、120h、130h等等)。
在本申请的实施例中，培养所述裂褶菌的条件为：在25-30℃、150-180r/min下培养。在加入铁皮石斛水提物前后培养条件均为在25-30℃、150-180r/min下培养。例如温度可以为25℃、26℃、28℃、30℃；转速可以为150r/min、160r/min、165r/min、170r/min、180r/min等等。
作为示例性地，铁皮石斛水提物与所述基础培养基的质量比为(0.1-5):100；例如可以为0.1:100、0.3:100、0.5:100、0.7:100、0.9:100、2:100、3:100、4:100、5:100等等。
培养完成后收集发酵产物，例如，将发酵产物进行离心处理，除去滤渣，得到发酵产物。
本申请还提供一种裂褶菌发酵产物，裂褶菌发酵产物通过上述的裂褶菌发酵产物的制备方法制得。
本申请的制备方法简单，该制备方法得到的发酵产物中多糖的含量较高，使发酵产物的抗氧化能力、清除自由基的水平和弹性蛋白酶抑制能力的水平得到提升，可以用于护肤品。此外，通过生物发酵的方法制备得到的产品不会引入太多的副产物，节约分离和提纯的工艺，降低工艺成本。
本申请还提供一种护肤品，该护肤品包括基质和上述的裂褶菌发酵产物。
作为示例性地，基质可以包括药学上可以接受的辅料、以及其他有效成分等。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例以及对比例中所用的为广东省微生物研究所提供的GIM 5.43。
实施例1
本实施例提供了一种裂褶菌发酵产物，主要通过以下步骤制得：
(1)铁皮石斛鲜条经干燥后，粉碎、过40目筛，得到铁皮石斛粉末，备用。
(2)取步骤(1)中铁皮石斛粉末，添加铁皮石斛粉末重量40倍的水，于60℃下，超声辅助提取1h，离心后取其上清液，并用一定量水定容(铁皮石斛粉末：水＝1:50)，得到铁皮石斛水提物，铁皮石斛水提物的浓度为20g/L(铁皮石斛粉末的质量与铁皮石斛水提物的体积比)；
(3)裂褶菌菌种活化：将裂褶菌转接于斜面培养基进行活化，在28℃，160r/min条件下培养6天直至菌丝长满斜面；随后将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3天，得到发酵种子液。
(4)配置基础培养基：基础培养基包括按照质量百分数计的以下成分：0.3％酵母浸膏、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、3％葡萄糖，pH自然(约6.0)。
(5)将5％(v/v,裂褶菌种子液/接入种子液后培养基总体积)的裂褶菌菌种接入上述基础培养基中，于28℃，160r/min条件下进行发酵。发酵24h后，取步骤(2)中铁皮石斛水提液加入发酵体系，使铁皮石斛与基础培养基质量比为0.3:100。发酵120h后，将发酵产物进行离心处理，取滤液得到发酵产物。
实施例2
本实施例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，实施例2与实施例1的区别在于步骤(5)中菌种的接种量不相同；在本实施例中，步骤(5)中将10％裂褶菌菌种接入基础培养基中。
对比例1
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，对比例1与实施例1的区别在于：步骤(5)中加入的是铁皮石斛粉末，且铁皮石斛粉末的添加量不相同，在本对比例中，步骤(5)中铁皮石斛粉末的加入量与基础培养基质量比为0.3:100。
对比例2
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，对比例2与实施例1的区别在于步骤(5)中菌种的接种量、铁皮石斛加入形式不同。在本对比例中，步骤(5)中将10％裂褶菌菌种接入基础培养基中，在本对比例中，加入的是铁皮石斛粉末，铁皮石斛粉末的加入量与基础培养基质量比为0.3:100。
对比例3
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，对比例3与实施例1的区别在于步骤(4)与(5)。
在本对比例中，步骤(4)中，培养基包括按照质量百分数计的以下成分：铁皮石斛粉末0.6％、酵母浸膏0.3％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.1％、葡萄糖3％，pH自然(约6.0)。
步骤(5)中将5％裂褶菌菌种接入培养基中，于28℃，160r/min条件下进行发酵。发酵120h后，将发酵产物进行离心处理，取滤液得到发酵产物。
对比例4
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅对比例3，对比例4与对比例3的区别在于步骤(5)中菌种的接种量不相同，在本对比例中，步骤(5)中将10％裂褶菌菌种接入培养基中。
对比例5
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，主要通过以下制备方法制得：
