CN104278068B - 一种提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法，包括：(1)制备桑黄液体种子液；(2)制备青顶拟多孔菌种子液；(3)向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积1％‑10％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度22℃‑30℃的条件下培养1天‑4天后，将温度调为25℃‑29℃，接入占发酵培养基体积5％‑20％的桑黄液体种子液，然后继续培养2天‑5天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。本发明根据药用真菌桑黄液体发酵产物金丝桃苷合成代谢途径的特点，通过青顶拟多孔菌先利用碳源进行生长，生成中间产物，然后再加入桑黄液体菌种，通过桑黄的液体发酵将青顶拟多孔菌产生的中间产物转化成所需的代谢终产物，大幅度提高桑黄菌丝体中金丝桃苷含量。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法。
背景技术
桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。
由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。采用桑黄液体发酵的方法生产桑黄药用活性成分因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。目前，国内外对桑黄菌丝体培养生产活性药用成分研究和工艺应用主要集中在发酵条件及产物提取分离等层面上，整体发酵水平不高。
桑黄液体发酵产物中含有金丝桃苷，金丝桃苷属黄酮醇苷类化合物，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，广泛存在于滕黄科、豆科、杜鹃花科和卫矛科等多种植物中，具有保护心血管系统、保护胃黏膜、抗炎等多种生理活性，是一种重要的天然产物(林萍，易宏伟，张斐.金丝桃苷药理作用研究进展[J].中国现代中药，2012,14(10)：23-25.)。
目前，针对提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法的研究国内外尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法，该方法操作简便，易于工业化生产。
本发明采用的技术方案是：
一种提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法，包括步骤：
(1)桑黄液体种子液的制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加马褂木提取物的液体种子培养基中培养3天-7天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：将活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于液体种子培养基中培养3天-7天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积1％-10％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度22℃-30℃的条件下培养1天-4天后，将温度调为25℃-29℃，接入占发酵培养基体积5％-20％的桑黄液体种子液，然后继续培养2天-5天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
本发明根据药用真菌桑黄液体发酵产物金丝桃苷合成代谢途径的特点，通过青顶拟多孔菌先利用碳源进行生长，生成中间产物，然后再加入桑黄液体菌种，通过桑黄的液体发酵将青顶拟多孔菌产生的中间产物转化成所需的含金丝桃苷的代谢终产物，大幅度提高桑黄菌丝体中金丝桃苷含量。
所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
所述的青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)是一种木腐真菌，可利用自身分泌的木质素降解酶系及独特的作用方式降解有机物。所述的青顶拟多孔菌菌种可采用任意一种青顶拟多孔菌菌种，可采用市售产品，例如北京北纳创联生物技术研究院生产的青顶拟多孔菌菌种。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为1g-10g。
所述的马褂木提取物可以选用市售产品，也可以采用现有方法制备；优选以马褂木叶为原料制备的马褂木提取物，进一步优选由马褂木叶乙醇提取物和马褂木叶水提物组成的马褂木提取物，可采用以下制备方法制备的马褂木提取物，包括：称取一定量的马褂木叶，粉碎(优选过40目-100目)，先加占马褂木叶重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为60％-80％的乙醇水溶液在60℃-80℃浸提1h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的马褂木叶残渣加入占马褂木叶重量10倍量-20倍量的水在85℃-95℃下浸提1h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得马褂木提取物。
步骤(1)中，所述的活化后的桑黄菌种在添加马褂木提取物的液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中接入2cm2-5cm2大小的活化后的桑黄菌种菌块。
步骤(2)中，所述的活化后的青顶拟多孔菌菌种在液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L液体种子培养基中接入2cm2-5cm2大小的活化后的青顶拟多孔菌菌种菌块。
本发明中，菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的桑黄菌种或青顶拟多孔菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃-30℃，培养时间4天-10天，得到活化后的桑黄菌种或活化后的青顶拟多孔菌菌种。
所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO41g和MgSO40.5g，用水定容至1000mL。
步骤(3)中，所述的发酵培养基的组成为：以1L发酵培养基计，葡萄糖20g、蛋白胨4g、麦麸5g、谷氨酸0.5g-5g、KH2PO41.5g、MgSO40.75g和余量的水。
本发明，所述的桑黄发酵产物经过后续的分离处理可以从桑黄菌丝体中提取、测定金丝桃苷含量。所述的分离处理为本领域常规的分离方法，例如包括：可将所述的桑黄发酵产物用纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取、测定金丝桃苷含量。具体的提取步骤包括：将菌丝体用水冲洗干净，在55℃-65℃干燥至恒重，按原料克数与溶剂毫升数之比为1:10-30加入质量百分浓度70％-80％的乙醇水溶液进行回流提取，直至回流液无色为止，提取物浓缩后得到含金丝桃苷的提取物。
本发明所用的培养基均需灭菌、冷却后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
