CN111647092B - 一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法及其应用 - Google Patents
一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)将茯苓粉碎、过筛，得到的茯苓粉；然后将茯苓粉作为发酵基质，按1：0.5～1.5的比例添加水，并调节pH值至3.5～6.5，得到发酵培养基；(2)将里氏木霉菌经活化、扩大培养，得到里氏木霉菌种子液；(3)将里氏木霉菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，干燥，得到发酵菌剂；(4)将发酵菌剂在沸水浴中进行水提，浓缩、醇沉，得到茯苓多糖。本发明采用里氏木霉降解茯苓纤维素，可以显著提高茯苓多糖的得率。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，特别涉及一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法及其应用。
背景技术
茯苓，为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。茯苓多糖是真菌茯苓中具有多种药理作用的主要活性成分，含量高达93％以上，主要存在于茯苓的细胞壁中。茯苓多糖中有水溶性多糖和碱溶性多糖两种类型，其中多数为碱溶性多糖。大量研究表明，茯苓多糖可治疗腹泻、呕吐、水肿、惊悸等症状，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化以及免疫调节等生理活性，以及降血糖、镇静催眠、和胃益脾、退黄疸、消结石、增强机体免疫力、延缓衰老和改善学习记忆等药理作用，在临床医学、食品药膳以及美容保健等领域具有广泛应用。现代研究证实β-茯苓聚糖是含有少量β-1,6-葡聚糖支链的β-1,3-D-葡聚糖，具有分子量高、结构紧密、水溶性差、生物利用率低等特性。因此采用微生物发酵和酶解等转化降解技术，将茯苓大分子的多糖有效降解转化为水溶性好、加工利用率更高、生物活性更强的小分子水溶性茯苓多糖，成为茯苓精深加工开发、深度挖掘与利用的关键技术之一。
目前研究较多的降解大分子茯苓多糖的方法主要分为三类：化学、物理和生物方法。其中，化学降解破解多糖的生物活性，而物理降解法又效率低。相对而言，生物降解则主要是指通过外源酶的作用对多糖进行酶促降解，该方法专一性强、高效且无副反应，吸引了大量的关注。因此，提供一种微生物发酵对茯苓进行适度降解改性的技术工艺以提高茯苓多糖的提取率具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法。
本发明的另一目的在于提供所述利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，包括如下步骤：
(1)制备发酵培养基：将茯苓粉碎、过筛，得到茯苓粉；然后将茯苓粉作为发酵基质，按1：0.5～1.5(g/mL)的比例添加水，混合均匀(制成半固态膏状)，并调节pH值至3.5～6.5，灭菌，得到发酵培养基；
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌通过斜面培养基活化培养后，接种到液体培养基中进行扩大培养，得到里氏木霉菌种子液；
(3)半固态发酵：将步骤(2)中得到的里氏木霉菌种子液接种到步骤(1)中得到的发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养后将其干燥，得到发酵菌剂；
(4)提取茯苓多糖：将步骤(3)中得到的发酵菌剂加入到水中，在沸水浴中进行水提，抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩，得到多糖水提浓缩液；再加入乙醇溶液，静置，离心，取沉淀，洗涤，干燥，得到茯苓多糖。
步骤(1)中所述的过筛为过100～300目筛；优选为过200目筛。
步骤(1)中所述的茯苓粉与水的配比优选为1：0.8～1.5(g/mL)；更优选为1：1(g/mL)。
步骤(1)中所述的调节pH值的调节剂优选为盐酸、磷酸或硫酸；优选为磷酸或盐酸；更优选为1mol/L的盐酸溶液。
步骤(1)中所述的调节pH值优选为调节pH值至4.5～6.0；更优选为调节pH值至5.5。
步骤(1)中所述的灭菌的条件优选为：121℃灭菌15min。
步骤(2)中所述的里氏木霉菌为里氏木霉菌为里氏木霉GIM 3.141；优选为购自广东省微生物研究所的里氏木霉菌GIM 3.141。
步骤(2)中所述的斜面培养基为PDA培养基；优选为添加了2％(w/w)琼脂的PDA培养基。
步骤(2)中所述的活化的条件为：30℃活化24h。
步骤(2)中所述的液体培养基的组成成分如下：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐溶液50mL/L，Mandels微量元素盐溶液1mL/L，用1.0mol/L的醋酸缓冲液调pH至4.8；其中，
Mandels营养盐溶液的组成成分为：(NH4)2SO4 14g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2·2H2O44g/L，MgSO4·7H2O 3g/L；
Mandels微量元素盐溶液的组成成分为:FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4·7H2O 1.7g/L，CoCl2·6H2O 23.7g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L。
所述的配置液体培养基、Mandels营养盐溶液和Mandels微量元素盐溶液所用水优选为双蒸水。
步骤(2)中所述的扩大培养的条件为：28～35℃、100～200r/min培养2～4天；优选为30℃、150r/min培养2天。
步骤(2)中所述的里氏木霉菌种子液的浓度为105～107个/ml；优选为106个/ml。
步骤(3)中所述的里氏木霉菌种子液的接种量为体积百分比2～10％；优选为体积百分比5～10％。
步骤(3)中所述的发酵时间为4～9天；优选为7天。
步骤(3)中所述的发酵温度为25～32℃；优选为28℃～32℃。
