CN107260774A - 蜡梅属植物抗致病菌感染的用途 - Google Patents

蜡梅属植物抗致病菌感染的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN107260774A
CN107260774A CN201710395733.3A CN201710395733A CN107260774A CN 107260774 A CN107260774 A CN 107260774A CN 201710395733 A CN201710395733 A CN 201710395733A CN 107260774 A CN107260774 A CN 107260774A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extract
application
extraction
entrainer
wintersweet
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710395733.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王子厚
张淑华
马领弟
陈昌红
袁宙新
李水福
周益成
叶茂华
丁莉梅
范蕾
王伟影
刘忠达
朱菊红
毛菊华
朱晓龙
郑伟霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Huarun 39 Zhongyi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Zhejiang Huarun 39 Zhongyi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Huarun 39 Zhongyi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Zhejiang Huarun 39 Zhongyi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201710395733.3A priority Critical patent/CN107260774A/zh
Publication of CN107260774A publication Critical patent/CN107260774A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0203—Solvent extraction of solids with a supercritical fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B9/00—Essential oils; Perfumes
    • C11B9/02—Recovery or refining of essential oils from raw materials
    • C11B9/025—Recovery by solvent extraction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B9/00—Essential oils; Perfumes
    • C11B9/02—Recovery or refining of essential oils from raw materials
    • C11B9/027—Recovery of volatiles by distillation or stripping
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/37—Extraction at elevated pressure or temperature, e.g. pressurized solvent extraction [PSE], supercritical carbon dioxide extraction or subcritical water extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了蜡梅属植物抗致病菌感染的用途，具体涉及腊梅属植物及其提取物在制备预防/治疗由幽门螺旋杆菌引起相关疾病的药物中的应用。所述的蜡梅属包括柳叶蜡梅、浙江蜡梅或山腊梅；所述的提取物包括水提、醇提、水蒸气蒸馏和超临界提取。

Description

蜡梅属植物抗致病菌感染的用途
技术领域
本发明具体涉及腊梅属植物提取物在预防/治疗由致病菌所引起疾病的药物的应用，特别是预防/治疗由耐药菌引起的感染，所述的腊梅属植物包括柳叶腊梅、浙江腊梅和山腊梅，属于医药技术领域。
背景技术
1.腊梅属植物
腊梅柳叶腊梅、山腊梅和浙江腊梅同属蜡梅科腊梅属植物，我国特产，主要分布于我国亚热带季风湿润气候区域的鄂、湘、川、渝、贵、豫、浙、赣、皖等省。
蜡梅属柳叶蜡梅(Chimonanthussalicifolius S.Y.Hu)、浙江蜡梅(Chimonanthuszhejiangensis M.C.Liu)或山腊梅(Chimonanthus nitens Oliv.)等为畲族民间习用药，从北宋年间起其干燥叶就作为服用的食凉茶，近千年来用于治疗和预防感冒。现代研究又有进展，其中，山腊梅提取物制备的颗粒制剂，有良好治疗/预防感冒功效，已在市场销售；柳叶蜡梅和浙江腊梅已载入2005和2015年的《浙江省中药炮制规范》，主要成分为挥发油，含有1.8-桉叶素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、榄香醇等40多种成分。传统用途：性味微苦，辛，凉，归肺、脾、胃经，用于治疗感受风寒而引起肚胀、肚痛腹泻，因饮食不当引起的消化不良、腹部胀痛和小儿疳积等症状。
浙江腊梅为腊梅科腊梅属常绿灌木，产于浙江。群体遗传学研究发现浙江腊梅和山腊梅相对近缘，山腊梅在湖南、福建、广西贵州等地均有分布，而浙江腊梅未见分布，浙江腊梅仅分布于浙江龙泉，因此，结合形态、分子及地理分布特征，我们认为浙江蜡梅是山蜡梅分布区的最东边界的一个群体，可能只是山蜡梅的一种生态型(ecotype)，而不是独立的分类单位。
山腊梅(Chimonanthus nitens)为常绿灌木，又称之为毛山茶、岩马桑(《新华本草纲要》)、亮叶腊梅(《经济植物手册》)、香风茶(《安徽中草药》)、野腊梅(《云南中药资源名录》)。产于安徽、浙江、江苏、江西、福建、湖北、湖南、广西、云南、贵州和陕西等省区。民间使用历史悠久，具有防治感冒、痰喘、咳嗽、慢性支气管炎、细菌感染、发热疼痛、炎症、蚊虫叮咬及高血压、高血脂等作用，亦有抗肿瘤、防治心脑血管疾病、改善微循环和抗衰老、抗氧化等作用，另外还具有调节人体机能、增强体质、提高机体免疫力、减少体脂、减肥等保健功能。该植物主产于江西德兴大茅山区、婺源怀玉山区、安徽徽州齐云山一带，在浙江、福建、陕西等省亦有分布，资源较丰富。山腊梅挥发油中主要成分是烯烃、醇类和烷酸类物质，分别为脱氢香橙烯、△-杜松烯、E-环氧金合欢烯、石竹烯、(-)-氧化石竹烯、α-杜松醇(7.08％)、(+)-匙叶桉油烯醇、杉木醇、十六烷酸。榄香烯等倍半萜类合物具有较好的抗肿瘤活性，黄酮类成分具有防治心脑血管疾病、改善微循环和抗衰老等多种功效。山腊梅药片的温热蒸发物可抑制病毒，山腊梅挥发油可抑制和杀灭病毒。
1982年，《江西省药品标准》就记载了“山腊梅片”和“山腊梅冲剂”，作为防治感冒和流行性感冒制剂在临床上应用，市售良好。与山腊梅同属的柳叶蜡梅和浙江腊梅虽在民间使用普遍，但在市场上还未有适合的制剂。
CO2超临界萃取技术具有低温、快速、效率高、无污染、提取物纯度高、易分离等优点，适用于挥发油的提取。贺建云采用超临界CO2萃取小试设备，不加夹带剂提取柳叶蜡梅中物质，总收率为3.68％，但未见超临界二氧化碳萃取柳叶蜡梅物质的应用报道。
本发明在已有研究的基础上，采用新的未见报道的提取方案，优化已有制备柳叶腊梅提取物的工艺条件、参数以及研究柳叶腊梅新提取物的新用途；研究适合柳叶蜡梅提取物的软胶囊、滴丸等制剂；为柳叶蜡梅提取物用于致病菌感染预防和治疗提供有益支持。
2.耐药菌
近年来，滥用化药的抗菌药情况比较普遍，致使耐药性越来越严重，导致急需的临床治疗难度增大，疗效差，严重威胁患者生命健康
2.1.革兰氏阳性菌
