CN108926583A - 浙江腊梅抗微生物感染的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了浙江腊梅提取物抗微生物的用途，具体涉及浙江腊梅植物和浙江腊梅提取物在预防或/和治疗微生物感染的药物中的应用。所述的微生物包括细菌和病毒；所述的细菌包括幽门螺旋杆菌、结核杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等；所述的病毒选自流感病毒、疱疹病毒、肠道病毒、伪狂犬病毒等。
Description
技术领域
本发明具体涉及浙江腊梅植物和浙江腊梅提取物在预防或/和治疗微生物感染的药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
1.浙江腊梅
浙江腊梅为腊梅科腊梅属常绿灌木，仅分布于浙江龙泉。浙江蜡梅(Chimonanthuszhejiangensis M.C.Liu)和柳叶蜡梅(Chimonanthussalici folius S.Y.Hu)、山腊梅(Chimonanthus nitens Oliv.)等为畲族民间习用药,从北宋年间起其干燥叶就作为服用的食凉茶，近千年来用于治疗和预防感冒。现代研究又有进展，其中，山腊梅提取物制备的颗粒制剂，有良好治疗/预防感冒功效，已在市场销售；柳叶蜡梅和浙江腊梅已载入2005和2015年的《浙江省中药炮制规范》，主要成分为挥发油，含有1.8-桉叶素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、榄香醇等40多种成分。传统用途：性味微苦，辛，凉，归肺、脾、胃经，用于治疗伤食所致的痞满症和慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡引起的胃胀、胃痛、泛酸等，还具有降脂、消炎、抗病毒、抗肿瘤、增强人体免疫力等活性，另外还有健脑、减肥、醒酒的保健功效，也用于防治感冒和流行性感冒。药理研究有解热镇痛、抗菌、抗炎、镇咳、增强免疫功能。
2.病毒
2.1流感病毒
流感病毒，属于正粘病毒科，为极易变异的负链RNA病毒，可引起急性呼吸道传染病，即流感。流感病毒主要通过空气飞沫传播，分为甲、乙、丙三型，由于甲型更容易发生变异，流行最为广泛和严重。流感一旦流行，传播快，波及面广，对人民健康和劳动生产力有很大影响，而且对年老体弱多病者及婴幼儿的威胁很大，常因导致并发症而死亡。目前，流感是我国重点监测疾病，在我国《传染病防治法》中列为丙类传染病进行管理。
禽流感(Avian Influenza，AI)，是由甲型流感病毒引起家禽和野禽的一种从呼吸道疾病到严重败血症等多种症状的综合病症。我国农业部已将禽流感列为甲类传染病。在亚洲流行的H5N1型，可以由禽鸟传人，对人有很高的致病性，我国《传染病防治法》中列为乙类传染病进行管理。
长期的流感病人抗病毒药治疗易产生耐药性，另外，由于病毒只能在活细胞生长的特殊性以及流感病毒的亚型变异速度很快，使得化学药物和流感病毒疫苗难以发挥其最佳治疗和预防效果。中医药对流感的治疗，具有独特的疗效，是开发抗流感病毒药物的一种新的尝试。
2.2.疱疹病毒
单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)感染是一种常见的传染病，其感染部位广泛，常发于癌症或其他慢性病应用各种免疫抑制剂的患者中。近年来，HSV发病率急剧增高，严重威胁着人类公共卫生健康。目前，国内外研究的抗病毒药物接近50种，应用到临床治疗全身性感染的仅无环鸟苷有效，但已被发现有耐药株发生。因此，大力开发研制新的低毒、高效的抗病毒药物刻不容缓。中草药来源广泛，现已成为研究热点。
水痘-带状疱疹病毒(ZVZ)为一种α-疱疹病毒，它在人类可引起水痘和带状疱疹两种常见疾病。带状疱疹的临床表现以沿周围神经分布的群集疱疹和以神经痛为特征。VZV通过神经系统感染人体，经历两次病毒血症后，病毒到达皮肤表层，而产生典型的疱疹样皮损。随后病毒又进入周围神经系统，并潜伏在脊神经节。VZV具有高度的种属特异性，其自然感染仅发生于人与大猩猩。
2.3.伪狂犬病毒
伪狂犬病(Porcine Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病。发热、奇痒、脑脊髓炎是主要的发病症状。成年猪主要表现为隐形感染，妊娠母猪感染后主要表现为流产、死胎和呼吸系统疾病症状，无奇痒。新生猪仔感染后除了出现神经症状外还可侵害消化系统。本病呈世界性分布。猪是该病毒的主要宿主、长期储存者和排毒者，也是重要的病毒传播者。猪伪狂犬病毒给猪养殖业造成的损害仅次于猪瘟，每年会有数十亿美元的经济损失。
1960年以后该病已遍及全世界50多个国家。我国目前有20多个省市发现了该病，并且呈现不断蔓延扩大的趋势。目前针对该病没有特效药，只能用疫苗进行预防，一旦该病在集约化猪场开始流行将会对猪养殖业造成重大经济损害。另外，伪狂犬病毒也会感染鸡、猫、狗、牛等动物，而现有疫苗只对猪感染有预防作用，所以，开发针对该病的有效药迫切而急需。
本发明中的腊梅提取物，不仅可以直接体外杀灭伪狂犬病毒，也可阻断该病毒侵染细胞和抑制病毒在细胞中复制扩增，其中杀灭率可达99％以上，阻断率和抑制率接近50％，具有潜在的开发为伪狂犬病毒消毒剂和体内用药制剂的价值。
3致病菌
3.1结核杆菌
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种慢性致死性疾病，是危害人类健康和导致人类死亡的重大传染性疾病，其致死率仅次于艾滋病(acquiredimmunodeficiency syndrome，AIDS)。由于抗结核药物的大量使用和抗结核作用位点的突变，导致耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB)不断出现。2011年全球有870万人罹患TB，并有140万人死亡(其中非艾滋病患者约100万)。我国是全球22个TB流行最严重的国家之一，据2010年全国第五次结核病流行病学调查估计年发病人数为130万，占全球新发病人数的14.3％，是全球第二大结核病高负担国家。
目前结核病的治疗周期较长，患者顺应性较差。一线抗结核药物和二线抗结核药物在临床上广泛使用，出现耐多药结核杆菌，不能达到有效控制结核病。中药的资源丰富、治疗时重视整体协同、毒副作用小以及不易产生耐药等特点和优势,使得抗结核中药在日益严峻的结核治疗方面展现出了越来越光明的应用前景。
3.2耐药菌
近年来，滥用化药抗菌药情况普遍，致使耐药性越来越严重，临床治疗难度增大，疗效差，严重威胁患者生命健康。
3.2.1.革兰氏阳性菌
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，能产生多种毒素、酶及抗原蛋白，具有较强的致病力，能引起皮肤软组织感染，血液及全身各脏器感染。该菌具有广谱耐药性，对β-内酰胺类抗生素如青霉素G和头孢类抗生素如头孢吡肟、头孢唑啉、头孢噻肟的耐药率均为100％，对大环内酯类抗生素如克林霉素、氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、四环素的耐药率均高于60％，对利福平的耐药性已上升且大于50％。表皮葡萄球菌(MRSE)是机会致病菌，可引发尿路感染、菌血症、术后伤口感染和心肌炎、瓣膜修复术后心内膜炎、骨髓炎、透析性腹膜炎等，死亡率可达63％-74％。近年来发现，耐甲氧西林表皮葡萄球菌占表皮葡萄球菌的2/3，对头孢氨苄、头孢唑林、头孢哌酮、头孢噻肟、去甲万古霉素均有耐药性。
3.2.2.革兰氏阴性菌
耐药的肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，在院内感染的败血症中，病死率较高。产β-内酰胺酶大肠杆菌是严重的耐药致病菌，耐药机制复杂，其中致病菌能够打开β-内酰胺环，使具该结构的抗生素如青霉素类、头孢类失去活性。
3.3.胃肠致病菌
3.3.1.福氏志贺氏菌
