CN102659746A - 一种臭椿花提取物与其活性成分短叶苏木酚的制备方法及应用 - Google Patents
一种臭椿花提取物与其活性成分短叶苏木酚的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种臭椿花提取物与其活性成分短叶苏木酚的制备方法及应用,根据我们对臭椿花进行的化学成分研究,制备了臭椿花提取物和总异香豆素活性部位,并且分离得到三个环戊酮异香豆素,包括短叶苏木酚、短叶苏木酚酸与短叶苏木酚酸甲酯。生物活性研究显示它们具有显著的抗氧化、抗炎与抗肿瘤作用。实验结果表明臭椿花提取物(包括有效部位)与活性化合物臭椿花素可用于制备抗氧化、抗炎与抗肿瘤等相关疾病方面的药品、保健品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药(包括生物农药)技术领域,是以臭椿(Ailanthusaltissima(Mill.)Swingle)的花为原料制备的提取物与活性化合物及其它们在医药、保健方面的应用。
背景技术
臭椿(Ailanthus altissima(Mill.)Swingle)原名樗,又名椿树和木砻树,因叶基部腺点发散臭味而得名,属于苦木科,是一种落叶树。它原产于中国东北部、中部和台湾。生长在气候温和的地带。这种树木生长迅速,可以在25年内达到15米的高度。臭椿属共约10~15种,主产亚洲东南部。中国有6种3变种1变型。落叶乔木,树高可达30米,胸径1米以上,树冠呈扁球形或伞形。树皮灰白色或灰黑色,平滑,稍有浅裂纹,枝条粗壮。叶痕大,倒卵形,中上部全缘,近基部有1-2对粗锯齿,齿顶有腺点,内具9个维管束痕。奇数羽状复叶,互生,小叶近基部具少数粗齿,卵状披针形,叶总柄基部膨大,齿端有1腺点,有臭味。雌雄同株或雌雄异株。圆锥花序顶生,花小,杂性,白绿色,花瓣5~6,雄蕊10。翅果,有扁平膜质的翅,长椭圆形,种子位于中央。
中药文献记载,臭椿有“小毒”,只供煎汤外洗使用。臭椿的根皮和茎皮入药,称为椿白皮,为我国药典收载,具有清热燥湿、止血和杀虫的功效。臭椿的果实又称凤眼草,是我国民间常用的中草药,与椿白皮的功效基本相同。研究表明,椿白皮的提取物具有抗疟疾、抗炎、抗病毒和抗癌的作用。臭椿的树皮与果实中含有苦木苦味素类和生物碱类活性成分。
臭椿又是我国作为生物农药利用的植物资源。叶片的浸出液可作土农药用于防治蚜虫、粘虫与菜青虫等农业害虫。臭椿皮、叶与果实的提取物作为生物农药的应用已有文献和专利报道。
臭椿花作为一种可再生的天然植物资源,其化学成分与生物活性国内外尚未有文献报道。我们对臭椿花进行了提取分离,得到了其总提取物、总异香豆素活性部位和三个含量高的代表性活性成分短叶苏木酚、短叶苏木酚酸与短叶苏木酚酸甲酯(其中以短叶苏木酚的含量为最高),并且对它们进行了抗氧化、抗炎与抗肿瘤的活性实验,显示出显著的效果。
发明内容
本发明的技术任务是解决现有技术的不足,提供一种臭椿花提取物与其活性成分短叶苏木酚的制备方法及应用。
本发明的技术方案是按以下方式实现的,包括1)臭椿花提取物;2)臭椿花提取物中含有总异香豆素活性部位的提取;其中:
总异香豆素活性部位,包括短叶苏木酚、短叶苏木酚酸和短叶苏木酚酸甲酯为代表的一类异香豆素类化合物,他们的分子结构式如下:
1)臭椿花提取物的制备,直接利用臭椿的花序为原料通过传统溶剂提取工艺得到其提取物;臭椿花提取物的制备步骤如下:
利用传统溶剂提取工艺对臭椿花进行提取,提取液减压浓缩制得臭椿花总提取物稠膏备用;
2)臭椿花提取物总异香豆素活性部位的提取步骤如下:
将步骤1)得到的稠膏,加适量水进行水沉,上清液经过大孔吸附树脂柱吸附,洗脱液进行梯度洗脱,至洗脱液显示出盐酸镁粉反应时为止,合并洗脱液,减压回收至干,得到臭椿花总异香豆素活性部位;
步骤1)、2)中所使用的提取溶剂包括:水、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯,提取方法包括加热回流、浸渍提取、渗漉提取与超声提取;所述的大孔树脂包括天然产物研究中常用的树脂,包括DM-130、D-101、860021、聚酰胺树脂的分离材料;洗脱液为乙醇-水系统或甲醇-水系统;
3)活性化合物短叶苏木酚的制备方法,制备步骤如下:
取步骤2)得到的臭椿花总异香豆素活性部位,加适量乙醇溶解,粗硅胶拌样,然后经硅胶柱层析,二氯甲烷-甲醇或氯仿-甲醇梯度洗脱,收集9∶1-8∶2(V/V)梯度的含有短叶苏木酚的层析液,回收溶剂,得短叶苏木酚粗品,用甲醇溶解,重结晶,得纯品。
2.臭椿花提取物总异香豆素活性部位在制备抗氧化、抗炎与抗肿瘤相关疾病方面药品和保健品中的应用,其特征在于,所述的抗氧化产品应用是指用于预防和治疗因过氧化所引起的相关疾病;所述的抗炎产品应用是指用于预防和治疗因炎症所引起的相关疾病;所述的抗肿瘤产品应用是指用于预防和治疗因癌细胞病变所引起的相关疾病。
本发明的方法具有以下突出的有益效果:
根据我们对臭椿花进行的化学成分研究,制备了臭椿花提取物和总异香豆素活性部位,并且分离得到三个环戊酮异香豆素,包括短叶苏木酚、短叶苏木酚酸与短叶苏木酚酸甲酯。生物活性研究显示它们具有显著的抗氧化、抗炎与抗肿瘤作用。实验结果表明臭椿花提取物(包括有效部位)与活性化合物臭椿花素可用于制备抗氧化、抗炎与抗肿瘤等相关疾病方面的药品、保健品。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的详述,但本发明不仅仅局限于这些实施例。所用的臭椿花于2011年5月采自山东省济南市。
实施例1.臭椿花提取物的制备
取臭椿的花序,(10Kg,鲜品),切碎,用5倍量(w/v)的95%乙醇进行加热回流提取,提取时间2小时/次,共三次,提取液合并,减压浓缩成浓浸膏状,得臭椿花提取物(380g)。
实施例2.臭椿花提取物中总异香豆素活性部位的制备
实施例1:
取臭椿的花序,(10Kg,鲜品),按照实施例1的提取方法,得到提取物浸膏(约380g),提取物浸膏(300g)用10倍量蒸馏水稀释、溶解,并做澄清处理,取上清液,经DM-130大孔树脂(3.0Kg)吸附,用蒸馏水洗涤大孔树脂柱至颜色较淡,然后以20%乙醇进行洗脱,至洗脱液显示出盐酸镁粉反应时为止,收集此部分洗脱液,减压回收、浓缩成浓浸膏状,得臭椿花提取物总异香豆素活性部位(50g)。
实施例2:
取臭椿的花序,(10Kg,鲜品),切碎,用10倍量(w/v)的5%NaOH溶液渗漉提取,提取液用10%的HCl溶液调节PH值为3-4,放置待沉淀出现(约140g),过滤,沉淀用蒸馏水洗至PH值为6-7,然后用适量甲醇溶解,200g DM-130大孔树脂吸附,挥发掉甲醇,再经DM-130大孔树脂(1.0Kg)柱层析,以20%乙醇进行洗脱,至洗脱液显示出盐酸镁粉反应时为止,收集此部分洗脱液,减压回收、浓缩成浓浸膏状,得臭椿花提取物总异香豆素活性部位(40g)。
实施例3.臭椿花提取物中活性成分短叶苏木酚的制备
取臭椿花提取物总异香豆素活性部位(30g),适量甲醇溶解,100g粗硅胶拌样,用200-300目硅胶500g装柱进行柱层析,CH2CL2-MeOH 9∶1与8∶2的比例进行洗脱,以薄层层析进行检测,收集含有短叶苏木酚的洗脱物,回收溶剂至干,再用甲醇溶解进行重结晶,即得短叶苏木酚的结晶。
实施例4.
臭椿花提取物和活性化合物的抗氧化活性实验
实验材料:
10-2M半胱胺酸,10-3M硫酸亚铁,20%TLA溶液,0.67%TBA溶液,15mg/ml肝微粒体悬液,0.1M PBS溶液,臭椿花提取物和活性化合物(少量DMSO溶解,生理盐水稀释)。
实验方法:
断头法处死动物,速取肝脏,置预冷的生理盐水中清洗,去除结缔组织后称重,以预冷的TMS(Tris 0.05M MgCl2 3M,蔗糖0.2M,HCl调PH=7.4)制备20%匀浆,于4℃10000转/分离心15分钟,取上清液15000转/分离心60分钟,沉淀重新悬于TMS溶液中进行分装,置于-47℃冷冻备用。Lowry法测定蛋白含量。其原理是根据Fe2+-半胱胺酸诱发的肝微粒体脂质过氧化(MDA)的测定。在Fe2+的存在下,体内产生的羟基自由基诱发肝微粒体脂质过氧化生成MDA,当被测药物存在时,羟基自由基被捕获,从而减少MDA的生成,因此测定MDA可以判定被测药物捕获体内自由基的能力,即抗氧化活性的强弱。
实验结果:
臭椿花提取物和活性化合物的抗氧化结果
结果显示,臭椿花提取物和活性化合物在大剂量时显示出显著的抗氧化活性。
实施例5.