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，能产生多种毒素、酶及抗原蛋白，具有较强的致病力，能引起皮肤软组织感染，血液及全身各脏器感染。该菌具有广谱耐药性，对β-内酰胺类抗生素如青霉素G和头孢类抗生素如头孢吡肟、头孢唑啉、头孢噻肟的耐药率均为100％，对大环内酯类抗生素如克林霉素、氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、四环素的耐药率均高于60％，对利福平的耐药性已上升且大于50％。多重耐药性导致该菌所致感染治疗困难，病死率高。表皮葡萄球菌(MRSE)是机会致病菌，可引发尿路感染、菌血症、术后伤口感染和心肌炎、瓣膜修复术后心内膜炎、骨髓炎、透析性腹膜炎等，死亡率可达63％-74％。近年来发现，耐甲氧西林表皮葡萄球菌占表皮葡萄球菌的2/3，对头孢氨苄、头孢唑林、头孢哌酮、头孢噻肟、去甲万古霉素均有耐药性。
2.2.革兰氏阴性菌
耐药的肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，在院内感染的败血症中，与绿脓杆菌均为重要病原菌，病死率较高，也均为革兰氏阴性菌。现对β-内酰胺类光谱抗生素也产生较为严重的多重耐药性。
产β-内酰胺酶大肠杆菌是严重的耐药致病菌，耐药机制复杂，其中致病菌能够打开β-内酰胺环，使具该结构的抗生素如青霉素类、头孢类失去活性。
2.3.胃肠致病菌
2.3.1.志贺菌
志贺氏菌属(shigella spp)，是一类不形成芽孢的细菌，能够侵袭大肠引起典型菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)，是一种具有高度传染性和严重危害性的肠道传染病，严重危害人类的健康和生命安全。福氏志贺氏菌(S.flexneri)是发展中国家的主要感染菌株，2a是主要的血清型，近几年来我国每年大约有2000万人次感染痢疾，年累计发病数一直位于第三位。由于志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌)，主要传播途径为粪口途径，所以最常见的扩散形式是人与人之间的传播，加之多重耐药株的出现，其主要感染人群为5岁以下的儿童和免疫障碍的人群。世界卫生组织推荐治疗菌痢的首选药物为环丙沙星，其次为头抱曲松和匹美西林。
2.3.2.沙门氏菌
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium.)是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一，可以感染各种动物和人，是一种重要的人畜共患传染性细菌。在人，主要引起小肠结肠炎，是小儿沙门氏菌感染中最常见者，绝大多数患儿为两岁以下的婴幼儿。
2.3.3.弧科菌
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种噬盐性弧菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
3.抗菌药研究现状
调研显示，已有一些腊梅属植物对金黄葡萄球菌、大肠杆菌等的研究报道，但未见其胃肠致病菌的志贺、副溶、鼠伤寒、罗森、肠炎、斯坦利报道，也未见普通致病菌中的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(MRSE)、大肠埃希菌(Eco+)、肺炎克雷伯(KPN+)的耐药株，以及甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、肺炎克雷伯(KPN-)的敏感株报道。
中医药是解决耐药菌感染的一种新选择，此系本研究选题的初衷。
发明内容
发明概述
本发明要解决的技术问题是提供一种新的抗致病菌的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备抗致病菌的药物中的应用。
所述的腊梅科腊梅属植物包括：柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅。
在本发明的具体实施方案中，所述的提取物为以下一种或多种：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳萃取。
本发明第二方面提供了上述腊梅属植物提取物的制备方法。
本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的口服制剂。
发明详述
本发明要解决的技术问题是提供一种新的抗致病菌的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备抗致病菌的药物中的应用。特别是本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备预防/治疗由耐药菌引起的感染的药物中的应用。
本发明中所述的药材或原药材是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。本发明中所述的生药也是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。
本发明的腊梅属植物包括腊梅属植物的鲜品或干品；腊梅属植物的药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合；优选的药用部位选自腊梅属植物的地上部分、茎、茎皮、叶或任意组合；更优选的药用部位选自腊梅属植物的茎或叶；最优选的药用部位选自腊梅属植物的叶。
本发明第一方面提供的柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅在制备抗菌药物的应用。所述的病菌选自革兰氏阳性菌甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌S.aureus(Methicllin-resistant，MRSA)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌S.aureus(Methicin-suseptable)、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis，MRSE)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis，MSSE)，还选自革兰氏阴性菌多耐药铜绿假单胞菌、多耐药肺炎克雷伯菌、多耐药鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌(ESBLS)Eco+、肺炎克雷伯(ESBLs)KPN+、大肠埃希菌(非ESBLS)Eco、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAE)、肠炎沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、罗森沙门氏菌、福氏志贺氏、鲍曼不动杆菌。
本发明第一方面，还提供了腊梅属植物提取物用于(1)治疗家畜、家禽和伴侣动物、野生动物、鸟类的细菌感染的疾病；(2)畜牧饲料或饲料添加剂；(3)消杀剂。
本发明的第二方面提供了腊梅属植物提取物的制备方法。
在本发明的具体实施方案中，所述的腊梅属植物提取物为以下用水提、醇提、水蒸气蒸馏及超临界二氧化碳提取一种或多种：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳提取物。
为了加快提取速度，提高提取收率，可以对腊梅属原药材进行粉碎，粉碎后的平均粒径优选10-80目，更优先是20-65目，最优选是30-50目。
本发明提供的提取物的第一种制备方法：
所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
所述的溶剂：本领域常用的溶剂均可以用于本发明。优选溶剂水和C1-C5的醇类。C1-C5的醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。选自水、无水乙醇、乙醇水溶液；更优选溶剂选自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶剂相比，具有低毒，防腐，污染小，价格低等优点，更适合于本发明应用于药物产品工业化大生产。
乙醇水溶液的浓度(乙醇水溶液中含有的乙醇的体积百分比)：优选30％-100％的乙醇水溶液，更优选50％-95％的乙醇水溶液，进一步优选60％-80％的乙醇水溶液，最优选75％的乙醇水溶液。
溶剂的量是指提取每公斤原药材所用的溶剂量，即提取每公斤药材计使用溶剂的重量(单位Kg)或体积(单位L)。溶剂用量是原药材用量的2-30倍；更优选5-16倍；进一步优选6-15倍；最优选8-10倍。
