CN103125353B - 一种提高栽培中药材抗病性的生物防治方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及“一种提高栽培中药材抗病性的生物防治方法”，该方法采用丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizas，AMF)作为生防菌，通过在中药材栽培之前进行菌根化苗处理来提高栽培中药材的抗病性。按照本发明的公开方法进行丹参的栽培试验，结果表明AMF能提高四年连作丹参的抗病性，提高四年连作丹参药材的产量和质量。本发明采用自然界与植物共生的AMF作为生防菌，其不仅能够提高栽培中药材的抗病性，同时能够促进栽培中药材的生长，提高栽培中药材的品质，改善土壤微生态平衡，是一种新型绿色环保的生物防治方法。
Description
技术领域
本发明涉中药材栽培及病虫害生物防治，属于中药农业领域。
背景技术
根腐病是中药材生长发育期的主要土传病害之一。特别是根和根茎类中药材根腐病病害问题日益突出。三七、丹参、当归、川芎、黄芪、厚朴、麦冬、柴胡、白术、板蓝根、党参、黄芩、远志、紫苑、麻黄、附子、太子参、半夏、苍术等多种中药材在栽培过程中都易发生根腐病。根腐病严重影响中药材的产量和质量。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)，俗称活血根，是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物，年需求量15000吨左右，是栽培面积较大的药材之一，其主要栽培地区为四川、陕西和山东。本课题组对山东莱芜栽培丹参病害进行调查，发现根腐病的发生率随着栽培年限逐年提高，栽培三年或者三茬丹参根腐病的发生率达到了60％-70％。叶鹏盛等对四川省丹参根腐病发生情况进行调查，表明田间的发病株率一般为10％-30％，平均为16.9％，重病田为54.8％以上。张辰露等对陕西商洛丹参病害进行连续调查，表明连作加剧地下部根腐病的发生，头茬地块发病率为22％左右，2～4年连作地块的发病率都高于61％。丹参根腐病传播蔓延较快，感病后的丹参植株长势衰弱，严重时地上部枯死，根的木质部完全腐烂成黑褐色，产量显著降低，并且外观性状也不符合药用要求。目前对对根腐病的防治目前主要采用化学农药，但是化学防治目前只对少数土传病害有效，对大多数病害防效甚微，且使用化学农药还会造成农药残留，环境污染；同时化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，因而导致防效下降甚至失败。
菌根是土壤中的一类真菌与宿主植物根系建立的互惠共生体。世界上80％的植物都是菌根植物，其中丛枝菌根(arbuscular mycorrhizas，AM)约占三分之二。目前，AM真菌(AMF)是微生态领域研究的热点内容，主要应用在农、牧、林、矿业等方面。AMF可通过参与植物许多种生理生化代谢过程，对植物有多方面有益作用。例如AM能够促进植物生根，提高移栽成活率；提高植物抗逆性，减轻土传病害的发生；促进植物根系对矿质养分的吸收，特别是促进植物对磷和微量元素等难溶性物质吸收；提高植物生物量及作物品质；一定程度上减轻作物的连作障碍。AM作为一项绿色环保的生物技术对中药材栽培具有普遍指导意义。
目前虽然AM真菌在土壤生态修复方面应用比较广泛，但是在抗栽培中药材病害的方面相关的研究还处于起步阶段。利用AM菌来提高栽培丹参抗病性的相关研究未见报道。通过本项目的研究可提高栽培丹参的抗病性，有效地缓解栽培中药材根腐病，提高栽培中药材的产量和品质。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种利用丛枝菌根真菌(AMF)菌剂接种提高栽培中药材抗病性的方法，用于药材的田间种植的病害防治。