臭椿花提取物和活性化合物的抗炎活性实验
通过试验臭椿花提取物和活性化合物对巴豆油致小鼠耳部炎症的影响,考察其抗炎作用。
实验材料:
小鼠,昆明种,雄性,18~22g,按体重随机均分,每组10只。样品用吐温-80助溶后,加生理盐水溶解。巴豆油0.2mL,无水乙醇2mL,乙醚7.8mL,混合均匀成2%巴豆油溶液,备用。
实验方法:小鼠按体重给药,皮下注射给药后半小时后,小鼠左耳涂2%巴豆油液50μL。4小时后处死动物,剪下双耳,用直径为8mm的不锈钢铳子冲下左右耳片,分别称重,以左右耳片重量之差作为肿胀程度,计算对炎症的抑制率。对其中效果显著者进行重复实验。
实验结果:
皮下注射提取物及其活性化合物对巴豆油致小鼠耳部炎症的抑制作用
结果显示,臭椿花提取物和活性化合物显示出显著的抗炎活性。
实施例6.
臭椿花提取物和活性化合物的抗肿瘤活性实验
实验材料:
臭椿花乙醇提取物及总异香豆素部位、单体化合物,用DMSO配制。MTT(四甲基偶氮唑盐):Serva公司生产,用新鲜的RRMI 1640培养液配制。体外培养HCT-8,Bel-7402,A549和A2780细胞株。
实验方法:
采用含有10%牛胎血清、100U/mL青霉素和100mg/L的RRMI 1640培养基,将细胞在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中传代培养,实验选用对数生长期细胞。取对数生长期细胞,消化后充分吹打成单细胞悬液,计数后稀释成1×104cell/ml,接种于96孔培养板中,100μL/孔。每一样品设4-5个浓度级别,然后加入100μL不同浓度的样品,每一浓度设3个平行组。对照组加入等体积溶剂。将96孔培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养96h后,弃去培养液,每孔加入新鲜配置的含0.20mg/ml MTT的无血清培养基,37℃下继续培养4h后,离心,除去上清夜。加入150μL DMSO溶解Formazan沉淀,置微量震荡器上震荡5min使其充分溶解。在MR700型酶标仪上测定570nm处的光密度值。按下列公式计算肿瘤细胞生成抑制率,再以药物浓度对肿瘤细胞生成抑制率作图得到剂量曲线,从曲线上读取药物的半数抑制浓度(IC50)值。
实验结果:
臭椿花提取物和活性化合物的体外抗肿瘤活性筛选结果
aPositive control.
结果显示,臭椿花提取物和活性化合物,皆显示出显著的抗肿瘤活性。
除本发明的说明书公开的技术特征外均为本专业技术人员的公职技术。
Claims (2)
1.臭椿花活性成分短叶苏木酚的制备方法,其特征在于,包括1)臭椿花提取物;2)臭椿花提取物中含有总异香豆素活性部位的提取;其中:
总异香豆素活性部位,包括短叶苏木酚、短叶苏木酚酸和短叶苏木酚酸甲酯为代表的一类异香豆素类化合物,他们的分子结构式如下:
1)臭椿花提取物的制备,直接利用臭椿的花序为原料通过传统溶剂提取工艺得到其提取物;臭椿花提取物的制备步骤如下:
利用传统溶剂提取工艺对臭椿花进行提取,提取液减压浓缩制得臭椿花总提取物稠膏备用;
2)臭椿花提取物总异香豆素活性部位的提取步骤如下:
将步骤1)得到的稠膏,加适量水进行水沉,上清液经过大孔吸附树脂柱吸附,洗脱液进行梯度洗脱,至洗脱液显示出盐酸镁粉反应时为止,合并洗脱液,减压回收至干,得到臭椿花总异香豆素活性部位;
步骤1)、2)中所使用的提取溶剂包括:水、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯,提取方法包括加热回流、浸渍提取、渗漉提取与超声提取;所述的大孔树脂包括天然产物研究中常用的树脂,包括DM-130、D-101、860021、聚酰胺树脂的分离材料;洗脱液为乙醇-水系统或甲醇-水系统;
3)活性化合物短叶苏木酚的制备方法,制备步骤如下:
取步骤2)得到的臭椿花总异香豆素活性部位,加适量乙醇溶解,粗硅胶拌样,然后经硅胶柱层析,二氯甲烷-甲醇或氯仿-甲醇梯度洗脱,收集9∶1-8∶2(V/V)梯度的含有短叶苏木酚的层析液,回收溶剂,得短叶苏木酚粗品,用甲醇溶解,重结晶,得纯品。
2.臭椿花提取物总异香豆素活性部位在制备抗氧化、抗炎与抗肿瘤相关疾病方面药品和保健品中的应用,其特征在于,所述的抗氧化产品应用是指用于预防和治疗因过氧化所引起的相关疾病;所述的抗炎产品应用是指用于预防和治疗因炎症所引起的相关疾病;所述的抗肿瘤产品应用是指用于预防和治疗因癌细胞病变所引起的相关疾病。
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