CN108926585A - 腊梅属植物提取物在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了腊梅属植物提取物在制药中的应用，具体涉及腊梅属植物及其提取物在制备预防/治疗多种疾病的药物应用，所述的蜡梅属包括柳叶蜡梅、浙江蜡梅或山腊梅；所述的提取物包括水提、醇提、水蒸气蒸馏和超临界提取。

Description

腊梅属植物提取物在制药中的应用

技术领域

本发明具体涉及腊梅属提取物的制备方法和制药用途，所述的蜡梅属包括柳叶蜡梅、浙江蜡梅或山腊梅，属于医药技术领域。

背景技术

1.腊梅属

蜡梅属柳叶蜡梅(Chimonanthussalicifolius S.Y.Hu)、浙江蜡梅(Chimonanthuszhejiangensis M.C.Liu)或山腊梅(Chimonanthus nitens Oliv.)等为畲族民间习用药，从北宋年间起其干燥叶就作为服用的食凉茶，近千年来用于治疗和预防感冒。现代研究又有进展，其中，山腊梅提取物制备的颗粒制剂，有良好治疗/预防感冒功效，已在市场销售；柳叶蜡梅和浙江腊梅已载入2005和2015年的《浙江省中药炮制规范》，主要成分为挥发油，含有1.8-桉叶素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、榄香醇等40多种成分。传统用途：性味微苦，辛，凉，归肺、脾、胃经，用于治疗感受风寒而引起肚胀、肚痛腹泻，因饮食不当引起的消化不良、腹部胀痛和小儿疳积等症状。

2.浙江腊梅

浙江腊梅为腊梅科腊梅属常绿灌木，产于浙江。群体遗传学研究发现浙江腊梅和山腊梅相对近缘，山腊梅在湖南、福建、广西贵州等地均有分布，而浙江腊梅未见分布，浙江腊梅仅分布于浙江龙泉，因此，结合形态、分子及地理分布特征，我们认为浙江蜡梅是山蜡梅分布区的最东边界的一个群体，可能只是山蜡梅的一种生态型(ecotype)，而不是独立的分类单位。

蜡梅属柳叶蜡梅(Chimonanthussalicifolius S.Y.Hu)、浙江蜡梅(Chimonanthuszhejiangensis M.C.Liu)或山腊梅(Chimonanthus nitens Oliv.)等为畲族民间的习用药。有近千年历史服用的食凉茶就是其干燥叶，从北宋年间起即用于治疗和预防感冒。柳叶蜡梅和浙江腊梅已载入2005和2015年的《浙江省中药炮制规范》，主要成分为挥发油，用于治疗伤食所致的痞满和慢性胃炎、胃和十二指肠溃疡引起的胃酸、胃胀、泛酸等，及防治感冒和流行性感冒。

3.山腊梅

山腊梅和柳叶腊梅、浙江腊梅同属蜡梅科腊梅属植物，我国特产，主要分布于我国亚热带季风湿润气候区域的鄂、湘、川、渝、贵、豫、浙、赣、皖等省。

山腊梅(Chimonanthus nitens)为常绿灌木，又称之为毛山茶、岩马桑(《新华本草纲要》)、亮叶腊梅(《经济植物手册》)、香风茶(《安徽中草药》)、野腊梅(《云南中药资源名录》)。产于安徽、浙江、江苏、江西、福建、湖北、湖南、广西、云南、贵州和陕西等省区。民间使用历史悠久，具有防治感冒、痰喘、咳嗽、慢性支气管炎、细菌感染、发热疼痛、炎症、蚊虫叮咬及高血压、高血脂等作用，亦有抗肿瘤、防治心脑血管疾病、改善微循环和抗衰老、抗氧化等作用，另外还具有调节人体机能、增强体质、提高机体免疫力、减少体脂、减肥等保健功能。该植物主产于江西德兴大茅山区、婺源怀玉山区、安徽徽州齐云山一带，在浙江、福建、陕西等省亦有分布，资源较丰富。山腊梅挥发油中主要成分是烯烃、醇类和烷酸类物质，分别为脱氢香橙烯、△-杜松烯、E-环氧金合欢烯、石竹烯、(-)-氧化石竹烯、α-杜松醇(7.08％)、(+)-匙叶桉油烯醇、杉木醇、十六烷酸。榄香烯等倍半萜类合物具有较好的抗肿瘤活性，黄酮类成分具有防治心脑血管疾病、改善微循环和抗衰老等多种功效。山腊梅药片的温热蒸发物可抑制病毒，山腊梅挥发油可抑制和杀灭病毒。