福氏志贺菌(Shigella flexneri)，是志贺菌的一种，有14个血清型或亚型，是一类不形成芽孢的细菌，能够侵袭大肠引起典型菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)，是一种具有高度传染性和严重危害性的肠道传染病，严重危害人类的健康和生命安全。是发展中国家的主要感染菌株，2a是主要的血清型，近几年来我国每年大约有2000万人次感染痢疾，年累计发病数一直位于第三位。由于志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌)，最常见的扩散形式是人与人之间的传播，5岁以下儿童和免疫障碍的人为主要感染人群。
3.3.2.副溶血性弧菌
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种噬盐性弧菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
3.3.3.鼠伤寒沙门氏菌
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)属多价O抗血清的B群，是一种重要的人畜共患病原菌，其感染发病率居沙门菌感染的首位，占40％～80％，且多见于婴幼儿，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高。
3.3.4.肠炎沙门氏菌
肠炎沙门氏菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌，感染后的典型症状包括发热、腹泻和呕吐等。
发明内容
发明概述
本发明要解决的技术问题是提供一种新的预防/治疗病毒和致病菌感染的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物及其提取物在制备抗流感病毒、疱疹病毒、伪狂犬病毒及结核菌、普通致病菌、肠道致病菌的药物中的应用。
在本发明的具体实施方案中，所述的中药提取物为以下一种或多种：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸气蒸馏；(4)超临界二氧化碳提取物。
本发明第二方面提供了上述浙江腊梅提取物的制备方法。
本发明第三方面提供了一种浙江腊梅提取物制剂。
本发明第四方面提供了浙江腊梅植物、浙江腊梅植物提取物用于制备有效治疗病毒和致病菌感染药物用途，特别是在抗结核菌、致病菌及流感病毒、疱疹病毒、伪狂犬病毒的用途。
发明详述
本发明第一方面提供了一种浙江腊梅提取物在制备抗微生物感染的药物中的应用。
本发明中所述的药材或原药材是腊梅科腊梅属浙江腊梅。本发明中所述的生药也是腊梅科腊梅属浙江腊梅。
本发明的浙江腊梅的鲜品或干品；浙江腊梅的药用部位选自茎皮、花、叶或任意组合；优选的药用部位选自茎皮、叶；最优选的药用部位选自浙江腊梅的叶子。
本发明的第二方面提供了浙江腊梅提取物的制备方法。
在本发明的具体实施方案中，所述的浙江腊梅提取物为以下用水提、醇提、水蒸气蒸馏及超临界二氧化碳提取一种或多种：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳提取物。
为了加快提取速度，提高提取收率，可以对腊梅属原药材进行粉碎，粉碎后的平均粒径优选10-80目，更优先是20-65目，最优选是30-50目。
本发明提供的提取物的第一种制备方法：
所述提取物是按照包括如下步骤制备：浙江腊梅加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
所述的溶剂：本领域常用的溶剂均可以用于本发明。优选溶剂水和C1-C5的醇类。C1-C5的醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。选自水、无水乙醇、乙醇水溶液；更优选溶剂选自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶剂相比，具有低毒，防腐，污染小，价格低等优点，更适合于本发明应用于药物产品工业化大生产。
乙醇水溶液的浓度(乙醇水溶液中含有的乙醇的体积百分比)：优选30％-100％的乙醇水溶液，更优选50％-95％的乙醇水溶液，进一步优选优选60％-80％的乙醇水溶液，最优选75％的乙醇水溶液。
溶剂的量是指提取每公斤原药材所用的溶剂量，即提取每公斤药材计使用溶剂的重量(单位Kg)或体积(单位L)。溶剂用量是原药材用量的2-30倍；更优选5-16倍；进一步优选6-15倍；最优选8-10倍。
提取的温度：优选是室温到溶剂回流的温度；更优选是40℃-溶剂回流的温度；进一步优选是50℃-溶剂回流的温度；最优选是溶剂回流的温度。
提取的次数：可以是1～5次；优选是2～3次。
提取的时间：每次0.5～5小时；优选每次0.5～3小时；更优选每次1～3小时。
浓缩的温度：可以是55～90℃；优选62～80℃；更优选65～75℃。
浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5，优选1.2～1.4。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的提取物是浙江腊梅经水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经3-30倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经5-16倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经8-16倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经乙醇提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是浙江腊梅经8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，经浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，60～90℃(包括65～75℃)浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。
本发明提供的提取物的第二种制备方法：所述提取物是浙江腊梅经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。
本发明提供的提取物的第三种制备方法：所述提取物是原药材经超临界二氧化碳提取并获得。
本发明的超临界提取物，其特征在于，所述提取物是浙江腊梅经二氧化碳超临界提取，在分离釜中获得提取物，提取的条件可以是一种或多种，例如：
(1)不加夹带剂的提取物；
(2)加夹带剂的提取物；
(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。
超临界二氧化碳提取的条件如下：
萃取釜:
萃取温度为30-70℃；优选为35-60℃；更优选为40-50℃；最优选43-47℃。萃取温度可以选自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。
萃取压力为10-40Mpa；优选为13-35Mpa；优选为16-24Mpa；更优选为18-22Mpa。萃取压力可以选自15Mpa，20Mpa，20.6Mpa，29.6Mpa，30Mpa。
萃取釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个萃取釜的，可以是并联或串联。为了尽量节约原药材的加料和卸料时间，提高生产效率，优选是多个萃取釜并联。在一部分萃取釜加料或卸料的时候，另外的萃取釜同时进行萃取。
萃取剂流速：
萃取剂二氧化碳的流速会对本发明的生产效率产生重大的影响。如果二氧化碳的流速过快，二氧化碳和萃取溶质不能充分接触，会降低每体积二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速过慢，会降低单位时间的生产效率。因此，萃取剂二氧化碳的流速需要一个合适的流速。
萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升(以每公斤药材每小时计，单位为L/H·Kg生药)，即20-150L/H·Kg；优选的萃取剂二氧化碳的流速为23-125L/H·Kg；更优选为33-80L/H·Kg；进一步优选为50-70L/H·Kg；最优选为55-65L/H·Kg。