步骤(3)中所述的干燥为35℃下烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止。
步骤(4)中所述的发酵菌剂与水的配比优选为1：10～20(g/mL)。
步骤(4)中所述的水提的时间为1～2h；优选为1h。
步骤(4)中所述的水提的次数为1～3次；优选为2次。
步骤(4)中所述的浓缩为浓缩至多糖水提液体积的1/8～1/2；优选为浓缩至多糖水提液体积的1/4。
步骤(4)中所述的乙醇溶液为体积百分比80～90％的乙醇溶液；优选为体积百分比85％的乙醇溶液。
步骤(4)中所述的乙醇溶液与多糖水提浓缩液的体积比为2～4:1；优选为4:1。
步骤(4)中所述的静置的条件为：4℃静置过夜。
步骤(4)中所述的离心的条件为：4000～5000r/min离心15～20分钟；优选为：5000r/min离心20分钟。
步骤(4)中所述的洗涤为采用无水乙醇进行洗涤。
步骤(4)中所述的干燥为在热水浴条件下进行干燥。
所述的热水浴的温度为50～60℃。
所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法在提取茯苓多糖中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明采用产纤维素酶能力高的里氏木霉降解茯苓纤维素，以提高茯苓多糖的得率，相对于化学方法的污染和物理方法的低提取效率，本发明方法更简单，效率更高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明中涉及的化学试剂均为分析纯。
本发明中涉及的液体培养基的配方如下：
液体培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐溶液50mL/L，Mandels微量元素盐溶液1mL/L，用1.0mol/L的醋酸缓冲液调pH 4.8；其中，
Mandels营养盐溶液的组成成分为：(NH4)2SO4 14g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2·2H2O44g/L，MgSO4·7H2O 3g/L(配制溶液所用水为双蒸水)；
Mandels微量元素盐溶液的组成成分为:FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4·7H2O 1.7g/L，CoCl2·6H2O 23.7g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L(配制溶液所用水为双蒸水)。
本发明中涉及的里氏木霉菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)GIM 3.141，购自购自广东省微生物菌种保藏中心(即里氏木霉(Trichoderma reesei)GDMCC 3.141：http://www.gdmcc.net/good.do？method＝view&id＝20200427162928914)。
本发明中涉及的毛霉菌为鲁氏毛霉(Mucor rouxianus(Calmette)Wehmer)GDMCC3.88，购自广东省微生物菌种保藏中心(http://www.gdmcc.net/good.do？method＝view&id＝20200427162926813)。
本发明中用到的干燥茯苓块可以通过常规市售途径购买得到，实施例中涉及的干燥茯苓块购自淘宝店铺福东海官方旗舰店(https://detail.tmall.com/item.htm？spm＝a230r.1.14.86.2e903238Slt1Ka&id＝25947480081&ns＝1&abbucket＝5)。
实施例1
(1)发酵原料：将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过100目筛。取2g茯苓粉作为发酵基质，按1:1(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.0，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)，在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按10％(v/v)接种量接入里氏木霉菌种子液，置于28℃的恒温培养箱中发酵7d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：10(g/ml)添加无菌水、沸水浴1h、提取1次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/4，再加入4倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥，获得干燥的发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。量取多糖水溶液1.0ml于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为6.25％，符合理想的茯苓多糖得率。
实施例2
(1)发酵原料：将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过200目筛。取2g茯苓粉作为发酵基质，按1:0.8(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至4.5，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在28℃，100r/min摇床上培养3d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的在发酵原料中按5％(v/v)接种量接入里氏木霉菌种子液，充分混匀后，置于30℃的恒温培养箱中发酵9d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：20(g/ml)添加无菌水、沸水浴2h、提取1次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/2，加入4倍体积的80％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以4000r/min离心15分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥，获得干燥的发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。取1.0ml多糖水溶液于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率在为7.23％，符合理想的茯苓多糖得率。