1982年，《江西省药品标准》就记载了“山腊梅片”和“山腊梅冲剂”，作为防治感冒和流行性感冒制剂在临床上应用，市售良好。与山腊梅同属的柳叶蜡梅和浙江腊梅虽在民间使用普遍，但在市场上还未有适合的制剂。

药理研究中山蜡梅未见抗伪狂犬病毒的研究文献报道。CO2超临界萃取技术具有低温、快速、效率高、无污染、提取物纯度高、易分离等优点，适用于挥发油的提取。

4.结核菌

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种慢性致死性疾病，是危害人类健康和导致人类死亡的重大传染性疾病，其致死率仅次于艾滋病(AIDS)。由于抗结核药物的大量使用和抗结核作用位点的突变，导致耐多药结核病(MDR-TB)不断出现，再加上近年来患有艾滋病人口数量的增长，使结核病与人类免疫缺陷病毒(HIV)并发发病率急剧增加，这些问题的出现都给结核病的治疗带来巨大的挑战。2011年全球有870万人罹患TB，并有140万人死亡(其中非艾滋病患者约100万)。我国是全球22个TB流行最严重的国家之一，据2010年全国第五次结核病流行病学调查估计年发病人数为130万，占全球新发病人数的14.3％，是全球第二大结核病高负担国家。中药的资源丰富、毒副作用小以及不易产生耐药等特点和优势，使得抗结核的中药在日益严峻的结核治疗方面存在前景。

5.幽门螺旋杆菌

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，简称H.pylori、Hp或HP)普遍存在于人胃黏膜中的一种微需氧革兰氏阴性菌。HP感染可引起多种慢性胃病，如消化性溃疡、胃炎、以至胃癌，研究显示H.pylori的感染潜在增加2.7-12.0倍的胃癌危险。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。目前国际上推荐的一线治疗方案主要以质子泵抑制剂(PPI)或铋剂为基础，合并两种抗生素组成的三联疗法，根除率达90％。但目前其毒副反应大、易继发耐药、产生二重感染、患者依从性等问题。

6.耐药菌

近年来，滥用化药抗菌药情况普遍，致使耐药性越来越严重，临床治疗难度增大，疗效差，严重威胁患者生命健康。

6.1.革兰氏阳性菌

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，能产生多种毒素、酶及抗原蛋白，具有较强的致病力，能引起皮肤软组织感染，血液及全身各脏器感染。该菌具有广谱耐药性，对β-内酰胺类抗生素如青霉素G和头孢类抗生素如头孢吡肟、头孢唑啉、头孢噻肟的耐药率均为100％，对大环内酯类抗生素如克林霉素、氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、四环素的耐药率均高于60％，对利福平的耐药性已上升且大于50％。表皮葡萄球菌(MRSE)是机会致病菌，可引发尿路感染、菌血症、术后伤口感染和心肌炎、瓣膜修复术后心内膜炎、骨髓炎、透析性腹膜炎等，死亡率可达63％-74％。近年来发现，耐甲氧西林表皮葡萄球菌占表皮葡萄球菌的2/3，对头孢氨苄、头孢唑林、头孢哌酮、头孢噻肟、去甲万古霉素均有耐药性。