萃取剂二氧化碳的流速可以选自23.1L/H·Kg；23.8L/H·Kg；28.5L/H·Kg；32.3L/H·Kg；32.8L/H·Kg；36.2L/H·Kg；38.3L/H·Kg；35.3L/H·Kg；44.8L/H·Kg；50.7L/H·Kg；55.4L/H·Kg；75.6L/H·Kg；82.2L/H·Kg。
萃取时间分钟(min)：30-400min，优选120-160min，更优选120-160min，最优选120-160min。萃取时间可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，140-150min，155-165min。例如萃取时间可以是62min，70min，83min，100min，120min，132min，145min，160min。
夹带剂:
本发明的超临界提取方案中，可以选择性的使用夹带剂或不使用夹带剂；优先是使用夹带剂。
本领域常用的溶剂均可以作为本发明的夹带剂。例如本发明的夹带剂可以选自：0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。本文中100％V/V的乙醇水溶液表示无水乙醇；本文中0％V/V的乙醇水溶液表示没有醇的水。例如本发明的夹带剂可以选自：水、无水乙醇、30％-100％V/V的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。优选的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％V/V的乙醇水溶液。更优选的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。最优选的夹带剂选自95％V/V的乙醇水溶液。
夹带剂的量(以每公斤药材计为L/Kg，Kg/Kg；或以每克药材计为ml/g，g/g)：
夹带剂的量为0.10-2.5L/Kg；；优选0.20-1.5L/Kg；，更优选0.30-0.80L/Kg；最优选0.40-0.60L/Kg；
分离釜：
分离釜的温度为25-70℃，优选为30-60℃；更优选为35-55℃，最优选为40-50℃，。
分离釜的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。
分离釜的压力为2-17Mpa；优选为3-15Mpa；更优选为4-12Mpa；最优选为4.5-10Mpa。
分离釜的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa，5.6Mpa，5.7Mpa，5.8Mpa，6Mpa，7Mpa，8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。
分离釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个分离釜的，可以是并联或串联，为了尽量提高提取物的回收率，优选是多个分离釜串联。
分离釜I压力和温度：
分离釜I的温度为30-70℃，优选为50-60℃；更优选为53-57℃；最优选为55℃。分离釜I的温度可以选自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。
分离釜I的压力为4-17Mpa；优选为5-15Mpa；更优选为6-12Mpa；最优选为8-10Mpa。分离釜I的压力可以选自8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。
分离釜II压力和温度：
分离釜II的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜II的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。
分离釜II的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜II的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa。
分离釜III压力和温度：
分离釜III的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜III的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。
分离釜III的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜III的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa。
分离釜中的得到的提取物，就是本发明的浙江腊梅提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa,加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；放出分离釜中的提取物；再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-125L/H·Kg生药，再萃取90-300分钟；分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。
所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。
本领域常用的干燥均可以用于本发明，例如：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、热风干燥、远红外线干燥或微波干燥。或联合使用上述一种或多种干燥方式。
本发明提供的提取物的第四种制备方法：所述提取物是原药材经二氧化碳超临界提取后，其剩余的药材再加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。具体的提取方法可以第一种方式相同。
在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸渍，或者超临界状态下的提取，或者在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。
如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明任何目的的任何纯度的提取物，提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。
本发明第三方面公开含有浙江腊梅提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的制剂。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂的组合物还包含一种或多种无毒生理学可接受的载体。所述的可接受的载体包括本领域公知的任何辅料及起控释作用的辅料。常用的辅料包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、致孔剂、增塑剂、填充剂、增溶剂和乳化剂。稀释剂可以是但不限于淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是但不限于水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是但不限于滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇；增溶剂和乳化剂可以是但不限于乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。起缓控释作用的辅料可以选自亲水性凝胶材料、蜡脂类材料和不溶性材料的一种或多种。所述的亲水性凝胶材料可以选自羟丙基甲基纤维素、卡波普、羧甲基纤维素钠和海藻酸盐，所述的蜡脂类材料可以选自十六醇、十八醇、蜂蜡、山嵛酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕榈蜡，所述的不溶性材料可以选自乙基纤维素、丙烯酸树脂、聚氧乙烯和聚乙烯。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，可向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂包含浙江腊梅的提取物和药学上可接受的载体制成的制剂。可通过将组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。该制剂可根据本领域公知的方法制备。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂优选口服制剂、喷雾剂、注射剂。