马褂木，拉丁学名：Liriodendron chinense(Hemsl.)Sarg.(《Flora of China》)，又名：鹅掌楸、双飘树；为木兰科鹅掌楸属落叶大乔木，叶大，形似马褂，故有马褂木之称，是中国特有的珍稀植物。高达40米，胸径1米以上，小枝灰色或灰褐色。叶形如马褂，叶片的顶部平截，犹如马褂的下摆；叶片的两侧平滑或略微弯曲，好像马褂的两腰；叶片的两侧端向外突出，仿佛是马褂伸出的两只袖子。
本发明与已有技术相比有如下优点：
1.本发明根据药用真菌桑黄液体发酵产物金丝桃苷合成代谢途径的特点，通过青顶拟多孔菌先利用碳源进行生长，生成中间产物，然后再加入桑黄液体菌种，将青顶拟多孔菌产生的中间产物转化成所需的终产物，大幅度提高桑黄金丝桃苷含量，可达到1.85mg/g，提取的金丝桃苷可用于食品、医药工业中。
2.本发明所采用的桑黄菌丝体液体发酵方法简单，重复性好，发酵周期短，效率高，同时利用天然产物作为生产原料，环保无毒，成本低。整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产和应用推广。
3.本发明方法同样适用于发酵罐规模化生产，具有很好的工业化应用前景。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
青顶拟多孔菌菌种，北京北纳创联生物技术研究院生产。
实施例1
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25℃，培养时间7天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
将斜面保藏的青顶拟多孔菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25℃，培养时间7天，得到活化后的青顶拟多孔菌菌种菌块。
马褂木提取物的制备方法，包括：称取一定量的马褂木叶，粉碎过100目，先加占马褂木叶重量13倍量的质量百分浓度为70％的乙醇水溶液在60℃浸提1.0h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的马褂木叶残渣加入占马褂木叶重量10倍量的蒸馏水在85℃下浸提1h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得马褂木提取物。
1L液体种子培养基组成为：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麦麸5g/L、谷氨酸2.5g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
二、桑黄液体发酵产物的制备
(1)桑黄液体种子液的制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为8g，25℃培养4天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：取2cm2大小活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于1L液体种子培养基中，25℃培养4天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积5％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度26℃的条件下培养2天后，将温度调为28℃，接入占发酵培养基体积10％的桑黄液体种子液，然后继续培养4天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
三、测定
1.菌丝生物量的测定：桑黄液体发酵产物经8层纱布过滤，过滤所得菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60℃烘箱中烘干至恒重，即为样品，称重。
2.金丝桃苷含量测定：精密称取5g样品，用滤纸包好，放入索氏提取器，100mL质量百分浓度70％的乙醇水溶液，回流提取6h，直至回流液无色为止。70℃减压旋蒸浓缩，得到含金丝桃苷的提取物，用甲醇定容于25mL容量瓶中，待测，分析前用0.45μm滤膜滤过。
高效液相色谱条件：色谱柱：Nova-Pak C18色谱柱(3.9mm×150mm,5μm)；柱温50℃，进样20μL；流动相:A相为质量百分浓度0.4％的磷酸水溶液，B-乙腈/甲醇(1:1，体积比)，流速1mL/min；梯度洗脱:0-15min，B由16％线性改变到23％，15-30min，B由23％线性改变到36％，至30min停止洗脱，DAD检测(360nm)。
标准曲线的制备：精密称取金丝桃苷标准品11.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容，制成浓度为1.1mg/mL金丝桃苷储备液。精密吸取上述储备液0.1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，制成浓度为11.0μg/mL的金丝桃苷溶液。精密吸取该浓度溶液适量，逐级稀释，配成浓度依次为:0.275,0.55,1.10,2.75,5.50μg/mL的金丝桃苷标准品溶液。按照上述色谱条件，分别将标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中进行测定，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。
检测结果见表1。
实施例2
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度28℃，培养时间9天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
将斜面保藏的青顶拟多孔菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度27℃，培养时间8天，得到活化后的青顶拟多孔菌菌种菌块。
马褂木提取物的制备方法，包括：称取一定量的马褂木叶，粉碎过60目，先加占马褂木叶重量16倍量的质量百分浓度为80％的乙醇水溶液在80℃浸提2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的马褂木叶残渣加入占马褂木叶重量20倍量的蒸馏水在95℃下浸提2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积5倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得马褂木提取物。
1L液体种子培养基组成为：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麦麸5g/L、谷氨酸5g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
二、桑黄液体发酵产物的制备