6.2.革兰氏阴性菌

耐药的肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，在院内感染的败血症中，病死率较高。产β-内酰胺酶大肠杆菌是严重的耐药致病菌，耐药机制复杂，其中致病菌能够打开β-内酰胺环，使具该结构的抗生素如青霉素类、头孢类失去活性。

7.胃肠致病菌

7.1.福氏志贺氏菌

福氏志贺菌(Shigella flexneri)，是志贺菌的一种，有14个血清型或亚型，是一类不形成芽孢的细菌，能够侵袭大肠引起典型菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)，是一种具有高度传染性和严重危害性的肠道传染病，严重危害人类的健康和生命安全。是发展中国家的主要感染菌株，2a是主要的血清型，近几年来我国每年大约有2000万人次感染痢疾，年累计发病数一直位于第三位。由于志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌)，最常见的扩散形式是人与人之间的传播，5岁以下儿童和免疫障碍的人为主要感染人群。

7.2.副溶血性弧菌

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种噬盐性弧菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。

7.3.鼠伤寒沙门氏菌

鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)属多价O抗血清的B群，是一种重要的人畜共患病原菌，其感染发病率居沙门菌感染的首位，占40％～80％，且多见于婴幼儿，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高。

7.4.肠炎沙门氏菌

肠炎沙门氏菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌，感染后的典型症状包括发热、腹泻和呕吐等。

8.病毒

8.1流感病毒

流感病毒属于正粘病毒科，为极易变异的负链RNA病毒，可引起急性呼吸道感染，即流感。流感病毒主要通过空气飞沫传播，分为甲、乙、丙三型，由于甲型更容易发生变异，流行最为广泛和严重。流感一旦流行，传播快，波及面广，对人民健康和劳动生产力有很大影响，而且对年老体弱多病者及婴幼儿的威胁很大，常因导致并发症而死亡。目前，流感是我国重点监测疾病，在我国《传染病防治法》中列为丙类传染病进行管理。

8.2手足口病毒

手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，主要是由71型(EV71)感染引起，易引起爆发或流行，传染性强，重症病例比例大，目前尚无特殊的治疗药物与方法。

8.3疱疹病毒

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)感染是一种常见的传染病，其感染部位广泛，常发于癌症或其他慢性病应用各种免疫抑制剂的患者中。近年来，HSV发病率急剧增高，严重威胁着人类公共卫生健康。目前，国内外研究的抗病毒药物接近50种，应用到临床治疗全身性感染的仅无环鸟苷有效，但已被发现有耐药株发生。因此，大力开发研制新的低毒、高效的抗病毒药物刻不容缓。中草药来源广泛，现已成为研究热点。

水痘-带状疱疹病毒(ZVZ)为一种α-疱疹病毒，它在人类可引起水痘和带状疱疹两种常见疾病。带状疱疹的临床表现以沿周围神经分布的群集疱疹和以神经痛为特征。VZV通过神经系统感染人体，经历两次病毒血症后，病毒到达皮肤表层，而产生典型的疱疹样皮损。随后病毒又进入周围神经系统，并潜伏在脊神经节。VZV具有高度的种属特异性，其自然感染仅发生于人与大猩猩。

8.4伪狂犬病毒

伪狂犬病(Porcine Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病。发热、奇痒、脑脊髓炎是主要的发病症状。成年猪主要表现为隐形感染，妊娠母猪感染后主要表现为流产、死胎和呼吸系统疾病症状，无奇痒。新生猪仔感染后除了出现神经症状外还可侵害消化系统。本病呈世界性分布。猪是该病毒的主要宿主、长期储存者和排毒者，也是重要的病毒传播者。猪伪狂犬病毒给猪养殖业造成的损害仅次于猪瘟，每年会有数十亿美元的经济损失。