裂褶菌菌种活化：将裂褶菌通过斜面培养基活化，在28℃，160r/min条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3天，得到发酵种子液。
配置基础培养基：基础培养基包括按照质量百分数计的以下成分：酵母浸膏0.3％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.1％、葡萄糖3％、3％的琼脂，pH自然(约6.0)。
将5％的裂褶菌菌种接入上述基础培养基中，于28℃，160r/min条件下进行发酵。发酵144h后，将发酵产物进行离心处理，取滤液得到发酵产物。
对比例6
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，本对比例与对比例5的区别在于裂褶菌菌种的接种量不同，将10％的裂褶菌菌种接入基础培养基中。
对比例7
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，对比例7与实施例1的区别在于步骤(5)中加入铁皮石斛水提物的时机不同，将5％裂褶菌菌种入基础培养基后，立刻加入铁皮石斛水提物。
实施例3
本实施例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，实施例3与实施例1的区别在于步骤(5)中加入铁皮石斛水提物的时机不相同，在本实施例中，裂褶菌菌种接入基础培养基发酵48h后，再加入铁皮石斛水提物。
实施例4
本实施例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，实施例4与实施例1的区别在于步骤(5)中加入铁皮石斛水提物的时机不相同，在本实施例中，裂褶菌菌种接入基础培养基发酵72h后，再加入铁皮石斛水提物。
对比例8
本对比例提供了一种铁皮石斛水提物，请参阅实施例1，本申请对比例提供的铁皮石斛水提物通过实施例1提供的方法制得。
对比例9
本对比例提供了一种裂褶菌发酵产物，请参阅实施例1，对比例9与实施例1的区别在于步骤(2)。在本对比例中，步骤(2)如下：
(2)取步骤(1)中铁皮石斛粉末，添加铁皮石斛粉末重量40倍的95vol％的乙醇水溶液，于60℃下，超声辅助提取1h，离心后取其上清液，蒸馏去除乙醇，于70℃烘干，得到铁皮石斛醇提物。
相应地，在步骤(5)中，加入的是铁皮石斛醇提物，本对比例中铁皮石斛醇提物的用量与实施例1中铁皮石斛水提物的用量原料以铁皮石斛作为参照，加入相同量的铁皮石斛提物的提取物。
对比例1-对比例4均是向基础培养基中加入铁皮石斛的粉末，对比例5-6未加入铁皮石斛进行培养。对比例7加入的铁皮石斛水提物的时机为刚开始培养时。对比例9加入的是铁皮石斛醇提物，对比例8未对裂褶菌进行培养。
试验例1
取实施例1-实施例4、对比例1-9制备得到的裂褶菌发酵产物进行测试，将于15000g、4℃下离心10min，收集沉淀，用蒸馏水清洗以去除残渣，仅保留菌体；于60℃烘干至恒重，称重，即得生物量。不同的裂褶菌发酵产物裂褶菌生物量的测试结果见表1。
表1
Figure BDA0002884300570000101
Figure BDA0002884300570000111
从表1可以看出：实施例1、实施例2、实施例3-4的生物量较佳。对比例5-7的生物量较大，其余加入铁皮石斛粉末的生物量较小。说明铁皮石斛的水提物有利于促进裂褶菌菌体的生长；铁皮石斛的醇提物(对比例9)不利于促进裂褶菌菌体的生长。
试验例2
采用硫酸-苯酚法和DNS法测定实施例1-实施例4、对比例1-9制备得到的裂褶菌发酵产物的多糖含量。
采用硫酸-苯酚法测定发酵产物总糖含量，多糖在浓硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物总糖含量。
实验步骤如下：
(1)于10.0mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入5％苯酚溶液1.0mL，再迅速垂直液面加入5.0mL浓硫酸，静置10min。使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将具塞试管放置于30℃水浴反应20min。
(3)以相应试剂进行空白调零，于490nm处测定吸光度。总糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N。图1示出了比色法测总糖含量标准曲线。
采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量。
具体操作步骤如下：
(1)于10mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入DNS溶液3.0mL，沸水浴5min后显色；待冷却后用水定容至25.0mL，充分摇匀；
(3)以相应试剂进行空白调零，于550nm处测定吸光度。还原糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N。图2示出了比色法测还原糖含量标准曲线。表2示出了不同的裂褶菌发酵产物多糖含量。