实施例3
(1)发酵原料：将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过300目筛。取4g茯苓粉作为发酵基质，按1:1.5(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.5，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在35℃，200r/min摇床上培养4d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按8％(v/v)接种量接入里氏木霉菌种子液，充分混匀后，置于28℃的恒温培养箱中发酵9d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：20(g/ml)添加无菌水、沸水浴1.5h、提取2次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/8，加入3倍体积的90％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以4500r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥，获得干燥发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。取1.0ml多糖水溶液于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为9.12％，符合理想的茯苓多糖得率。
实施例4
(1)发酵原料：茯苓，将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过100目筛。取4g茯苓粉作为发酵基质，按1:0.5(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至6.0，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按2％(v/v)接种量接入里氏木霉菌种子液，充分混匀后，置于32℃的恒温培养箱中发酵7d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：15(g/ml)添加无菌水、以沸水浴1h、提取2次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/3，加入3倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心18分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。取1.0ml多糖水溶液于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为6.67％，符合理想的茯苓多糖得率。
实施例5
(1)发酵原料：茯苓，将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过300目筛。取2g茯苓粉作为发酵基质，按1:1.5(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.5，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按4％(v/v)接种量接入种子液，充分混匀后，置于30℃的恒温培养箱中发酵6d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：20(g/ml)添加无菌水、以沸水浴1h、提取3次的条件进行水提，趁热抽滤得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/4，加入2倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以4500r/min离心15分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥，获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。取1.0ml多糖水溶液于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为5.57％，符合理想的茯苓多糖得率。
实施例6
(1)发酵原料：茯苓，将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过100目筛。取3g茯苓粉作为发酵基质，按1:1(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.0，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按7％(v/v)接种量接入里氏木霉菌种子液，充分混匀后，置于28℃的恒温培养箱中发酵9d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：15(g/ml)添加无菌水、以沸水浴1h、提取3次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/3，加入2倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。量取多糖水溶液1.0ml于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为8.27％，符合理想的茯苓多糖得率。
实施例7