(1)桑黄液体种子液的制备：取5cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为10g，28℃培养5天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：取3cm2大小活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于1L液体种子培养基中，29℃培养6天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积8％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度28℃的条件下培养3天后，将温度调为29℃，接入占发酵培养基体积15％的桑黄液体种子液，然后继续培养3天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
三、测定
1.菌丝生物量的测定：桑黄液体发酵产物经8层纱布过滤，过滤所得菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置65℃烘箱中烘干至恒重，即为样品，称重。
2.金丝桃苷含量测定：精密称取5g样品，用滤纸包好，放入索氏提取器，100mL质量百分浓度70％的乙醇水溶液，回流提取6h，直至回流液无色为止。70℃减压旋蒸浓缩，得到含金丝桃苷的提取物，用甲醇定容于25mL容量瓶中，待测，分析前用0.45μm滤膜滤过。
高效液相色谱条件：色谱柱：Nova-Pak C18色谱柱(3.9mm×150mm,5μm)；柱温50℃，进样20μL；流动相:A相为质量百分浓度0.4％的磷酸水溶液，B-乙腈/甲醇(1:1，体积比)，流速1mL/min；梯度洗脱:0-15min，B由16％线性改变到23％，15-30min，B由23％线性改变到36％，至30min停止洗脱，DAD检测(360nm)。
标准曲线的制备：精密称取金丝桃苷标准品11.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇超声溶解并定容，制成浓度为1.1mg/mL金丝桃苷储备液。精密吸取上述储备液0.1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，制成浓度为11.0μg/mL的金丝桃苷溶液。精密吸取该浓度溶液适量，逐级稀释，配成浓度依次为:0.275,0.55,1.10,2.75,5.50μg/mL的金丝桃苷标准品溶液。按照上述色谱条件，分别将标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中进行测定，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。
检测结果见表1。
实施例3
一、材料准备
PDA平板培养基同实施例1。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间4天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
将斜面保藏的青顶拟多孔菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间4天，得到活化后的青顶拟多孔菌菌种菌块。
马褂木提取物的制备方法，包括：称取一定量的马褂木叶，粉碎过40目，先加占马褂木叶重量10倍量的质量百分浓度为60％的乙醇水溶液在70℃浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的马褂木叶残渣加入占马褂木叶重量15倍量的蒸馏水在90℃下浸提1.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积4倍量的无水乙醇，5000rpm离心10min收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得马褂木提取物。
1L液体种子培养基组成为：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麦麸5g/L、谷氨酸4g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
二、桑黄液体发酵产物的制备
(1)桑黄液体种子液的制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为6g，22℃培养6天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：取5cm2大小活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于1L液体种子培养基中，22℃培养6天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积3％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度24℃的条件下培养3天后，将温度调为26℃，接入占发酵培养基体积8％的桑黄液体种子液，然后继续培养3天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
三、测定同实施例1。检测结果见表1。
实施例4
一、材料准备
PDA平板培养基同实施例1。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
将斜面保藏的青顶拟多孔菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，得到活化后的青顶拟多孔菌菌种菌块。
马褂木提取物同实施例1。
1L液体种子培养基组成为：葡萄糖8g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麦麸5g/L、谷氨酸1.5g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
二、桑黄液体发酵产物的制备
(1)桑黄液体种子液的制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为1g，30℃培养3天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：取2cm2大小活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于1L液体种子培养基中，30℃培养3天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积1％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度30℃的条件下培养1天后，将温度调为25℃，接入占发酵培养基体积5％的桑黄液体种子液，然后继续培养2天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
三、测定同实施例1。检测结果见表1。
实施例5
一、材料准备
PDA平板培养基同实施例1。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间9天，得到活化后的桑黄菌种菌块。
将斜面保藏的青顶拟多孔菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间9天，得到活化后的青顶拟多孔菌菌种菌块。
马褂木提取物同实施例1。
1L液体种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量的水，pH自然。