本发明第四方面提供了浙江腊梅植物在制备抗感染药物中的应用。
本发明第四方面还提供了浙江腊梅提取物在制备抗感染药物中的应用。
所述的感染是由病毒或细菌引起。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的细菌选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性性菌。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的细菌选自不动杆菌属、杆菌属、弯曲杆菌属、衣原体、披衣菌属、梭菌属、柠檬酸菌属、埃希杆菌属、肠道菌属、肠球菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、克雷白石杆菌属、李斯特菌属、莫拉均属、分枝杆菌属、奈瑟是菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷菌属、志贺菌属、寡养单胞菌属、葡萄球菌属、连锁状球菌属或涅尔森菌属。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的细菌选自幽门螺旋杆菌、结核杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的病毒选自流感病毒、疱疹病毒、肠道病毒、抗伪狂犬病毒中任意一种或多种。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8；
在本发明的一个具体实施方案中，所述的疱疹病毒选自单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒；
在本发明的一个具体实施方案中，所述的肠道病毒选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的肠道病毒选自肠道病毒71型、所述的柯萨奇病毒选自柯萨奇病毒16型。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的肠道病毒引起的病症是手足口病。
有益技术效果：
用水、醇、超临界不同提取方法获得浙江腊梅提取物研究中，发现具有抑制革兰氏阳性致病菌作用，还首次发现抗结核杆菌、流感病毒、伪狂犬病毒的作用，为从畲药民族药寻找严重危害人类健康与生命的结核菌、流感病毒等预防/治疗用药提供新途径。而超临界提取在浙江腊梅提取物中应用也是首次。
1.抗病原菌
1.1.结核杆菌：挥发油ZYY的MIC为625ug/ml，水提物ZYS的IC50为2500ug/ml。
1.2.革兰氏菌：挥发油ZYY抗阳性菌的MIC范围为4.2-33.5mg/ml，抗阴性菌的MIC范围为33.5mg/ml。
2.抗病毒
2.1.流感病毒：水提物、醇提物和挥发油的杀灭模型、治疗模型、预防模型均有效。其中：
水提物ZYS：(1)杀灭模型浓度为31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应杀灭率分别为4.90％、10.19％、41.81％、52.97％、37.87％；(2)预防模型浓度为62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应阻断率分别为4.56％、12.58％、7.84％、14.36％。(3)治疗模型浓度为15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml时相应抑制率分别为29.91％、28.00％、36.81％、35.87％、72.04％。
醇提物ZYC：(1)杀灭模型浓度为15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应杀灭率分别为17.16％、34.52％、48.65％、75.55％、71.94％、22.39％。
挥发油ZYY：治疗模型挥发油浓度为400ug/ml时相应抑制率为47％。
2.2疱疹病毒：挥发油ZYY和水提物ZYS能有效抑制单纯疱疹病毒(HSV-I)CPE的产生(抑制率≥50％)，提示具有抗单纯疱疹病毒(HSV-I)作用。
2.3伪狂犬病毒：浙江腊梅水提取物和挥发油能显著灭活PRV、阻断PRV吸附Vero细胞以及抑制PRV在Vero细胞中增殖，具有一定的抗PRV作用。
化药治疗虽见效快，但一般以对症治疗为主，且副作用大，停药后病症易反弹；中药复方治疗药物服用量大，疗程长，病人服药不方便。本发明克服西药和中药复方治疗缺点，提供一种科学合理、副作用小、服用方便的单味中药作为抗病毒、抗菌的理想药物。
附图说明
图1.对照组杀灭、预防、治疗三种模型筛选结果图。
图1显示对照组杀灭模型实验结果：空白对照没有细胞死亡，形态没有发生变化。病毒对照大多数细胞死亡并脱落且细胞形态发生明显变化。对照药达菲显示出明显的体外杀灭H3N2活性，浓度为3.91ug/ml、7.81ug/ml、15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml时细胞状态较好，仅少量细胞死亡且细胞形态未发生变化，相应杀灭率分别为60.39％、61.74％、56.84％、49.68％、53.68％。对照药板蓝根颗粒浓度为62.50ug/ml、125.00ug/ml、250ug/ml时相应杀灭率分别为15.42％、33.16％、21.16％。
对照组预防模型实验结果：空白对照没有细胞死亡和脱落，病毒对照细胞几乎全部死亡和脱落。对照药达菲浓度为3.91ug/ml、7.81ug/ml、15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应阻断率依次为87.51％、100.77％、106.65％、109.94％、64.22％、31.04％、16.50％、17.50％。可见，对照结果达到预期，说明预防模型试验方法正确，对样品阻断H3N2感染细胞结果具有参考意义。
对照组治疗模型实验结果：病毒对照细胞几乎全部死亡和脱落。空白对照细胞几乎没有脱落和死亡，细胞状态很好。达菲在浓度为3.91ug/ml、7.81ug/ml、15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml时相应抑制率分别为32.60％、32.72％、35.06％、29.57％、31.28％、14.55％、1.70％。板蓝根颗粒在浓度为62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml时相应抑制率分别为28.30％、18.13％、15.06％。对照结果符合预期，说明治疗模型试验方法正确，可对样品的抑制流感病毒在细胞内的复制扩增活性的判断提供参考。
图2.水提物杀灭、预防、治疗三种模型筛选结果图。
图2显示水提物杀灭模型实验结果：ZYS(161218)浓度为31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应杀灭率分别为4.90％、10.19％、41.81％、52.97％、37.87％。
水提物预防模型实验结果：ZYS(161218)浓度为62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应阻断率分别为4.56％、12.58％、7.84％、14.36％。
水提物治疗模型实验结果：ZYS(161218)在浓度为15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml时相应抑制率分别为29.91％、28.00％、36.81％、35.87％、72.04％。