(1)发酵原料：茯苓，将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过200目筛。取2g茯苓粉作为发酵基质，按1:0.5(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至6.0，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按10％(v/v)接种量接入种子液，充分混匀后，置于32℃的恒温培养箱中发酵4d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：10(g/ml)添加无菌水、以沸水浴1h、提取1次的条件进行水提，趁热抽滤得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/2，加入4倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。量取多糖水溶液1.0ml于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为7.56％，符合理想的的茯苓多糖得率。
对比例1
(1)发酵原料：将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过300目筛。取10g茯苓粉作为发酵基质，按1:0.4(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.5，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按5％(v/v)接种量接入里氏木霉菌种子液，充分混匀后，置于30℃的恒温培养箱中发酵6d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：20(g/ml)添加无菌水、以沸水浴1h、提取1次的条件进行水提，趁热抽滤得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/4，加入4倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥，获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到。取1.0ml多糖水溶液于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为0.45％，未能达到预期得率。失败原因：茯苓粉含量过高，水分含量过低，未能形成半固体的膏状，而是形成了面团状的固态基质，霉菌生长不旺盛。
对比例2
(1)发酵原料：将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过200目筛。取5g茯苓粉作为发酵基质，按1:5(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至4.5，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料。
(2)制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，然后用接种环在里氏木霉斜面种子上挑取1环孢子接种到装有50mL上述液体培养基的250mL的三角瓶中，在30℃，150r/min摇床上培养2d，作为里氏木霉菌种子液，控制种子液的浓度为106个/ml。
(3)液态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按5％(v/v)接种量接入种子液，充分混匀后，置于30℃的恒温培养箱中发酵9d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：20(g/ml)添加无菌水、沸水浴1h、提取1次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/2，加入4倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后分别加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。取1.0ml多糖水溶液于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为0.82％，未能达到预期得率。失败原因：水分含量过高，导致茯苓基质未能形成半固体的膏状，而是形成了液体基质，木霉菌生长不旺盛。
对比例3
(1)发酵原料：将干燥茯苓块用粉碎机打碎，过300目筛。取4g茯苓粉作为发酵基质，按1:1(g/ml)的比例添加无菌水，混合均匀后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5.5，121℃，灭菌15min，冷却，得到发酵原料(半固态)。
(2)制备毛霉菌种子液：将毛霉菌株按照平板划线法于相应的斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基，2％(w/w)琼脂)在30℃的温度下活化24h，后用接种环在毛霉斜面种子上挑取1环孢子，接入装有已灭菌的种子培养基(种子培养基采用麸皮培养基，每支250ml三角瓶中装入干麸皮10g，加水10ml，搅拌均匀后在121℃条件下灭菌20min，冷却后备用)的250mL三角瓶中，充分混匀后将其放置在28℃，150r/min的生化培养箱中培养3d。培养后向已培养好的麸皮种子培养基中加入无菌水100ml，充分摇匀后用4层无菌纱布过滤，所得滤液作为毛霉菌种子液，控制种子液浓度为106个/ml。
(3)半固态发酵：在步骤(1)中得到的发酵原料中按8％(v/v)接种量接入种子液，充分混匀后，置于28℃的恒温培养箱中发酵7d后，35℃烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止，备用。
(4)提取茯苓多糖：将干燥的发酵菌剂按料液比1：20(g/ml)添加无菌水、沸水浴1h、提取1次的条件进行水提，趁热抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩至原体积的1/4，加入4倍体积的85％(体积百分数)乙醇溶液于4℃静置过夜，以5000r/min离心20分钟，沉淀物用无水乙醇洗涤后，热水浴(50～60℃)加热干燥获得发酵茯苓多糖样品。