提取的温度：优选是室温到溶剂回流的温度；更优选是40℃-溶剂回流的温度；进一步优选是50℃-溶剂回流的温度；最优选是溶剂回流的温度。
提取的次数：可以是1～5次；优选是2～3次。
提取的时间：每次0.5～5小时；优选每次0.5～3小时；更优选每次1～3小时。
浓缩的温度：可以是55～90℃；优选62～80℃；更优选65～75℃。
浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5，优选1.2～1.4。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-16倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-16倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经乙醇提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，经浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，60～90℃(包括65～75℃)浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。
本发明提供的提取物的第二种制备方法：所述提取物是原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。
本发明提供的提取物的第三种制备方法：所述提取物是原药材经超临界二氧化碳提取并获得。
本发明的超临界提取物，其特征在于，所述提取物是原药材腊梅属植物经二氧化碳超临界提取，在分离釜中获得提取物，提取的条件可以是一种或多种，例如：
(1)不加夹带剂的提取物；
(2)加夹带剂的提取物；
(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。
超临界二氧化碳提取的条件如下：
萃取釜：
萃取温度为30-70℃；优选为35-60℃；更优选为40-50℃；最优选43-47℃。萃取温度可以选自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。
萃取压力为10-40Mpa；优选为13-35Mpa；优选为16-24Mpa；更优选为18-22Mpa。萃取压力可以选自15Mpa，20Mpa，20.6Mpa，29.6Mpa，30Mpa。
萃取釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个萃取釜的，可以是并联或串联。为了尽量节约原药材的加料和卸料时间，提高生产效率，优选是多个萃取釜并联。在一部分萃取釜加料或卸料的时候，另外的萃取釜同事进行萃取。
萃取剂流速：
萃取剂二氧化碳的流速会对本发明的生产效率产生重大的影响。如果二氧化碳的流速过快，二氧化碳和萃取溶质不能充分接触，会降低每体积二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速过慢，会降低单位时间的生产效率。因此，萃取剂二氧化碳的流速需要一个合适的流速。
萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升(以每公斤药材每小时计，单位为L/H·Kg生药)，即20-150L/H·Kg；优选的萃取剂二氧化碳的流速为23-125L/H·Kg；更优选为33-80L/H·Kg；进一步优选为50-70L/H·Kg；最优选为55-65L/H·Kg。
萃取剂二氧化碳的流速可以选自23.1L/H·Kg；23.8L/H·Kg；28.5L/H·Kg；32.3L/H·Kg；32.8L/H·Kg；36.2L/H·Kg；38.3L/H·Kg；35.3L/H·Kg；44.8L/H·Kg；50.7L/H·Kg；55.4L/H·Kg；75.6L/H·Kg；82.2L/H·Kg。
萃取时间分钟(min)：30-400min，优选120-160min，更优选120-160min，最优选120-160min。萃取时间可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，140-150min，155-165min。例如萃取时间可以是62min，70min，83min，100min，120min，132min，145min，160min。
夹带剂：
本发明的超临界提取方案中，可以选择性的使用夹带剂或不使用夹带剂；优先是使用夹带剂。
本领域常用的溶剂均可以作为本发明的夹带剂。例如本发明的夹带剂可以选自：0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。本文中100％V/V的乙醇水溶液表示无水乙醇；本文中0％V/V的乙醇水溶液表示没有醇的水。例如本发明的夹带剂可以选自：水、无水乙醇、30％-100％V/V的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。优选的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％V/V的乙醇水溶液。更优选的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。最优选的夹带剂选自95％V/V的乙醇水溶液。
夹带剂的量(以每公斤药材计为L/Kg，Kg/Kg；或以每克药材计为ml/g，g/g)：
夹带剂的量为0.10-2.5L/Kg；；优选0.20-1.5L/Kg；，更优选0.30-0.80L/Kg；最优选0.40-0.60L/Kg；
分离釜：
分离釜的温度为25-70℃，优选为30-60℃；更优选为35-55℃，最优选为40-50℃，。
分离釜的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。
分离釜的压力为2-17Mpa；优选为3-15Mpa；更优选为4-12Mpa；最优选为4.5-10Mpa。
分离釜的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa，5.6Mpa，5.7Mpa，5.8Mpa，6Mpa，7Mpa，8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。
分离釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个分离釜的，可以是并联或串联，优选是多个分离釜串联。
分离釜I压力和温度：
分离釜I的温度为30-70℃，优选为50-60℃；更优选为53-57℃；最优选为55℃。分离釜I的温度可以选自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。
分离釜I的压力为4-17Mpa；优选为5-15Mpa；更优选为6-12Mpa；最优选为8-10Mpa。分离釜I的压力可以选自8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。
分离釜II压力和温度：
分离釜II的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜II的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。
分离釜II的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜II的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa。
分离III压力和温度：
分离釜III的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜III的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。
分离釜III的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜III的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa。