表2
Figure BDA0002884300570000121
还原糖即为发酵培养基中的葡萄糖。如果还原糖含量较高，代表发酵过程对葡萄糖的利用率低，没有充分利用营养物质。从表2可以看出：实施例1、实施例3以及实施例4的还原糖偏高。
试验例3
取实施例1-实施例4、对比例1-9制备得到的裂褶菌发酵产物进行抗氧化能力测试一。
DPPH·又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。
具体实验步骤如下：
分别吸取2.0mL样品溶液(或无水乙醇)和2.0mLDPPH·溶液于具塞试管中，混匀；避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值。
Figure BDA0002884300570000131
式中：
A0：没有添加样品，添加DPPH；
A1：添加样品或无水乙醇，添加DPPH；
A2：添加样品或无水乙醇，没有添加DPPH。
测试结果如图3所示。从图3可以看出，实施例1、实施例2以及实施例3-4对DPPH自由基清除能力明显优于对比例1-9。
试验例4
取实施例1-实施例4、对比例1-9制备得到的裂褶菌发酵产物进行抗氧化能力测试二。
ABTS在适当的氧化物作用下氧化成绿色的ABTS+·，当向反应中加入抗氧化物质时，ABTS+·的产生就会受到抑制，在734nm测定吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。
具体实验步骤如下：
(1)取7mmol/L的ABTS溶液，用10mmol/L的PBS(pH＝7.4)稀释60倍，得到ABTS工作液；
(2)吸取190μL ABTS工作液(或PBS)，加入10μL样品溶液(或PBS)，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm处吸光值A。
Figure BDA0002884300570000141
式中：
A0：没有添加样品，添加ABTS；
A1：添加样品或PBS，添加ABTS；
A2：添加样品或PBS，没有添加ABTS。
测试结果如图4所示。从图4可以看出，实施例1、实施例2以及实施例3-4对ABTS+·自由基清除能力明显优于对比例1-9。
试验例5
取实施例1-实施例4、对比例1-9制备得到的裂褶菌发酵产物进行弹性蛋白酶抑制能力测试。
具体实验步骤如下：
将50μL样品与100μL 0.9U/mL弹性蛋白酶和100μL Tris-HCl缓冲液于25℃孵育20min；随后加入50μL MAAPVN溶液以启动反应，对于样品空白对照，则加入50μL Tris-HCl缓冲液替代MAAPVN。在25℃孵育60min后，在410nm处测定吸光值。
Figure BDA0002884300570000142
式中：
A1：添加样品，添加MAAPVN；
A2：添加样品，没有添加MAAPVN；
B1:没有添加样品，添加MAAPVN；
B2：没有添加样品，没有添加MAAPVN。
测试结果如图5所示。从图5可以看出，实施例1、实施例2以及实施例3-4够有效抑制弹性蛋白酶的活性，效果优于其余对比例1-9。
试验例6
取实施例1-实施例4、对比例1-9制备得到的裂褶菌发酵产物进行酪氨酸酶抑制能力测试。
实验步骤如下：
向96孔板中依次加入磷酸盐缓冲液、不同供试液(磷酸缓冲液充当样品空白)、500U/mL酶液，最后加入底物1.5mmol/L L-酪氨酸，立即开始计时，测定反应20min时475nm波长下的吸光值。
Figure BDA0002884300570000151
式中：
A1：添加样品，添加L-酪氨酸；
A2：添加样品，没有添加L-酪氨酸；
B1:没有添加样品，添加L-酪氨酸；
B2：没有添加样品，没有添加L-酪氨酸。
测试结果如图6所示。从图6可以看出，实施例1、实施例2以及实施例3-4够有效抑制酪氨酸酶的活性，效果明显优于其余对比例。
综上可以看出：本申请实施例通过向基础培养基中加入铁皮石斛水提物，且控制加入的时机，可以增加发酵产物抑制酪氨酸酶的活性、弹性蛋白酶抑制水平以及抗氧化的能力。
对比例10
本对比例10提供多个裂褶菌发酵产物的样品，主要通过以下方法制得：
样品一：请参阅实施例1，其与实施例1的区别在于将铁皮石斛换为巴戟天；
样品二：请参阅实施例2，其与实施例2的区别在于将铁皮石斛换为巴戟天；
样品三：请参阅实施例3，其与实施例3的区别在于将铁皮石斛换为巴戟天；
样品四：请参阅实施例4，其与实施例4的区别在于将铁皮石斛换为巴戟天。
试验例7
请参阅试验例1-6，分别将对比例10提供的四个样品采用试验例1-6的测试手段。
其中，不同样品的裂褶菌生物量的结果见表3。不同样品的发酵产物的多糖含量见表4。
表3
样品 生物量(mg/mL)
样品一 9.47
样品二 9.36
对比例5 5.68
对比例6 6.69
样品三 8.37
样品四 8.96
表4
Figure BDA0002884300570000171
