CN102000136B - 一种从波棱瓜中提取具有抗菌活性组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所属医药产品研究开发技术领域。本发明请求保护从藏药材波棱瓜子中提取具有抗菌活性组分的方法，该方法是利用溶剂从干燥粉碎的波棱瓜子中通过固液提取法提取出粗提物，浓缩得到浸膏，然后通过脱脂、浓缩、萃取得到具有显著抗菌效果的萃取物，对萃取物进行进一步硅胶柱层析分离，得到有效提取组分。本发明产品对金色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌等4种菌具有不同程度的抑制作用，可开发为天然抗菌剂应用于医药行业，制备出具有抗菌作用的片剂、颗粒剂、胶囊、注射剂、皮肤外用制剂等产品形式，为藏药波棱瓜的开发开拓新领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用溶剂提取、萃取和利用硅胶柱层析从波棱瓜子中提取抗菌有效组分的方法，属于中药技术领域。
背景技术
波棱瓜又名塞季美朵、塞美塞古(Herpetosperm umpedunculosum Baill1)，为葫芦科波棱瓜属一年生攀援状藤本植物，在西藏主要分布于藏东南地区海拔2600～3000m的山坡林缘及村寨等附近。波棱瓜子为葫芦科植物波棱瓜的干燥种子，味苦，性寒，具有清热解毒，柔肝泻肝火，解胆热胆毒的功效，用于治疗赤巴病，肝病，胆病以及消化不良。《晶珠本草》载：“波棱瓜子性凉、锐，治赤巴人脏腑。现代著作《中药大辞典》、《中华药海》、《中药辞海》、《全国中草药汇编》、《中华本草》、《新华本草纲要》、《中国藏药》、《藏药志》、《部颁药品标准(藏药)》第一册、《中国药典》等均有收载，国家药品标准收载的藏药制剂中，涉及30多个处方使用波棱瓜子。
目前，对于波棱瓜的抗菌活性国内外还未见到报道，因此本发明对波棱瓜子的醇提物，乙酸乙酯萃取部位的有效部位和抗菌活性进行了研究。本发明对金色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌4种菌具有不同程度的抑制作用，可开发为天然抗菌剂应用于医药行业，制备出具有抗菌作用的各种形式的产品，为藏药波棱瓜的开发开拓新领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从波棱瓜子中提取出具有抗菌活性的有效组分的方法。
本发明方法是利用溶剂从干燥粉碎的波棱瓜子中通过固液提取法提取出粗提物，浓缩得到浸膏，然后通过脱脂、浓缩、萃取得到具有显著抗菌效果的萃取物，对萃取物进行进一步硅胶柱层析分离，得到有效提取组分。
具体分为以下步骤：
步骤一：取波棱瓜子，干燥粉碎过，用5-10倍量75%-95%乙醇或甲醇溶液，室温下浸提3-6次；合并滤液，浓缩为浸膏；浓缩可以通过减压浓缩、低温冷冻干燥和喷雾干燥方法。
步骤二：浓缩浸膏悬浮于去离子水中，以石油醚、乙醚等有机溶剂（有机溶剂/去离子水，V/V=1/1~1/4）脱脂至有机溶剂层浅黄色、浅绿色或无色（3-6次）；
步骤三：脱脂后的水层，以乙酸乙酯或氯仿等与水不相混溶的有机溶剂进行萃取（有机溶剂/去离子水，V/V=1/1~1/4），萃取3-6次，合并萃取液，浓缩为浸膏；浓缩可以通过减压浓缩、低温冷冻干燥和喷雾干燥方法。
步骤四：将步骤三中的浸膏进行硅胶柱层析，硅胶柱层析为正相硅胶柱层析；所用流动相正相为石油醚-乙酸乙酯，比例为100:0，100:1,50:1，30:1,20:1,10:1,8:1，5:1，2:1，1:1；以柱体积1/20为一个流分收集，合并各组分层析洗脱液，浓缩得到各个组分，分别编号Fr.1-Fr.10。
将以上提取得到的组分进行抗菌实验，证明它们对金色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌与藤黄微球菌等4种菌有不同程度的抑制作用。
本发明首次报道了波棱瓜子乙酸乙酯提取物具有抗菌活性，并确定了其抗菌的有效部位；本发明所述的波棱瓜子为葫芦科植物波棱瓜的干燥种子。
利用本发明制备得到的有效组分，结合中、西药制药中常规的可药用辅料，可以制备成各种药物组合物，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、皮肤外用制剂等。这些药物组合物可以用于预防或/和治疗肺炎、淋巴结炎、子宫颈炎、盆腔炎等与革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌引起的有关生理改变或疾病，或治疗由沙门氏菌引起的腹泻等疾病。
具体实施方式
实施例1：
取波棱瓜子，干燥粉碎过，用5倍量95%乙醇，室温下浸提3次，每次浸泡时间12小时；合并滤液，减压浓缩为浸膏；将浸膏悬浮于去离子水中，以石油醚（石油醚：水，V/V=1:1）脱脂5次，至石油醚层浅黄色；脱脂后的水层，以乙酸乙酯（V/V=1:1）进行萃取，3次，合并萃取液，减压浓缩为浸膏；浸膏进行硅胶柱层析，硅胶柱层析为正相硅胶柱层析；所用流动相正相为石油醚-乙酸乙酯，比例为100:0，100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，按照洗脱液极性合并流出液，浓缩得到10组分（Fr.1-Fr.10），浓缩液干燥为粉末。