分离釜中得到的提取物，就是本发明的腊梅属植物提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；放出分离釜中的提取物；再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-125L/H·Kg生药，再萃取90-300分钟；分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。
所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。
本领域常用的干燥均可以用于本发明，例如：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、热风干燥、远红外线干燥或微波干燥。或联合使用上述一种或多种干燥方式。
本发明提供的提取物的第四种制备方法：所述提取物是原药材经二氧化碳超临界提取后，其剩余的药材再加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。具体的提取方法和第一种方式相同。
在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸渍，或者超临界状态下的提取，或者在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。
如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明任何目的的任何纯度的提取物，提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。
本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的制剂。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂为柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅的提取物制剂。
为了使用的方便本发明中的组合物还包含一种或多种无毒生理学可接受的载体。所述的可接受的载体包括本领域公知的任何辅料及起控释作用的辅料。常用的辅料包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、致孔剂、增塑剂、填充剂、增溶剂和乳化剂。稀释剂可以是但不限于淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是但不限于水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是但不限于滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇；增溶剂和乳化剂可以是但不限于乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。起缓控释作用的辅料可以选自亲水性凝胶材料、蜡脂类材料和不溶性材料的一种或多种。所述的亲水性凝胶材料可以选自羟丙基甲基纤维素、卡波普、羧甲基纤维素钠和海藻酸盐，所述的蜡脂类材料可以选自十六醇、十八醇、蜂蜡、山嵛酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕榈蜡，所述的不溶性材料可以选自乙基纤维素、丙烯酸树脂、聚氧乙烯和聚乙烯。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为此本发明还涉及包含药物组合物和药学上可接受的载体制成的制剂。可通过将组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。该制剂可根据本领域公知的方法制备。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂优选口服制剂、喷雾剂、吸入剂；更优选喷雾剂、吸入剂。
有益技术效果
用水、醇、水蒸气蒸馏、超临界不同提取方法获得腊梅属提取物研究中，发现具有抑制甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌、多耐药铜绿假单胞菌、多耐药肺炎克雷伯菌、多耐药鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌(ESBLS)Eco+、肺炎克雷伯(ESBLs)KPN+的作用，为从畲药民族药寻找严重危害人类健康与生命的耐药菌等预防/治疗用药提供新途径。而超临界加夹带剂提取在腊梅属提取物中应用也是首次。其中：
1.革兰氏耐药阳性菌
1.1甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌
柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对6株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抑制的MIC范围分别4-8g/ml，1-4g/ml，2g/ml，1-8g/ml，1-4g/ml；
1.2甲氧西林耐药表皮葡萄球菌
柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对甲氧西林耐药表皮葡萄球菌抑制作用，其对6株甲氧西林耐药表皮葡萄球菌的MIC范围分别4-8mg/ml，1-4mg/ml，2-4mg/ml，4-8mg/ml，4mg/ml。
2.革兰氏耐药阴性菌
2.1肺炎克雷伯(ESBLs)，KPN+
柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)对2株能产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌有抑制作用，其MIC均为64mg/ml；
2.2多耐药铜绿假单胞菌(PR)
柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对3株多耐药铜绿假单胞菌的MIC为64mg/ml；
2.3多耐药肺炎克雷伯(KR)
柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对3株多耐药铜绿假单胞菌的MIC为64mg/ml；
2.4多耐药鲍曼不动杆菌(AR)
柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对5株多耐药鲍曼不动杆菌(AR)有抑制作用，其MIC范围分别为16mg/ml，16-64mg/ml，16-64mg/ml。
3肠道致病菌
柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、山腊梅挥发油(SYY)、浙江腊梅挥发油(ZYY)对11株肠道致病菌有抑制作用，其MIC的范围为0.26-16.72mg/ml，4-64mg/ml，4-64mg/ml，32-128mg/ml，0.015-30.3mg/ml，16.46-131.67mg/ml，33.75。
4抗菌体内筛选
3个柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY经预防给药对小鼠系统感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA 15-2和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 15-5具有一定的保护作用。
具体实施方式
提取物制备案例
实施例1-11
水提：取粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加水回流提取。第一次加10-16倍水，提取1小时后过滤，第二次加水8-12倍水，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩或水浴锅上浓缩，水浴75℃、转速80rpm，浓缩至比重为1.18-1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。
醇提：取粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加70％乙醇回流提取。第一次加10倍70％的乙醇，提取1小时后过滤，第二次加8倍70％乙醇，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩，水浴65℃、转速80rpm，浓缩至比重为1.18-1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。