图3.醇提物杀灭模型筛选结果图。
图3显示醇提物杀灭模型实验结果：浙江腊梅醇提物ZYC(16112)浓度为15.63ug/ml、31.25ug/ml、62.50ug/ml、125.00ug/ml、250.00ug/ml、500.00ug/ml时相应杀灭率分别为17.16％、34.52％、48.65％、75.55％、71.94％、22.39％。由图片可见细胞状态非常好，可视为优选样品。
图4.挥发油预防模型筛选图
挥发油治疗模型实验结果：浙江腊梅挥发油ZYY浓度为400ug/ml时相应抑制率为47％。
图5.ZYS和ZYY对Vero细胞无毒性的最大浓度。
具体实施方式：
提取物制备例
实施例1(水提物)
浙江腊梅干燥老叶粉碎后作为药材，按下表称取相应量的药材装入圆底烧瓶中，分两次加水回流提取。第一次加10倍量的水(即每克药材使用10毫升的水)，提取1小时后过滤，第二次加水8倍量(即每克药材使用10毫升的水)，提取1小时，合并两次滤液。将滤液旋转蒸发仪上浓缩或水浴锅上浓缩，水浴75℃、转速80rpm,浓缩至比重为1.18－1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。浙江腊梅的水提物编号ZYS
实施例2
浙江腊梅干燥老叶粉碎后作为药材，按下表称取相应量的药材装入圆底烧瓶中，分两次加乙醇回流提取。第一次加10倍乙醇(即每克药材使用10毫升的水乙醇，提取1小时后过滤，第二次加乙醇8倍(即每克药材使用10毫升的乙醇)，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩，水浴65℃、转速80rpm，浓缩至比重为1.18－1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎，浙江腊梅的醇提物编号ZYC。
实施例3
称取适量已粉碎的药材，装入8-10倍水提时，装好挥发油提取器，待油产生后收集。
实施例4
开启电热控制系统和制冷系统。称取6.4kg粉碎后的浙江腊梅叶子，置于萃取釜中。称取3.2kg95％乙醇，放置于副泵的储箱中，开启副泵(R＝9.1r/min),60min内加夹带剂结束。萃取釜、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为220-240L/h。萃取，并进行后处理后，收集加夹带剂萃取的产物。
实施例5
称取6.05kg粉碎后的浙江腊梅叶子，置于萃取釜中。当压力稳定时，萃取开始。萃取釜、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5.2MPa、5.2MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.6r/min，二氧化碳流速为350-370L/h，萃取后，收集不加夹带剂的萃取产物。
实施例6
在实施例5的基础上，开启副泵(R＝15.5r/min)，15min加入1.55kg95％乙醇,进行萃取，并后处理后，得到补加夹带剂的产物。
药理实验
试验例1：浙江腊梅样品对流感病毒H3N2活性检测实验
1)实验病毒株
流感病毒H3N2，由浙江省丽水市疾控中心从临床分离鉴定所得。
2)实验试剂、材料、设备和场地
试剂：DMEM(1X)；FBS；HBSS(1X)；PBS(1X)；0.25％Trypsin-EDTA(1X)；均为GIBCO产品。L-Glutamine,Liquid；青链霉素混合液(100X)；均为Solarbio产品。
材料：96孔板；10ml一次性移液管；6孔板；均为Costar产品。50ml离心管；15ml离心管；25cm2细胞培养瓶；均为Corning产品。血凝滴度板；移液枪及枪头。
设备：CO2培养箱；倒置显微镜；二级生物安全柜。
场地：细胞培养BSL-2实验室。
3)实验方法
样品配制：称取样品0.0200g于1.5ml EP管中，用1ml DMSO溶解后吸取100ul用900ul维持液稀释后即浓度为2mg/ml，于4℃冷藏备用。
培养病毒：将状态良好细胞洗去胎牛血清，加入病毒液于35℃，5％CO2培养箱中孵育1-2小时后将病毒液弃去，加入维持液于35℃，5％CO2培养3-7天，待70％的细胞死亡，将该病毒培养液冻融3次后进行HA试验。待测定TCID50之后将病毒液稀释分装于-80℃冰箱中冻存以备用。HA试验方法：将O型血血清弃去，取200ul的血红细胞于1.5mlEP管中，用1ml的PBS清洗3次，吸取100ul的红细胞用PBS稀释至10ml混匀为1％的血红细胞。将培养好的病毒液倍比稀释为数个浓度1:1、1:2、1:4、1:8、1:16等，每个浓度的病毒液取50ul分别加入50ul的1％血红细胞混匀，待40分钟后查看结果，若红细胞分散即为有病毒，若红细胞聚集成一点即为无病毒。
样品最大无毒浓度确定：将状态良好的浓度约为105个/ml的细胞均匀铺于96孔板中，培养至第二天长成单层后，将配制好的样品加入细胞并倍比稀释为8个浓度，于37℃、5％CO2条件下培养48小时后观察细胞的状态。
样品抗病毒实验步骤：CCK-8细胞显色法。
①预防模型：将浓度为105个/ml的细胞液100ul/孔铺于96孔板，待第二天细胞长至单层后用HBSS 50ul/孔将细胞板洗一次，再加入配制好的样品，于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h后弃去，再加入病毒液(HA＝1)10ul，再于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h后弃去，再加入100ul维持液培养48h后观察结果。
阻断率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照平均值－病毒对照平均值)]×100％
②治疗模型：将浓度为105个/ml的细胞液100ul/孔铺于96孔板，待第二天细胞长至单层后用HBSS 50ul/孔将细胞板洗一次，再加入HA＝1的H3N2病毒液10ul/孔，于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时,孵育之后将病毒液弃去，再加入配制好的药液100ug/孔，培养48小时观察细胞状态。
抑制率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照平均值－病毒对照平均值)]×100％
③杀灭模型：将浓度为105个/ml的细胞液100ul/孔铺于96孔板，待第二天细胞长至单层备用。第二天用HA＝1的病毒液将样品稀释为试验浓度，于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时后加入用HBSS清洗后的细胞板,于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后观察结果。
杀灭率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照平均值－病毒对照平均值)]×100％
结果判断方法：通过CCK-8细胞显色法测定显色液的OD值，再结合倒置显微镜观察细胞的状态，综合评价样品的抗H3N2的效果。
4)实验结果
抗H3N2预防、治疗和杀灭三种模型筛选结果
表1.醇提物和水提物抗H3N2筛选结果表
如表显示：醇提物和水提物杀灭、预防、治疗三种模型均有效。
表2.挥发油抗H3N2筛选结果表
如表显示：水蒸气蒸馏挥发油杀灭、预防、治疗三种模型均有效。
试验例2.抗疱疹病毒活性检测实验
1.材料
1.1.实验病毒株
病毒：单纯疱疹病毒HSV-I，为复旦大学药学院抗病毒药物研究室保存，临用时新鲜制备。
细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)。
1.2.样品
为制备实施例1、3所得样品：ZYY、ZYS。
1.3.主要仪器