其方法包括如下步骤：
1)幼苗获得：采用药用植物种子经70-80％乙醇灭菌1-2min，8-15％过氧化氢灭菌5-15min，在灭菌蛭石盘中生长20-40d；或用组织培养苗，无菌蛭石盘炼苗20-40d；
2)接种：在幼苗根边刨开侧沟，加入AMF菌剂，每盘30-50g；
3)侵染：将接种菌剂的幼苗在无污染、正常生长条件下培养20-40d；
4)菌根化幼苗检查：在侵染开始20-40d后，用显微镜，0.05％曲立苯蓝测定进行侵染强度的评价，侵染率大于60％以上的幼苗即为菌根化幼苗；
5)菌根化幼苗的大田栽培：将菌根化幼苗移栽到田间进行栽培。
其中所述药用植物是丹参。
其方法优选为：
1)幼苗获得：采用药用植物种子经75％乙醇灭菌1min，10％过氧化氢灭菌10min，在灭菌蛭石盘中生长30d；或用组织培养苗，无菌蛭石盘炼苗30d。
2)接种：在幼苗根边刨开侧沟，加入AMF菌剂，每盘30-50g。
3)侵染：将接种菌剂的幼苗在无污染、正常生长条件下培养30d。
4)菌根化幼苗检查：在侵染开始30d后，用显微镜，0.05％曲立苯蓝检测菌丝，成功侵染的即为菌根化幼苗。
附图说明
图1AM菌)对丹参根腐病发病率的影响图
图2AM菌对丹参地上、地下鲜重的影响图
图3AM菌对丹参地上、地下干重的影响图
图4AM菌对丹参小区产量的影响图
图5AM菌对丹参根脂溶性成分的影响图
图6AM菌对丹参根水溶性成分的影响
具体实施方式
实施案例1：AM菌对栽培丹参病害的影响
1、试验材料：白花丹参种子、AM真菌Glomus intraradices(GI)、Glomus mosseae(GM)
2、试验方法：
2.1菌根化苗的生产
1)幼苗获得：采用药用植物种子经75％乙醇灭菌1min，10％过氧化氢灭菌10min，在灭菌蛭石盘中生长30d；或用组织培养苗，无菌蛭石盘炼苗30d。
2)接种：在幼苗根边刨开侧沟，加入AMF菌剂，每盘30-50g。
3)侵染：将接种菌剂的幼苗在无污染、正常生长条件下培养30d。
4)菌根化幼苗检查：在侵染开始30d后，用显微镜，0.05％曲立苯蓝检测菌丝，侵染率达到60％-100％的幼苗即为菌根化幼苗。
2.2大田试验
将丹参的AM菌根化苗(分别采用GI和GM菌根化)在山东莱芜白花丹参基地四年连作上按照实际生产的方式进行栽培，同时设置空白对照。每个处理选取3次重复，每个重复的小区面积为2×4m2，每个小区移栽丹参菌根化幼苗50株。在11月份丹参药材收获时进行病害发生率统计，每个地块随机选取10株健康丹参植株测定丹参的生物量(地上和地下部分鲜重，地上和地下部分干重，计算小区产量)以及药材中的有效成分含量。
2.3丹参药材有效成分的测定
(1)脂溶性成分的测定
脂溶性成分的提取：
供试品溶液的制备：精确称取样品0.1g，放入具塞三角瓶中，加入10ml甲醇一二氯甲烷(1∶3，v/v)的提取溶剂，超声提取30min，取出放冷，用提取溶剂补重，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，4℃保存备用。
对照品储备液的制备：精密称取适量的二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参新酮、丹参酮IIA对照品于容量瓶中，甲醇-二氯甲烷(1∶3，v/v)溶解并定容，分别配得0.098mg/mL、0.102mg/mL、0.120mg/mL、0.152mg/mL、0.89mg/mL的对照品溶液。
色谱条件：
色谱柱：Water symmetry C18(150mm×3.9mm，5um)色谱柱；流动相：水.甲醇(3∶7，v/v)；系统进行等度洗脱，检测波长270nm，流速0.8mL/min，柱温25℃，进样量5ul。
(2)水溶性成分的测定