挥发油：水提时，装好挥发油提取器，待油产生后收集。
详细参数及结果如下：
实施例12
开启电热控制系统和制冷系统。称取6.4kgLY，置于24L萃取釜中。称取3.2kg95％乙醇，放置于副泵的储箱中，开启副泵(R＝9.1r/min)，60min内加夹带剂结束。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.7MPa、8.5MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为220-240L/h。萃取135min，后处理后，分离釜I收集到1.3g产品，分离釜II收集到产物200.4g，编号LYLJ-2(2-6)，总收率3.15％。
实施例13
称取6.05kgLY，置于24L萃取釜中。当压力稳定时，萃取开始。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5.2MPa、5.2MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.6r/min，二氧化碳流速为350-370L/h，萃取72min，后处理，收集到151g红褐色油状物，收率2.50％，编号LYLW(2-5)。
实施例14
称取6.5kgLY，置于24L萃取釜中。1萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为210-230L/h，萃取103min，后处理，收集到红褐色油状物101g，收率2.05％，编号LYLW(2-2)。
实施例15
在实施例11的基础上，开启副泵(R＝15.5r/min)，15min加入1.55kg95％乙醇，萃取110min，后处理后，收集到产物138.7g，收率2.29％，编号LYLWJ(2-3)。
实施例16
称取6.5kgLY，置于24L萃取釜中。16:20开始升压，16:30萃取开始。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5.5MPa、5.5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为330-360L/h，萃取62min，后处理，收集到红褐色油状物150.9g，收率2.32％，编号LYLW(2-3)。
在以上实验的基础上，开启副泵(R＝15.5r/min)，10min加入1.05kg95％乙醇。萃取62min，后处理，收集到248.43g，收率3.84％，编号LYLWJ(2-1)。
药理实验
试验例1 抗耐药菌及敏感菌筛选
1.试验菌株及其培养方法
葡萄球菌：MH培养基(OXOID生产)加2％NaCl，35-37℃孵育24h。
其它菌种：常规MH培养基，35-37℃孵育16-18h观察结果。
表 体外抗菌活性筛选的受试临床分离菌株
备注：表中标注*为耐药菌
2.体外抗菌试验方法
中药样品体外抗菌最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)的测定参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)抗菌药物敏感性试验操作规程【(Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing；Twenry-Third Informational Supplement)M02-A11、M07-A9和M11-A8，2013】推荐的琼脂二倍稀释法。
2.1头孢吡肟对照品称取药品9.5mg，加入4.1ml的生理盐水，混匀，各吸取1ml于两个培养皿中，再加入15ml的培养基，使其终浓度为145ug/ml，再吸取2ml于西林瓶中，再在该西林瓶中加入2ml的生理盐水，混匀，各吸取1ml加入两个平皿中，再加入15ml的培养基，使其终浓度为72.4ug/ml，依照此法倍比稀释，使平皿内所含药物终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008ug/ml。待冷却后用多点接种仪(MIT-P，SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为104CFU/ml，每皿接种27株菌，2个皿接种54株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。
2.2样品分别取药品于烧杯中，加入50ml的培养基，混匀，各吸取15ml于两个培养皿中，使其终浓度为0.167ml/ml，再在烧杯中加入30ml的培养基，再各吸取15ml于两个培养皿中，使其终浓度为0.083ml/ml，依照此法倍比稀释，使药物终浓度依次为0.167、0.083、0.042、0.021、0.010ml/ml。待冷却后用多点接种仪(MIT-P，SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为104CFU/ml，每皿接种27株菌，2个皿接种54株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MIC)。
3.实验结果及统计方法
以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。统计各受试药物对试验菌株的MIC值及其MIC值范围，并与对照样品进行比较。
表1中药MIC测定结果表(琼脂二倍稀释法)
*注：
MRSA：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌
MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌
MRSE：甲氧西林耐药表皮葡萄球菌
MSSE：甲氧西林敏感表皮葡萄球菌
ECO-：非产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌
ECO+：产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌
KPN-：非产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌
AR：多耐药鲍曼不动杆菌
KPN+：产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌
KR：多耐药肺炎克雷伯菌
PAE：铜绿假单胞菌
PR：多耐药铜绿假单胞菌
试验例2抗肠道致病菌筛选
1.仪器
多点接种仪；培养箱(用于37℃恒温培养)；接种环(环状部分需细丝状)；二级生物安全柜；一次性灭菌培养皿(材质：塑料；数量：160个；规格：直径9mm)；麦氏比浊管(品牌：梅里埃)或麦氏比浊仪；MH培养基；电热炉(用于培养基配制时加热)；小试管(规格：10*100mm，数量：80个)及试管塞；酒精灯：20ul移液枪及枪头；分析天平；注射器(规格：20ml；数量：15个)；试管架2个；烧杯(规格：500ml；数量：6个)；小药芍6个；
2.试剂
MH培养基；0.9％生理盐水200ml；新洁尔灭；
3.菌株表
4.体外抗菌实验方法
中药样品体外抗菌最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)的测定参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)抗菌药物敏感性试验操作规程【(Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing；Twenty-Third Informational Supplement)M02-A11、M07-A9和M11-A8，2013】推荐的琼脂二倍稀释法。
5.样品及对照品配制及接菌
移取样品约4g于烧杯中，加入30ml的培养基，混匀，吸取15ml于培养皿中，使其终浓度为133.333mg/ml，再在烧杯中加入15ml的培养基，再吸取15ml于培养皿中，使其终浓度为66.667mg/ml，依照此法倍比稀释，共15个浓度。待冷却后用多点接种仪(MIT-P，SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为106CFU/ml，每皿接种13株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。
6.实验结果及统计方法
以平皿内未见细菌生长的样品最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。统计各受试样品对试验菌株的MIC值及其MIC值范围，并与对照样品进行比较。