1L发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨4g/L、麦麸5g/L、谷氨酸0.5g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.75g/L和余量的水。
二、桑黄液体发酵产物的制备
(1)桑黄液体种子液的制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为5g，20℃培养7天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：取2cm2大小活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于1L液体种子培养基中，20℃培养7天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积10％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度22℃的条件下培养4天后，将温度调为25℃，接入占发酵培养基体积20％的桑黄液体种子液，然后继续培养5天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。
三、测定同实施例1。检测结果见表1。
对比例1
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量为水。pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：取2cm2大小实施例1中活化后的桑黄菌种接入灭菌冷却后的1L液体种子培养基中，25℃，120r/min下摇床培养4天，得到培养好的种子液。
(2)摇瓶发酵培养
发酵培养基同实施例1。pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液按占发酵培养基体积10％的接种量接入发酵培养基中，在25℃，120r/min摇床中培养12天。每个试验设3个平行。
检测结果见表1。
对比例2 仅添加马褂木提取物，不使用青顶拟多孔菌
除了“二、桑黄液体发酵产物的制备(1)桑黄液体种子液的制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L添加马褂木提取物的液体种子培养基中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为5g，20℃培养7天，得桑黄液体种子液；(3)液体发酵培养：向发酵培养基中接入占发酵培养基体积20％的桑黄液体种子液，温度25℃培养5天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。”之外，其余操作同实施例5。检测结果见表1。
对比例3 仅使用青顶拟多孔菌，不添加马褂木提取物
除了“二、桑黄液体发酵产物的制备(1)桑黄液体种子液的制备：取2cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L液体种子培养基中，20℃培养7天，得桑黄液体种子液；(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：取2cm2大小活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于1L液体种子培养基中，20℃培养7天，得青顶拟多孔菌液体种子液；(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积10％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度22℃的条件下培养4天后，将温度调为25℃，接入占发酵培养基体积20％的桑黄液体种子液，然后继续培养5天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物。”之外，其余操作同实施例5。检测结果见表1。
表1 桑黄液体发酵代谢产物含量检测结果
注：与对比例1比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01；
与对比例2比较，*：P<0.05；**：P<0.01；
与对比例3比较，#：P<0.05；##：P<0.01。
由表1的数据显示，本发明根据药用真菌桑黄液体发酵产物金丝桃苷合成代谢途径的特点，通过青顶拟多孔菌先利用碳源进行生长，生成中间产物，然后再加入桑黄液体菌种，将青顶拟多孔菌产生的中间产物转化成所需的终产物，大幅度提高桑黄金丝桃苷含量
与对比例1中的常规培养方法相比，采用本发明方法液体发酵培养的桑黄代谢产物中菌丝体中金丝桃苷含量提高了39.7％-46.8％。
在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响桑黄液体发酵代谢产物金丝桃苷含量的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现桑黄液体发酵代谢产物金丝桃苷含量的提高。在此不再赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种提高桑黄液体发酵产物中金丝桃苷含量的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)桑黄液体种子液的制备：将活化后的桑黄菌种接种于添加马褂木提取物的液体种子培养基中培养3天-7天，得桑黄液体种子液；
(2)青顶拟多孔菌种子液的制备：将活化后的青顶拟多孔菌菌种接种于液体种子培养基中培养3天-7天，得青顶拟多孔菌液体种子液；
(3)液体发酵培养：向发酵培养基中先接入占发酵培养基体积1％-10％的青顶拟多孔菌液体种子液，在温度22℃-30℃的条件下培养1天-4天后，将温度调为25℃-29℃，接入占发酵培养基体积5％-20％的桑黄液体种子液，然后继续培养2天-5天，终止发酵后，得到桑黄液体发酵产物；
所述的马褂木提取物由马褂木叶醇提取物和马褂木叶水提物组成；称取一定量的马褂木叶，粉碎，先加占马褂木叶重量10倍量-16倍量的质量百分浓度为60％-80％的乙醇水溶液在60℃-80℃浸提1h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩后真空冷冻干燥得提取物Ⅰ；上述醇提后的马褂木叶残渣加入占马褂木叶重量10倍量-20倍量的水在85℃-95℃下浸提1h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩至1/4体积后加入浓缩物体积2倍量-5倍量的无水乙醇，离心收集沉淀物，沉淀物真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ，合并上述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得马褂木提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，每升液体种子培养基中马褂木提取物的添加量为1g-10g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的发酵培养基的组成为：以1L发酵培养基计，葡萄糖20g、蛋白胨4g、麦麸5g、谷氨酸0.5g-5g、KH2PO41.5g、MgSO40.75g和余量的水。
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