供试品溶液的制备：精确称取样品0.1g，放入具塞三角瓶中，精密加入20mL甲醇一水(3∶1，v/v)溶剂，称重，超声提取30min，取出放冷，用提取溶剂补重，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，4℃保存备用。
对照品储备液的制备：精密称取一定量的迷迭香酸、丹酚酸B对照品于容量瓶中，用甲醇一水(3∶1，v/v)溶解并定容，配得浓度为0.182mg/mL和0.189mg/mL的对照品溶液，4℃保存备用。
色谱条件：
色谱柱：AgilentXDB-C18色谱柱(150min×4.6mm，5μm)；检测波长：280nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：5μL。洗脱条件见下表所示。把供试品溶液和对照品溶液分别注入Waters液相系统中，所得数据经Waters工作站处理，按标准曲线法计算含量。
表丹参水溶性成分的洗脱条件
3、试验结果：
3.1AM菌对发病率的影响：采用SPSS软件对试验结果进行统计分析，结果表明，AM菌GI和GM都极显著(P＜0.01)地减轻丹参根腐病的发病率，试验结果见图1。
3.2AM菌对药材产量的影响：采用SPSS软件对试验结果进行统计分析，结果表明AM菌GI和GM能显著提高四年连作丹参地上部分鲜重和干重、地下部分鲜重和干重、小区产量，见图
2、图3、图4。其中对于地上部分鲜重和干重，GI提高了40.6％和29.8％，GM提高了51.1％和34.2％；对于地下部分鲜重和干重，GI提高了29.1％和39.1％，GM提高了21.3％和36.6％；对于小区产量，GI提高了40.6％和29.8％，GM提高了51.1％和34.2％.
3.2AM菌对丹参药材质量的影响：统计分析表明AM菌不会影响丹参植物中脂溶性成分的含量(见图5)。虽然从图可以看出AM菌GI提高丹参植物根中脂溶性成分，其中对隐丹参酮提高17％，丹参新酮提高了23.2％，但是采用SPSS软件进行统计，其P＞0.05没有显著差异。AM菌GM能提供丹参根中丹酚酸B的含量，AM菌GI不会影响丹参植物中水溶性成分的含量(见图6)。
Claims (2)
1.一种提高栽培丹参抗病性的生物防治方法，其特征在于：对栽培丹参进行丛枝菌根真菌菌根化，其方法包括如下步骤：
1)幼苗获得：采用药用植物种子经70-80％乙醇灭菌1-2min，8-15％过氧化氢灭菌5-15min，在灭菌蛭石盘中生长20-40d；或用组织培养苗，无菌蛭石盘炼苗20-40d；
2)接种：在幼苗根边刨开侧沟，加入AMF菌剂，每盘30-50g；
3)侵染：将接种菌剂的幼苗在无污染、正常生长条件下培养20-40d；
4)菌根化幼苗检查：在侵染开始20-40d后，用显微镜，0.05％曲立苯蓝测定进行侵染强度的评价，侵染率大于60％-100％以上的幼苗即为菌根化幼苗；
5)菌根化幼苗的大田栽培：将菌根化幼苗移栽到按照实际生产的方式田间进行栽培。
2.根据权利要求1的提高栽培丹参抗病性的方法，其中所述药用植物是丹参，其方法包括如下步骤：
1)幼苗获得：采用药用植物种子经75％乙醇灭菌1min，10％过氧化氢灭菌10min，在灭菌蛭石盘中生长30d；或用组织培养苗，无菌蛭石盘炼苗30d；
2)接种：在幼苗根边刨开侧沟，加入AMF菌剂，每盘30-50g；
3)侵染：将接种菌剂的幼苗在无污染、正常生长条件下培养30d；
4)菌根化幼苗检查：在侵染开始30d后，用显微镜，0.05％曲立苯蓝测定进行侵染强度的评价，侵染率60％-100％以上的幼苗即为菌根化幼苗；
5)菌根化幼苗的大田栽培：将菌根化幼苗移栽到田间按照实际生产的方式进行栽培。
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