7.实验测定结果
表2
试验例3抗菌体内筛选
1.供试品
3个中药提取物供试品信息见表1
表 供试品信息
2.试验菌株和动物
2.1.受试菌株
根据体外实验结果筛选出甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA 15-2(感染菌量3.0×107CFU/ml)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 15-5(感染菌量3.0×107CFU/ml)作为体内实验的测试菌株。
2.2.试验动物
健康4周龄左右昆明种小鼠，体重为18-22g，雌雄各半，SPF级。
动物使用许可证：SYXK(川)2013-119(四川省实验动物管理委员会颁发)
3.实验方法
3.1.体内保护试验方法
3.1.1.菌液配备
将试验用菌于感染前一天，挑取2-3个单菌落接种于2ml MH肉汤，37℃培养6h，取此菌液0.1ml转种于10ml MH肉汤中，37℃培养18h，该菌液即为原菌液。将该菌液用5％干酵母液进行倍比稀释备用(当日新鲜配制)。
3.1.2.最小致死菌量【Minimum lethal(bacteria amount)Dose，MLD】试验
取健康昆明种小白鼠，体重18～22克，随机分组，每组5只小鼠，雌雄兼用，吸取上述不同稀释浓度菌液，分别腹腔注射入小鼠体内，每20g鼠重注射0.5ml，感染后观察7-14天，并记录小鼠死亡数，以引起小鼠100％死亡的最低菌量作为最小致死菌量【Minimumlethal(bacteria amount)Dose，MLD】，用该菌量作为体内保护试验的感染菌量。
3.1.3.药液配备及给药途径
药液配备：柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY及对照药TQS和莲花请瘟颗粒均用0.5％CMC(羧甲基纤维素)配制成所需浓度的混悬液，备用(灌胃)。
给药途径：灌胃给药
给药容量：0.5ml/20g鼠重
3.1.4.体内保护实验方法
采用预防给药(感染细菌前3天给药，每日1次)，分别于第3日给药后1小时感染受试菌液，4小时后再给药1次，此后每日给药1次(联续给药3天)，至给药组出现死亡，各给药组停止给药，观察各给药组动物的临床症状及死亡时间和死亡动物数。
给药剂量：参考有关该类中药的临床有关资料及体外实验结果，拟设给药剂量为2.0、1.0、0.5g/kg，精确称取受试药物，用药均用0.5％CMC(羧甲基纤维素)配制成所需浓度混悬液，剂量组间矩为1∶0.5。
将小鼠于试验前18小时停食供水，按体重随机分组，每组10只小鼠，雌雄各半，分别腹腔注射感染试验菌液，每20g鼠重注射0.5ml；感染后1h、4h按设计剂量灌胃给药，每20g鼠重给予0.5ml；观察并记录小鼠死亡数，连续观察7-14天，根据小鼠死亡数，用孙瑞元等主编DAS1.0软件按Bliss法计算半数有效剂量ED50及95％可信限。
同时设感染对照组、空白对照组、高剂量药物对照组、溶剂对照组(感染对照组：只感染细菌不给药，感染细菌后即灌胃等体积的生理盐水；空白对照组：不感染细菌，灌胃等体积的生理盐水；高剂量药物对照组：不感染细菌，灌胃等体积的高剂量药物；溶剂对照组：不感染细菌，灌胃等体积的溶剂(0.5％CMC)。
4.试验结果统计
柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY及对照药TQS、莲花请瘟颗粒全身系统感染模型的体内保护实验结果见表3、表4及附表1和附表2。
3个中药提取物及对照药TQS在本次实验条件下对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA15-2和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA15-5所致小鼠全身系统感染呈现有抗菌保护作用；对甲氧西林敏感金葡菌MSSA 15-5的体内保护作用强于耐药金葡菌MRSA 15-2，在2g/kg给药剂量下其死亡率分别依次为40、60、50、30％和60、80、60、40％(见表3、表4)。其半数有效剂量ED50分别依次为1.59、2.26、1.82、1.01g/kg和2.26、＞2.00、2.17、1.60g/kg。3个中药提取物的体内抗菌保护作用与对照TQS相当，较莲花请瘟颗粒(死亡率均为100％)强。各给药组感染受试菌后1-2天临床症状均表现为自主活动明显减少，精神萎靡；死亡动物多发生在感染细菌后1-3天内；未死亡动物7-14天临床症状未见明显逆转。
药物高剂量组：柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY及对照药TQS、莲花请瘟颗粒在2g/kg给药剂量(高剂量药物对照组)下均无动物死亡，临床症状未见异常。表明该给药剂量为无毒剂量。
5.结论
本次试验结果表明：3个柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY经预防给药对小鼠系统感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA 15-2和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 15-5具有一定的保护作用。
本次试验所选用的动物模型为小鼠系统感染败血症模型，对于金葡菌所致感染一般在24-48小时即可至动物死亡，因此本次试验中3个柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY未达到100％的保护率，这可能与中药抗细菌感染的起效比较缓慢有关。

Claims (29)

1.一种腊梅属植物提取物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤：
原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的溶剂选自水、无水乙醇、乙醇水溶液。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的溶剂选自60％-80％的乙醇水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述的溶剂用量是原药材用量的2-30倍。
5.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述溶剂提取步骤的温度是室温到溶剂回流的温度。
6.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取次数是1～5次。
7.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取时间是每次0.5～5小时。
8.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述滤液浓缩的温度是55～90℃。
9.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述滤液浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5。
10.一种腊梅属植物提取物在制备抗菌的药物中的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤
原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。
11.一种腊梅属植物提取物在制备抗菌药物中的的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备是原药材腊梅属植物经超临界二氧化碳提取并获得，提取的条件选自如下任意一种或多种：
(1)不加夹带剂的提取物；
(2)加夹带剂的提取物；
(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。
12.根据权利要求11的应用，其特征在于，所述提取物进行超临界二氧化碳提取时的条件选自如下(1)-(6)中的任意一项或多项：
(1)萃取温度为30-70℃；
(2)萃取压力为10-40Mpa；
(3)分离温度为25-70℃；
(4)分离压力为2-17Mpa。
13.根据权利要求12的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
(1)萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升；