(5)标准曲线绘制：准确称取标准葡萄糖(分子量是180.16)10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖毫克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。
(6)多糖含量测定：用10ml蒸馏水溶解步骤(4)中获得的全部干燥的发酵茯苓多糖，得到多糖水溶液。量取多糖水溶液1.0ml于玻璃比色管中，然后加入5％(w/v)苯酚溶液1ml及浓硫酸(质量分数98％)5.0ml，摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测吸光度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，根据测得的吸光度计算多糖浓度，再根据下列公式计算多糖得率：
c：根据吸光度和标准曲线计算得到的样液浓度，mg/ml；
V2：测定所用的多糖水溶液体积，ml；
V1：多糖水溶液总体积，ml；
m：茯苓粉质量，g。
所得茯苓多糖得率为0.76％，未能达到预期得率。失败原因：虽发酵基质已形成理想中的半固体状，但毛霉菌并不能像木霉菌一样在半固体的茯苓基质中发挥有效的作用，茯苓基质不能被充分发酵，导致茯苓多糖得率不理想。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备发酵培养基：将茯苓粉碎、过筛，得到茯苓粉；然后将茯苓粉作为发酵基质，按1：0.5～1.5 g/ml的比例添加水，混合均匀，并调节pH值至3.5～6.5，灭菌，得到发酵培养基；
（2）制备里氏木霉菌种子液：将里氏木霉菌通过斜面培养基活化培养后，接种到液体培养基中进行扩大培养，得到里氏木霉菌种子液；
（3）半固态发酵：将步骤（2）中得到的里氏木霉菌种子液接种到步骤（1）中得到的发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养后将其干燥，得到发酵菌剂；
（4）提取茯苓多糖：将步骤（3）中得到的发酵菌剂加入到水中，在沸水浴中进行水提，抽滤，得到多糖水提液；然后将多糖水提液浓缩，得到多糖水提浓缩液；再加入乙醇溶液，静置，离心，取沉淀，洗涤，干燥，得到茯苓多糖；
步骤（2）中所述的里氏木霉菌为里氏木霉GDMCC 3.141；
步骤（2）中所述的里氏木霉菌种子液的浓度为105～107个/ml；
步骤（3）中所述的里氏木霉菌种子液的接种量为体积百分比2～10%。
2.根据权利要求1所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的茯苓粉与水的配比为1：0.8～1.5，g/mL；
步骤（1）中所述的调节pH值为调节pH值至4.5～6.0。
3.根据权利要求2所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的茯苓粉与水的配比为1：1，g/mL；
步骤（1）中所述的调节pH值为调节pH值至5.5。
4.根据权利要求1所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的斜面培养基为PDA培养基；
步骤（2）中所述的液体培养基的组成成分如下：葡萄糖10 g/L，蛋白胨1g/ L，Mandels营养盐溶液50 mL/L，Mandels 微量元素盐溶液1mL/L，用1.0 mol/L的醋酸缓冲液调pH 至4.8；其中，
Mandels营养盐溶液的组成成分为：(NH4)2SO4 14g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2·2H2O 4g/L，MgSO4·7H2O 3g/L；
Mandels微量元素盐溶液的组成成分为: FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4·7H2O 1.7g/L，CoCl2·6H2O 23.7g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L。
5.根据权利要求1所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的发酵菌剂与水的配比为1：10～20，g/mL。
6.根据权利要求1所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的里氏木霉菌种子液的浓度为106个/ml；
步骤（3）中所述的里氏木霉菌种子液的接种为体积百分比5～10%。
7.根据权利要求1所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的发酵温度为25～32℃；
步骤（3）中所述的发酵时间为4～9天；
步骤（3）中所述的干燥为35℃下烘干至半固态基质内部干燥，且质量不再发生变化为止；
步骤（4）中所述的乙醇溶液为体积百分比80~90%的乙醇溶液；
步骤（4）中所述的乙醇溶液与多糖水提浓缩液的体积比为2~4:1。
8.根据权利要求1所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的过筛为过100～300目筛；
步骤（1）中所述的调节pH值的调节剂为盐酸、磷酸或硫酸；
步骤（1）中所述的灭菌的条件为：121℃灭菌15min；
步骤（2）中所述的活化的条件为：30℃活化24h；
步骤（2）中所述的扩大培养的条件为：28~35℃、100~200r/min培养2~4天；
步骤（4）中所述的水提的时间为1~2h；
步骤（4）中所述的水提的次数为1～3次；
步骤（4）中所述的浓缩为浓缩至多糖水提液体积的1/8～1/2；
步骤（4）中所述的静置的条件为：4℃静置过夜；
步骤（4）中所述的离心的条件为：4000~5000r/min离心15~20分钟；
步骤（4）中所述的洗涤为采用无水乙醇进行洗涤；
步骤（4）中所述的干燥为在热水浴条件下进行干燥；
所述的热水浴的温度为50~60℃。
9.权利要求1～8任一项所述的利用里氏木霉菌半固态发酵提高茯苓多糖得率的方法在提取茯苓多糖中的应用。
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