1960年以后该病已遍及全世界50多个国家。我国目前有20多个省市发现了该病，并且呈现不断蔓延扩大的趋势。目前针对该病没有特效药，只能用疫苗进行预防，一旦该病在集约化猪场开始流行将会对猪养殖业造成重大经济损害。另外，伪狂犬病毒也会感染鸡、猫、狗、牛等动物，而现有疫苗只对猪感染有预防作用，所以，开发针对该病的有效药迫切而急需。

9.炎症

炎症是人类的一种多发病、常见病，严重影响人类健康和劳动者生产效率的疾病；有些反复发作并渐续加重的会成慢性炎性疾病，给患者带来极大痛苦。临床治疗的药物主要包括甾体(SAID)和非甾体(NSAID)两类抗炎药，虽然可供使用的药物很多，但多存在着较严重副作用。甾体类抗炎药有产生激素依赖性、免疫抑制及影响全身代谢的副作用；非甾体类抗炎药又抑制花生四烯酸环氧酶，减少前列腺素(PG)的生成，易造成胃肠粘膜损伤。因此寻找高效、低毒副作用低的新药是医药行业关注热点，其中对天然来源抗炎药也寄予厚望。

发明内容

发明概述

本发明要解决的技术问题是提供一种新的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物。

所述的腊梅科腊梅属植物包括：柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅。

在本发明的具体实施方案中，所述的提取物为以下一种或多种：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳萃取。

本发明第二方面提供了上述腊梅属植物提取物的制备方法。

本发明第三方面提供了含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的口服制剂。

本发明第四方面提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备药物中的应用。

发明详述

本发明要解决的技术问题是提供一种新的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备药物中的应用。

本发明中所述的药材或原药材是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。本发明中所述的生药也是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。

本发明的腊梅属植物包括腊梅属植物的鲜品或干品；腊梅属植物的药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合；优选的药用部位选自腊梅属植物的地上部分、茎、茎皮、叶或任意组合；更优选的药用部位选自腊梅属植物的茎或叶；最优选的药用部位选自腊梅属植物的叶。

本发明的第二方面提供了腊梅属植物提取物的制备方法。

在本发明的具体实施方案中，所述的腊梅属植物提取物为以下用水提、醇提、水蒸气蒸馏及超临界二氧化碳提取一种或多种：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳提取物。

为了加快提取速度，提高提取收率，可以对腊梅属原药材进行粉碎，粉碎后的平均粒径优选10-80目，更优选是20-65目，最优选是30-50目。

本发明提供的提取物的第一种制备方法：

所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。

所述的溶剂：本领域常用的溶剂均可以用于本发明。优选溶剂水和C1-C5的醇类。C1-C5的醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。选自水、无水乙醇、乙醇水溶液；更优选溶剂选自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶剂相比，具有低毒，防腐，污染小，价格低等优点，更适合于本发明应用于医药产品工业化大生产。

乙醇水溶液的浓度(乙醇水溶液中含有的乙醇的体积百分比)：优选30％-100％的乙醇水溶液，更优选50％-95％的乙醇水溶液，进一步优选60％-80％的乙醇水溶液，最优选75％的乙醇水溶液。

溶剂的量是指提取每公斤原药材所用的溶剂量，即提取每公斤药材计使用溶剂的重量(单位Kg)或体积(单位L)。溶剂用量是原药材用量的2-30倍；更优选5-16倍；进一步优选6-15倍；最优选8-10倍。

提取的温度：优选是室温到溶剂回流的温度；更优选是40℃-溶剂回流的温度；进一步优选是50℃-溶剂回流的温度；最优选是溶剂回流的温度。

提取的次数：可以是1～5次；优选是2～3次。

提取的时间：每次0.5～5小时；优选每次0.5～3小时；更优选每次1～3小时。

浓缩的温度：可以是55～90℃；优选62～80℃；更优选65～75℃。

浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5，优选1.2～1.4。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经水提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的水提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-16倍的水提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-16倍的水提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经乙醇提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并浓缩滤液，干燥获得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，经浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。