(2)萃取时间为：30-400分钟。
14.根据权利要求12-13中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括使用夹带剂。
15.根据权利要求14的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇、乙酸乙酯、丙酮中至少一种。
16.根据权利要求15的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。
17.根据权利要求14-16中任一项的应用，其特征在于，所述夹带剂的量以每公斤药材计为0.10-2.5L/Kg。
18.根据权利要求12-13中任一项的应用，其特征在于，
分离釜I压力和温度：
分离釜I的温度为30-70℃，分离釜I的压力为4-17Mpa；
分离釜II压力和温度：
分离釜II的温度为25-50℃，分离釜II的压力为2-8Mpa。
19.根据权利要求12-13中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
1)是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，
2)萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，
3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，
4)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa；
5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，
6)分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
20.根据权利要求12-13中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
1)对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜；
2)萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa,加入夹带剂；
3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，
4)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，
5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；
6)分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
21.根据权利要求12-13中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：
1)是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，
2)原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，
3)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，
4)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；
5)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；
6)放出分离釜中的提取物；
7)再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-125L/H·Kg，再萃取90-300分钟；
8)分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。
22.根据权利要求20-21中任一项的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇、乙酸乙酯、丙酮中至少一种。
23.根据权利要求1-22中任一项的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物选自柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。
24.根据权利要求1-23中任一项的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合。
25.一种腊梅属植物在制备抗菌药物中的的应用。
26.根据权利要求1-25中任一项的应用，其特征在于，所述的菌选自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性性菌。
27.根据权利要求26的应用，其特征在于，所述的细菌选自不动杆菌属、杆菌属、弯曲杆菌属、衣原体、披衣菌属、梭菌属、柠檬酸菌属、埃希杆菌属、肠道菌属、肠球菌属、弗朗西斯氏菌属、嗜血杆菌属、缠绕杆菌属、克雷白石杆菌属、李斯特菌属、莫拉均属、分枝杆菌属、奈瑟是菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷菌属、志贺菌属、寡养单胞菌属、葡萄球菌属、连锁状球菌属或涅尔森菌属。
28.根据权利要求27的应用，其特征在于，所述的细菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、屎肠球菌、绿脓杆菌、产气肠杆菌、不动产气肠杆菌、卡他莫拉菌、肠炎沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、罗森沙门氏菌、福氏志贺氏菌。
29.根据权利要求28的应用，其特征在于，所述的细菌选自病菌选自菌甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌S.aureus(Methicllin-resistant，MRSA)、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌S.aureus(Methicin-suseptable)、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis，MRSE)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis，MSSE)、表皮葡萄球菌敏感菌、多耐药铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAE)、多耐药肺炎克雷伯菌、肺炎克雷伯菌(ESBLs)K.penumonia，KPN+、多耐药鲍曼不动杆菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌(ESBLS)Escherichia Coli，Eco+、大肠埃希菌(非ESBLS)Escherichia Coli，Eco-、肠炎沙门氏菌、斯坦利沙门氏菌、罗森沙门氏菌、福氏志贺氏菌。
CN201710395733.3A 2017-05-27 2017-05-27 蜡梅属植物抗致病菌感染的用途 Pending CN107260774A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710395733.3A CN107260774A (zh) 2017-05-27 2017-05-27 蜡梅属植物抗致病菌感染的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710395733.3A CN107260774A (zh) 2017-05-27 2017-05-27 蜡梅属植物抗致病菌感染的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107260774A true CN107260774A (zh) 2017-10-20

Family