从表3和表4可以看出：巴戟天的水提物可以促进裂褶菌菌体的生长，使生物含量增加。巴戟天的水提物能够一定程度促进裂褶菌的生长，并提升其多糖的产量。
图7示出了对比例10中不同样品的发酵产物对DPPH自由基清除能力。
从图7可以看出：样品一、样品二、样品三以及样品四对DPPH自由基清除能力均小于对比例6(未加入巴戟天的水提物)的自由基清除能力。
图8示出了对比例10中不同样品的发酵产物对ABTS+·自由基清除能力。
从图8可以看出：对于ABTS+·自由基清除能力，除了样品一比对比例5(未加入巴戟天的水提物)优之外，其余均比对比例5差。
图9示出了对比例10中不同样品的发酵产物对弹性蛋白酶抑制能力。
从图9可以看出：样品一、样品二、样品三以及样品四对弹性蛋白酶抑制能力均小于对比例6(未加入巴戟天的水提物)；说明巴戟天水提物未能提升发酵产物的抗衰老活性。
图10示出了对比例10中不同样品的发酵产物对酪氨酸酶的抑制率。
从图10可以看出：样品一、样品二、样品三以及样品四对酪氨酸酶的抑制能力均小于对比例5(未加入巴戟天的水提物)；说明巴戟天水提物未能提升发酵产物的对酪氨酸酶的抑制性能。
试验例8
测试对比例10中不同样品以及对比例5、对比例6的发酵产物对羟自由基的清除能力。
实验步骤如下：
取3.0ml 2mmol/L FeSO4溶液，3.0mL 1mmol/L H2O2溶液(或蒸馏水)，随后加入3.0mL 6mmol/L水杨酸溶液，于37℃孵育15min；
(2)加入1.0mL样品(或蒸馏水)，37℃孵育15min后，于510nm下测定其吸光值。
Figure BDA0002884300570000181
式中：
A0：没有添加样品，添加H2O2；
A1：添加样品，添加H2O2；
A2：添加样品，没有添加H2O2。
测试结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002884300570000182
Figure BDA0002884300570000191
根据表5，添加巴戟天水提物得到的样品，发酵产物的羟自由基的清除能力未得到提升。
巴戟天富含糖类成分，其可以增强人体自身的免疫力，改善骨质疏松，还可抗抑郁，抗氧化，促使生成新的血液，使心功得到改善、生殖功能得到调节。而其中的环烯醚萜类成分则可抗击氧化、抗肿瘤、抗细胞染色体诱变、消炎镇痛及泻下等疗效。
通过对比例10以及试验例7和试验例8可以看出，添加巴戟天水提物至基础培养基培养裂褶菌，得到的发酵产物的抗氧化能力、酪氨酸酶抑制能力、弹性蛋白酶抑制能力不仅没有增加，反而减小。
说明本申请提供的发酵方法不适用于所有的具有抗氧化多糖的药物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括：
在基础培养基中培养裂褶菌，培养20小时以上，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。
2.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，在基础培养基中培养裂褶菌，培养20-30小时，再向所述基础培养基中加入铁皮石斛水提物继续培养，然后收集发酵产物。
3.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，培养所述裂褶菌的条件为：在25-30℃、150-180r/min下培养。
4.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，所述铁皮石斛水提物的制备方法如下：在55-65℃下超声提取0.5-2h；过滤后取滤液。
5.根据权利要求4所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，所述铁皮石斛和水的质量比为1:(30-50)。
6.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，所述在基础培养基中培养裂褶菌的步骤中，所述裂褶菌的加入体积为所述基础培养基体积的8-12％。
7.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，所述铁皮石斛水提物的原料铁皮石斛与所述基础培养基的质量比为(0.1-5):100。
8.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵产物的制备方法，其特征在于，所述基础培养基包括酵母浸膏0.3-0.5wt％、硫酸镁0.05-0.1wt％、磷酸二氢钾0.1-0.3wt％以及葡萄糖3-5wt％。
9.一种裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物通过权利要求1-8任一项所述的裂褶菌发酵产物的制备方法制得。
10.一种护肤品，其特征在于，所述护肤品包括基质和权利要求9所述的裂褶菌发酵产物。
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