在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，60～90℃(包括65～75℃)浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。

本发明提供的提取物的第二种制备方法：所述提取物是原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。

本发明提供的提取物的第三种制备方法：所述提取物是原药材经超临界二氧化碳提取并获得。

本发明的超临界提取物，其特征在于，所述提取物是原药材腊梅属植物经二氧化碳超临界提取，在分离釜中获得提取物，提取的条件可以是一种或多种，例如：

(1)不加夹带剂的提取物；

(2)加夹带剂的提取物；

(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。

超临界二氧化碳提取，可以使用优选的是

超临界二氧化碳提取的条件如下：

萃取釜：

萃取温度为30-70℃；优选为35-60℃；更优选为40-50℃；最优选43-47℃。萃取温度可以选自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。

萃取压力为10-40Mpa；优选为13-35Mpa；优选为16-24Mpa；更优选为18-22Mpa。萃取压力可以选自15Mpa，20Mpa，20.6Mpa，29.6Mpa，30Mpa。

萃取釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个萃取釜的，可以是并联或串联。为了尽量节约原药材的加料和卸料时间，提高生产效率，优选是多个萃取釜并联。在一部分萃取釜加料或卸料的时候，另外的萃取釜同事进行萃取。

萃取剂流速：

萃取剂二氧化碳的流速会对本发明的生产效率产生重大的影响。如果二氧化碳的流速过快，二氧化碳和萃取溶质不能充分接触，会降低每体积二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速过慢，会降低单位时间的生产效率。因此，萃取剂二氧化碳的流速需要一个合适的流速。

萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升(以每公斤药材每小时计，单位为L/H·Kg生药)，即20-150L/H·Kg；优选的萃取剂二氧化碳的流速为23-125L/H·Kg；更优选为33-80L/H·Kg；进一步优选为50-70L/H·Kg；最优选为55-65L/H·Kg。

萃取剂二氧化碳的流速可以选自23.1L/H·Kg；23.8L/H·Kg；28.5L/H·Kg；32.3L/H·Kg；32.8L/H·Kg；36.2L/H·Kg；38.3L/H·Kg；35.3L/H·Kg；44.8L/H·Kg；50.7L/H·Kg；55.4L/H·Kg；75.6L/H·Kg；82.2L/H·Kg。

萃取时间分钟(min)：30-400min，优选120-160min，更优选120-160min，最优选120-160min。萃取时间可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，140-150min，155-165min。例如萃取时间可以是62min，70min，83min，100min，120min，132min，145min，160min。

夹带剂：

本发明的超临界提取方案中，可以选择性的使用夹带剂或不使用夹带剂；优先是使用夹带剂。

本领域常用的溶剂均可以作为本发明的夹带剂。例如本发明的夹带剂可以选自：0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。本文中100％V/V的乙醇水溶液表示无水乙醇；本文中0％V/V的乙醇水溶液表示没有醇的水。例如本发明的夹带剂可以选自：水、无水乙醇、30％-100％V/V的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。优选的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％V/V的乙醇水溶液。更优选的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。最优选的夹带剂选自95％V/V的乙醇水溶液。

夹带剂的量(以每公斤药材计为L/Kg，Kg/Kg；或以每克药材计为ml/g，g/g)：

夹带剂的量为0.10-2.5L/Kg；；优选0.20-1.5L/Kg；，更优选0.30-0.80L/Kg；最优选0.40-0.60L/Kg；

分离釜：

分离釜的温度为25-70℃，优选为30-60℃；更优选为35-55℃，最优选为40-50℃，。

分离釜的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。

分离釜的压力为2-17Mpa；优选为3-15Mpa；更优选为4-12Mpa；最优选为4.5-10Mpa。

分离釜的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa，5.6Mpa，5.7Mpa，5.8Mpa，6Mpa，7Mpa，8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。