ID=60064143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710395733.3A Pending CN107260774A (zh) 2017-05-27 2017-05-27 蜡梅属植物抗致病菌感染的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107260774A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113577115A (zh) * 2021-08-04 2021-11-02 南昌大学 黄金茶挥发油在制备lps诱导急性肺损伤保护药物中的应用
CN114470017A (zh) * 2022-03-10 2022-05-13 江西中医药大学 一种抑菌喷雾剂及其制备方法和应用
CN116355688A (zh) * 2023-04-04 2023-06-30 浙江工业大学 一种柳叶蜡梅挥发油及其减压提取制备方法和用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103284896A (zh) * 2013-01-16 2013-09-11 浙江农林大学 柳叶腊梅杀菌洗手液及其制备方法
CN103405482A (zh) * 2013-01-25 2013-11-27 同济大学丽水中药研究院 柳叶腊梅提取物在制备治疗炎性肠病和减轻化疗药物引起的消化道损伤的药物中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103284896A (zh) * 2013-01-16 2013-09-11 浙江农林大学 柳叶腊梅杀菌洗手液及其制备方法
CN103405482A (zh) * 2013-01-25 2013-11-27 同济大学丽水中药研究院 柳叶腊梅提取物在制备治疗炎性肠病和减轻化疗药物引起的消化道损伤的药物中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刁军成等: "山腊梅叶消毒抑菌的实验研究", 《江西中医药》 *
刘祝祥等: "腊梅叶挥发性成分及其抑菌活性研究", 《湖南农业科学》 *
李萍等: "山腊梅感冒茶抑菌抗炎解热作用的实验研究", 《中国中医药科技》 *
葛发欢: "《中药超临界二氧化碳萃取技术研究》", 21 March 2014 *
贺学礼: "《植物生物学》", 31 July 2009 *
赵莹等: "腊梅花挥发油成分分析及生物活性初探", 《时珍国医国药》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113577115A (zh) * 2021-08-04 2021-11-02 南昌大学 黄金茶挥发油在制备lps诱导急性肺损伤保护药物中的应用
CN114470017A (zh) * 2022-03-10 2022-05-13 江西中医药大学 一种抑菌喷雾剂及其制备方法和应用
CN116355688A (zh) * 2023-04-04 2023-06-30 浙江工业大学 一种柳叶蜡梅挥发油及其减压提取制备方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Najafi et al. Phytochemical screening and antibacterial activity of Citrullus colocynthis (Linn.) Schrad against Staphylococcus aureus
KR20110125318A (ko) 식물혼합추출물을 함유하는 항균효능을 갖는 조성물
Bankole et al. Synergistic antimicrobial activities of phytoestrogens in crude extracts of two sesame species against some common pathogenic microorganisms
Ekwenye et al. The antibacterial activity of crude leaf extract of Citrus sinensis (sweet orange)
CN107260774A (zh) 蜡梅属植物抗致病菌感染的用途
Oladipupo et al. Phytochemical analysis and antimicrobial effect of Chrysophillum albidum leave extract on gastrointestinal tract pathogenic bacteria and fungi in human
CN108926584A (zh) 山腊梅提取物抗微生物的用途
Falana et al. Evaluation of phytochemical constituents and in vitro antimicrobial activities of leaves extracts of Calotropis procera against certain human pathogens
CN105412535B (zh) 一种治疗感冒的药物组合物在制备抗菌的药物中的应用
Koma et al. Phytochemical screening and in vitro antimicrobial activity of Waltheria Indica Linn leaf extracts
AREKEMASE et al. In-vitro Sensitivity of Selected Enteric Bacteria to Extracts of Allium sativum L.
CN113350440A (zh) 一种中药组合物在制备抗菌药物中的应用
KR100777834B1 (ko) 물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을포함하는 항균조성물
Njokuocha et al. Antibacterial and phytochemical properties of crude leaf extracts of Moringa oleifera Lam., Pterocarpus santalinoides L’Herit DC and Ceiba pentandra L. on some clinical bacterial isolates in Nigeria
US20220016193A1 (en) ANTIBACTERIAL AND ANTIVIRUS COMPOSITION COMPRISING Extract of CANNABIS SATIVA L.
CN107334793A (zh) 腊梅属植物抗幽门螺旋杆菌的用途
Oloninefa et al. Phytochemical screening and antibacterial susceptibility of whole plant of Euphorbia heterophylla crude extracts against selected bacteria pathogens
CN115624579A (zh) 一种抑制维氏气单胞菌的中药组合物及其应用
CN109316533B (zh) 一种清除猪体内毒素的发酵中药复方制剂及其应用
CN108926585A (zh) 腊梅属植物提取物在制药中的应用
Gulzar et al. Phytochemical screening, antimicrobial and anticancerous activities of two different plant extracts
Kulshrestha et al. The antimicrobial activity of Bauhinia variegata Linn. flower extract (methanolic)
Akuodor et al. In vitro antimicrobial activity of leaf extract of Berlina grandiflora Hutch. and Dalz.
Eleazar et al. Phytochemistry and antibacterial activity of entanda abyssinica leaf extracts
CN107158052A (zh) 地稔提取物在制备药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171020

RJ01 Rejection of invention patent application after publication