CO2细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋(SANYO)公司；电子天平：Sartorius1700型，德国W-Germany；超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂；酸度计：ORION STAR A211，Thermo公司；酶标仪：BIO-RAD680型，美国伯乐BIO-RAD公司；生物倒置显微镜：XDS-1B型，重庆光学仪器厂；电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司；微量振荡仪：MH-1型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；漩涡混合器：WH-861型，江苏太仓华利达实验设备有限公司。
1.4.试剂
3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；0.25％胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；完全培养液(含10％胎牛血清以及双抗的DMEM培养液)；细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养液)；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，本实验室自制。
2.实验方法
2.1.样品配制方法
测试样品溶解于DMSO中，预先配置成40mg/ml浓度，然后用细胞培养液稀释，按照常规测试浓度，以200ug/ml开始倍比稀释。
2.2.样品细胞毒性试验
Vero细胞接种于96孔培养板，培养24小时，形成细胞单层后，加入不同浓度的样品稀释液，继续培养72小时后，显微镜观察细胞形态变化并用MTT法测定细胞活性，确定样品对细胞的毒性浓度。
2.3.体外抗病毒试验
细胞活性大于90％以上的最大药物浓度作为药效测试的最大起始浓度，倍比稀释5个浓度进行药效活性检测。Vero细胞接种于96孔培养板，培养24小时，形成细胞单层后，加入相应病毒液感染细胞，然后换入对细胞最大无毒浓度及以下的5个样品稀释液，再经72小时培养后，显微镜下观察细胞病变(CPE)，确定样品对病毒的抑制作用。
2.4.实验结果判定方法
MTT法测定样品对细胞的毒性，观察细胞病变作用CPE(cytopathic effect)确定样品对病毒的抑制作用。TC50和IC50值按照Reed-Muench法原理进行计算。3.抗单纯疱疹病毒HSV-I筛选结果
3.1对Vero细胞的毒性
3.2抗单纯疱疹病毒的筛选结果
结论：样品ZYY和ZYS能有效抑制单纯疱疹病毒(HSV-I)CPE的产生(抑制率≥50％)，提示具有抗单纯疱疹病毒(HSV-I)作用。
试验例3抗伪狂犬病毒筛选
1.材料
1.1.实验病毒株：猪伪狂犬病病毒(PRV，Bartha K61株)：硕腾公司美国查理斯堡公司。
细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)，浙江大学动物科学学院天然药物实验室传代保存。
1.2.样品：挥发油SYY、水提物SYS。
1.3.主要仪器：CO2细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋(SANYO)公司；电子天平：Sartorius 1700型，德国W-Germany；超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂；酸度计：ORION STAR A211，Thermo公司；酶标仪：BIO-RAD680型，美国伯乐BIO-RAD公司；生物倒置显微镜：XDS-1B型，重庆光学仪器厂；电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司；微量振荡仪：MH-1型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；漩涡混合器：WH-861型，江苏太仓华利达实验设备有限公司。
1.4.试剂：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；0.25％胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；完全培养液(含10％胎牛血清以及双抗的DMEM培养液)；细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养液)；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，本实验室自制。
1.5.主要试剂的配制
3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液：称取MTT粉末，加入PBS，溶解，制成2mg/ml的MTT溶液。
2.实验方法
2.1.Vero细胞复苏和培养
从液氮灌中取出冻存的Vero细胞，于37℃水浴快速融化，用75％乙醇擦拭冻存管口，将冻存管中液体转移至预先加有预冷PBS的离心管中，1200r/min离心5min，弃上清。细胞沉淀以含10％胎牛血清的DMEM完全培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置37℃、5％CO2细胞培养箱培养，倒置显微镜观察细胞生长情况。
2.2.PRV的TCID50测定
Vero细胞以0.75×105/ml浓度接种96孔细胞培养板，贴壁培养24h。将PRV液按10倍作倍比稀释，加入到铺满Vero细胞的96孔培养板中，每个稀释度重复8孔，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，期间每隔30分钟摇晃一次。2h后弃去上清，加入维持液继续培养。分别于接毒后12、24、48、72h置倒置显微镜下观察。比较不同稀释度的细胞病变情况(CPE)，有细胞病变的判为阳性，无细胞病变的为阴性，采用Reed-Muench法计算PRV在Vero细胞中的TCID50。
2.3.试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定
Vero细胞以0.75×105/ml的浓度接种96孔细胞培养板，贴壁培养24h。LYY初始浓度(400μg/ml)采用DMEM培养液作2倍倍比稀释至25μg/ml，LYLJ初始浓度(40μg/ml)向下2倍倍比稀释至0.625μg/ml，依次加到长成单层Vero细胞的96孔细胞板上，100μL/well，每个稀释度重复8孔，另设细胞对照孔，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养。孵育2h后，弃培养上清，加入维持液继续培养，每天观察细胞状态，以48h时，8孔均未出现细胞病变的浓度作为最大安全浓度。同时，另一批细胞于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1NHCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD492)。
2.4.对PRV吸附细胞的阻断作用
以最大安全浓度作为初始浓度，用DMEM培养液作2倍倍比稀释后，分别加入到长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板上，每个浓度8个复孔，100μL/well，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养。孵育2h后弃去上清，每孔加入100TCID50的PRV病毒液100μL，于37℃、5％CO2细胞培养箱继续孵育2h，每隔30分钟摇晃一次。另设细胞对照和病毒对照。2h后弃去病毒液后，每孔加入100μL维持液，继续培养，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况。于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解后采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD492)，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算阻断率。