分离釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个分离釜的，可以是并联或串联，优选是多个分离釜串联。

分离釜I压力和温度：

分离釜I的温度为30-70℃，优选为50-60℃；更优选为53-57℃；最优选为55℃。分离釜I的温度可以选自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。

分离釜I的压力为4-17Mpa；优选为5-15Mpa；更优选为6-12Mpa；最优选为8-10Mpa。分离釜I的压力可以选自8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。

分离釜II压力和温度：

分离釜II的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜II的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。

分离釜II的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜II的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa。

分离釜III压力和温度：

分离釜III的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜III的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。

分离釜III的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜III的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa。

分离釜中的得到的提取物，就是本发明的腊梅属植物提取物。

在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。

在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。

所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。

在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；放出分离釜中的提取物；再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-125L/H·Kg生药，再萃取90-300分钟；分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。

所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。

本领域常用的干燥均可以用于本发明，例如：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、热风干燥、远红外线干燥或微波干燥。或联合使用上述一种或多种干燥方式。

本发明提供的提取物的第四种制备方法：所述提取物是原药材经二氧化碳超临界提取后，其剩余的药材再加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。具体的提取方法和第一种方式相同。

所述的溶剂优选自水、无水乙醇、乙醇水溶液。

所述的溶剂优选自60％-80％的乙醇水溶液。

所述的溶剂用量优选是原药材用量的2-30倍。

所述溶剂提取步骤的优先温度是室温到溶剂回流的温度。

所述溶剂提取步骤的提取次数优选是1～5次。

，所述溶剂提取步骤的提取时间是每次优选0.5～5小时。

所述滤液浓缩的温度优选是55～90℃。

所述滤液浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5。

在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸渍，或者超临界状态下的提取，或者在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。

如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明任何目的的任何纯度的提取物，提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。

本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的制剂。

本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂为柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅的提取物制剂。

为了使用的方便本发明中的组合物还包含一种或多种无毒生理学可接受的载体。所述的可接受的载体包括本领域公知的任何辅料及起控释作用的辅料。常用的辅料包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、致孔剂、增塑剂、填充剂、增溶剂和乳化剂。稀释剂可以是但不限于淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是但不限于水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是但不限于滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇；增溶剂和乳化剂可以是但不限于乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。起缓控释作用的辅料可以选自亲水性凝胶材料、蜡脂类材料和不溶性材料的一种或多种。所述的亲水性凝胶材料可以选自羟丙基甲基纤维素、卡波普、羧甲基纤维素钠和海藻酸盐，所述的蜡脂类材料可以选自十六醇、十八醇、蜂蜡、山嵛酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕榈蜡，所述的不溶性材料可以选自乙基纤维素、丙烯酸树脂、聚氧乙烯和聚乙烯。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为此本发明还涉及包含药物组合物和药学上可接受的载体制成的制剂。可通过将组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。该制剂可根据本领域公知的方法制备。

本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂优选口服制剂、喷雾剂、吸入剂；更优选喷雾剂、吸入剂。

本发明第四方面提供了腊梅属提取物或组合物在制备抗炎药物中的应用。

本发明第四方面提供了腊梅属提取物或组合物在制备镇痛药物中的应用。

本发明第四方面提供了腊梅属提取物或组合物在制备防治动物微生物感染疾病的药物中的应用。所述的动物选自家畜、家禽、伴侣动物、野生动物、鸟类。

本发明第四方面提供了腊梅属提取物或组合物在制备畜牧饲料添加剂的应用。

本发明第四方面提供了腊梅属提取物或组合物在制备消杀剂中的应用。

本发明第四方面提供了腊梅属植物作为畜牧饲料的应用。

有益技术效果：

本发明的腊梅属植物和腊梅属提取物存在如下有益技术效果。

一、抗菌：

用水、醇、水蒸气蒸馏、超临界不同提取方法获得腊梅属提取物研究中，发现具有抑制甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌、多耐药铜绿假单胞菌、多耐药肺炎克雷伯菌、多耐药鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌(ESBLS)Eco⁺、肺炎克雷伯(ESBLs)KPN⁺的作用，为从畲药民族药寻找严重危害人类健康与生命的耐药菌等预防/治疗用药提供新途径。而超临界加夹带剂提取在腊梅属提取物中应用也是首次。其中：