实施例2：
取波棱瓜子，干燥粉碎，用8倍量75%乙醇，室温下浸提4次，每次浸泡时间24小时；合并滤液，减压浓缩为浸膏；将浸膏悬浮于去离子水中，以石油醚（石油醚：水，V/V=1:4）脱脂6次，至石油醚层浅黄绿色；脱脂后的水层，以乙酸乙酯（乙酸乙酯/水，V/V=1/2）进行萃取，6次，合并萃取液，减压浓缩为浸膏；浸膏进行硅胶柱层析，硅胶柱层析为正相硅胶柱层析；所用流动相正相为石油醚-乙酸乙酯，比例为100:0，100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，按照洗脱液极性合并流出液，浓缩得到10个组分（Fr.1-Fr.10），浓缩液干燥为粉末。
实施例3：
取波棱瓜子，干燥粉碎，用10倍量75%甲醇，室温下浸提5次，每次浸泡时间24小时；合并滤液，冷冻干燥浓缩为浸膏；将浸膏悬浮于去离子水中，以乙醚（乙醚/水，V/V=1:2）脱脂5次，至乙醚层浅黄绿色；脱脂后的水层，以氯仿（氯仿/水，V/V=1:1）进行萃取，5次，合并萃取液，减压浓缩为浸膏；浸膏进行硅胶柱层析，硅胶柱层析为正相硅胶柱层析；所用流动相正相为石油醚-乙酸乙酯，比例为100:0，100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，按照洗脱液极性合并流出液，浓缩得到10个组分（Fr.1-Fr.10），浓缩液干燥为粉末。
实施例4
抗菌生物活性筛选试验：
1) 菌种活化：第一次活化：将菌种从-70度冰箱中取出后，置冰盒上自然解冻，用接种环移植到平板上，划线分离得单菌落。挑选单菌落加入装有LB液体培养基的EP管中，适宜温度下培养（细菌30-35°C，48 h，真菌3-28°C，48-72 h）；第二次活化：挑选一活后的菌液，用接种环移植到平板上，划线分离得单菌落。挑选单菌落加入装有LB液体培养基的EP管中，适宜温度下培养。将二活后的菌液永移液枪转移到装有约50mL LB液体培养基中（硫酸链霉素浓度5mg/mL/1000），适宜温度下培养一段时间至菌液较浓。
2) 菌悬液制备：将二活后的供试菌于37℃摇瓶培养12-24 h，血球计数板计数测出菌悬液浓度，并稀释至105 CFU/mL备用。
3) 样品的制备：将6种样品用乙醇配制成约0.005 mg/mL的溶液溶液，硫酸链霉素用蒸馏水配成5 mg/mL的溶液，DMSO助溶。
4) 抗菌圈大小的测定：菌液制备:取实验菌株接种于LB琼脂平板培养基中，35℃培养14h，用LB液体培养基制备菌悬液，菌液浓度1.5×108CFU.mL-1备用。含药物纸片制备：将药物溶解后,灭菌备用。每张纸片(直径6 mm)加药物样品10μl,稀释两个浓度梯度，即一个稀释十倍，一个稀释一百倍。阴性对照是助溶剂,空白对照生理盐水;阳性对照是庆大霉素溶液。一个板上放六个纸片。
5) K-B法：取菌液浓度为1.5 ×108CFU.mL-1的菌株0.2 mL,均匀涂布整块LB培养基表面,室温2-5 min后,贴加含药纸片，置入35℃恒温培养箱培养16～18h，游标卡尺精确测定，其纸片周围抗菌环直径的大小，结果以mm表示，
6) 实验结果
7) 结论：
在3种实施例中，波棱瓜乙酸乙酯提取物各组分对金色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌等4种菌均具有不同程度的抑制作用，其中，Fr. 4-6组分对金色葡萄球菌有强的抑制作用，Fr. 3-5组分对沙门氏菌有强的抑制作用。
本实施方案只是为了说明本发明用，不能作为限制本发明的因素。
Claims (4)
1.一种从波棱瓜子中提取具有抗菌活性组分的方法，其特征在于：利用溶剂从干燥粉碎的波棱瓜子中通过固液提取法提取出粗提物，浓缩得到浸膏，然后通过脱脂、浓缩、萃取得到具有显著抗菌效果的萃取物，对萃取物进行进一步硅胶柱层析分离，得到有效提取组分；
所述固液提取法使用的溶剂为5-10倍量75%-95%乙醇或甲醇溶液；
所述脱脂溶剂采用石油醚或乙醚/去离子水，V/V=1/1~1/4，脱脂至石油醚或乙醚呈浅黄色、浅绿色或无色；
所述萃取是将脱脂后的水层，加入乙酸乙酯或氯仿，乙酸乙酯或氯仿/去离子水，V/V=1/1~1/4，萃取3-6次，合并萃取液；
所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，所用流动相正相为石油醚-乙酸乙酯，比例为100:0，100:1,50:1，30:1,20:1,10:1,8:1，5:1，2:1，1:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：进行固液提取法利用浸提的方法，次数3-6次，每次浸泡时间12-24小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述浓缩是通过减压浓缩、低温冷冻干燥和喷雾干燥。
4.权利要求1所述的方法获得的提取物活性组分在制备对金色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌4种菌具有抑制作用的药品方面的应用。
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