阻断率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值－病毒对照平均值)]×100％。
2.5.对PRV增殖的抑制作用
在长满单层的Vero细胞孔中按100μL/well加入100TCID50的PRV病毒液，于37℃、5％CO2细胞培养箱吸附2h，每隔30分钟摇晃一次。弃去病毒液，按100μL/well加入不同稀释度的药物稀释液，每个稀释度重复8孔，于37℃、5％CO2细胞培养箱孵育。。2h后弃去药液，每孔加入100μL维持液，继续培养，同时设细胞对照和病毒对照，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况。同时，于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算抑制率。
抑制率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值－病毒对照平均值)]×100％。
2.6.对PRV的杀灭作用
将不同稀释度的药物稀释液分别与等体积的200TCID50病毒液混合，于37℃、5％CO2细胞培养箱孵育2h，每隔30分钟摇晃一次。然后将混合液按100μL/well加入长成单层的Vero细胞中，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养，间隔30分钟摇晃一次。2h后弃去上清，每孔加入100μL维持液，继续培养，同时设细胞对照和病毒对照。每天于倒置显微镜下观察细胞病变。于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD492)，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算杀灭率。
杀灭率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值－病毒对照平均值)]×100％。
3试验结果
3.1细胞最大无毒浓度
ZYS和ZYY对Vero细胞无毒性的最大浓度
3.2 ZYS和ZYY对PRV杀灭作用MTT法检测结果
注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。
3.3 ZYS和ZYY对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果
注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。
3.4 ZYS和ZYY对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果
注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。
结论：浙江腊梅水提取物和挥发油能显著灭活PRV、阻断PRV吸附Vero细胞以及抑制PRV在Vero细胞中增殖，具有一定的抗PRV作用。
试验例4抗结核菌筛选
1)材料
①菌种：本实验室制备的无毒力自主发光标准结核菌Autoluminescent H37Ra(简称AlRa)。
②核心仪器：Glomax2020发光检测仪：美国Promega公司；生化培养箱(LRH-70)：上海恒科；台式恒温振荡器(THZ-D)：太仓市实验设备厂；电子天平(JE3002)：上海浦春仪器公司。
2)方法与结果
①方法：37℃培养AlRa菌液至对数期。用7H9培养基稀释菌液，使发光值在15000-25000RLU/mL之间。取稀释后的菌液195ul与稀释后的药液5ul混合，每药物每个浓度设2-3重复，并设置阳性对照(RIF：终浓度1ug/ml)和阴性对照(DMSO)。阴性空白对照的发光值作为第0天的发光值，之后每天检测样品发光值1次，共检测3天。
第3天平均发光值达到阴性空白对照组发光值一半以下的最低浓度为这个样品的IC50(ug/ml)；第3天抑制90％菌的生长的浓度为该样品的MIC(ug/ml)。
②结果：如表2所示：
表2.各个药物的MIC和IC50值
试验例5抗肠道致病菌筛选
1)仪器
多点接种仪；培养箱(用于37℃恒温培养)；接种环(环状部分需细丝状)；二级生物安全柜；一次性灭菌培养皿(材质：塑料；数量：160个；规格：直径9mm)；麦氏比浊管(品牌：梅里埃)或麦氏比浊仪；MH培养基；电热炉(用于培养基配制时加热)；小试管(规格：10*100mm，数量：80个)及试管塞；酒精灯：20ul移液枪及枪头；分析天平；注射器(规格：20ml；数量：15个)；试管架2个；烧杯(规格：500ml；数量：6个)；小药芍6个；
2)试剂
MH培养基；0.9％生理盐水200ml；新洁尔灭；
3)菌株表
4)体外抗菌实验方法
中药样品体外抗菌最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)的测定参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)抗菌药物敏感性试验操作规程【(Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing；Twenty-Third Informational Supplement)M02-A11、M07-A9和M11-A8，2013】推荐的琼脂二倍稀释法。
①样品及对照品配制及接菌
移取样品约4g于烧杯中，加入30ml的培养基，混匀，吸取15ml于培养皿中，使其终浓度为133.333mg/ml，再在烧杯中加入15ml的培养基，再吸取15ml于培养皿中，使其终浓度为66.667mg/ml，依照此法倍比稀释，共15个浓度。待冷却后用多点接种仪(MIT-P,SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为106CFU/ml，每皿接种13株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。
②实验结果及统计方法
以平皿内未见细菌生长的样品最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。统计各受试样品对试验菌株的MIC值及其MIC值范围，并与对照样品进行比较。
5)实验测定结果
Claims (33)
1.一种腊梅属浙江腊梅提取物在制备抗微生物感染的药物中的应用，其特征在于，所述的浙江腊梅提取物的制备包括如下步骤：
原药材腊梅属浙江腊梅加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
2.根据权利要求1的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的溶剂选自水、无水乙醇、乙醇水溶液。
3.根据权利要求2的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的溶剂选自60％-80％的乙醇水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的溶剂用量是原药材用量的2-30倍。
5.根据权利要求1-3中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述溶剂提取步骤的温度是室温到溶剂回流的温度。
6.根据权利要求1-3中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取次数是1～5次。
7.根据权利要求1-3中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取时间是每次0.5～5小时。
8.根据权利要求1-3中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述滤液浓缩的温度是55～90是。
9.根据权利要求1-3中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述滤液浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5。
10.一种浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤
原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。
11.一种腊梅属浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的腊梅属浙江腊梅提取物的制备是原药材腊梅属浙江腊梅经超临界二氧化碳提取并获得，提取的条件选自如下任意一种或多种：
(1)不加夹带剂的提取物；
(2)加夹带剂的提取物；
(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。
12.根据权利要求11的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述提取物进行超临界二氧化碳提取时的条件选自如下(1)-(4)中的任意一项或多项：
(1)萃取温度为30-70℃；
(2)萃取压力为10-40Mpa；
(3)分离温度为25-70℃；
(4)分离压力为2-17Mpa。
13.根据权利要求12的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
(1)萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升；
(2)萃取时间为：30-400分钟。
14.根据权利要求12-13中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括使用夹带剂。
15.根据权利要求14的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇、乙酸乙酯、丙酮中至少一种。
16.根据权利要求15的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。
17.根据权利要求14-16中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述夹带剂的量以每公斤药材计为0.10-2.5L/Kg。
18.根据权利要求12-13中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，
分离釜I压力和温度：
分离釜I的温度为30-70℃，分离釜I的压力为4-17Mpa；
分离釜II压力和温度：
分离釜II的温度为25-50℃，分离釜II的压力为2-8Mpa。
19.根据权利要求12-13中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
1)是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，
2)萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，
3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，
4)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa；
5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，
6)分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
20.根据权利要求12-13中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
1)对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜；
2)萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa,加入夹带剂；
3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，
4)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，
5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；
6)分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
21.根据权利要求12-13中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
1)是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，
2)原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，
3)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，
4)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；
5)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；
6)放出分离釜中的提取物；
7)再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-125L/H·Kg生药，再萃取90-300分钟；
8)分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。
22.根据权利要求20-21中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇、乙酸乙酯、丙酮中至少一种。
23.根据权利要求1-22中任一项的浙江腊梅提取物，其特征在于，所述的腊梅属浙江腊梅药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合。
24.浙江腊梅植物在制备抗感染药物中的应用。
25.权利要求1至23任一项所述的浙江腊梅提取物在制备抗感染药物中的应用。
26.根据权利要求24-25中任一项的应用，其特征在于，所述的感染是由病毒或细菌引起。
27.根据权利要求26的应用，其特征在于，所述的细菌选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性性菌。
28.根据权利要求26的应用，其特征在于，所述的细菌选自不动杆菌属、杆菌属、弯曲杆菌属、衣原体、披衣菌属、梭菌属、柠檬酸菌属、埃希杆菌属、肠道菌属、肠球菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、克雷白石杆菌属、李斯特菌属、莫拉均属、分枝杆菌属、奈瑟是菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷菌属、志贺菌属、寡养单胞菌属、葡萄球菌属、连锁状球菌属或涅尔森菌属。
29.根据权利要求26的应用，其特征在于，所述的细菌选自幽门螺旋杆菌、结核杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
30.根据权利要求26的应用，其特征在于，所述的病毒选自流感病毒、疱疹病毒、肠道病毒、抗伪狂犬病毒。
31.根据权利要求30的应用，其特征在于，
所述的流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N8；
所述的疱疹病毒选自单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒；
所述的肠道病毒选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒。
32.根据权利要求30的应用，其特征在于，所述的肠道病毒选自肠道病毒71型、所述的柯萨奇病毒选自柯萨奇病毒16型。
33.根据权利要求30的应用，其特征在于，所述的肠道病毒引起的病症是手足口病。
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