1.革兰氏耐药阳性菌

1.1甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌

柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对6株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抑制的MIC范围分别4-8g/ml，1-4g/ml，2g/ml，1-8g/ml，1-4g/ml；

1.2甲氧西林耐药表皮葡萄球菌

柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对甲氧西林耐药表皮葡萄球菌抑制作用，其对6株甲氧西林耐药表皮葡萄球菌的MIC范围分别4-8mg/ml，1-4mg/ml，2-4mg/ml，4-8mg/ml，4mg/ml。

2.革兰氏耐药阴性菌

2.1肺炎克雷伯(ESBLs)，KPN⁺

柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)对2株能产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌有抑制作用，其MIC均为64mg/ml；

2.2多耐药铜绿假单胞菌(PR)

柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对3株多耐药铜绿假单胞菌的MIC为64mg/ml；

2.3多耐药肺炎克雷伯(KR)

柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对3株多耐药铜绿假单胞菌的MIC为64mg/ml；

2.4多耐药鲍曼不动杆菌(AR)

柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)对5株多耐药鲍曼不动杆菌(AR)有抑制作用，其MIC范围分别为16mg/ml，16-64mg/ml，16-64mg/ml。

3肠道致病菌

柳叶蜡梅挥发油(LYY)、柳叶蜡梅水提物(LYS)、柳叶蜡梅醇提物(LYC)、柳叶蜡梅加夹带剂萃取物(LYLJ)、柳叶蜡梅不加夹带剂萃取物(LYLW)、山腊梅挥发油(SYY)、浙江腊梅挥发油(ZYY)对11株肠道致病菌有抑制作用，其MIC的范围为0.26-16.72mg/ml，4-64mg/ml，4-64mg/ml，32-128mg/ml，0.015-30.3mg/ml，16.46-131.67mg/ml，33.75。

4抗菌体内筛选

3个柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY经预防给药对小鼠系统感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA 15-2和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 15-5具有一定的保护作用。

二、抗幽门螺旋杆菌

柳叶腊梅挥发油(LYY)对幽门螺旋杆菌，2株标准株(ATCC700392、SS1)和1株多重耐药株的最低抑菌浓度(MIC)分别为4mg/ml、4mg/ml、2mg/ml优于头花蓼。柳叶蜡梅的醇提物(LYC)和柳叶蜡梅的水提物(LYS)对3株幽门螺旋杆菌的MIC分别为1mg/ml、4mg/ml、16mg/ml和8mg/ml、8mg/ml、8mg/ml。

超临界加夹带剂的萃取产物LYLJ-2-Y对H.pyloriATCC700392的MIC为2mg/mL，对SS1的MIC为8mg/mL，对临床多重耐药菌株的MIC为4mg/mL；四种柳叶蜡梅提取物对H.pylori的抗菌活性较强，对H.pylori耐药菌株也具有较强抗菌活性。

三、抗结核杆菌

柳叶蜡梅超临界加夹带剂萃取物(LYLJ)、柳叶蜡梅超临界不加夹带剂萃取物(LYLW)、柳叶腊梅挥发油(LYY)、浙江腊梅挥发油(ZYY)和山腊梅挥发油(SYY)对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的最低抑菌浓度分别为0.312mg/ml、0.632mg/ml、1.169mg/ml、0.625mg/ml、0.625mg/ml，抑制效果显著。

本发明提取物抗结核杆菌抗效果强度顺序分别是：(1)超临界加夹带剂萃取物(LYLJ)＞(2)超临界不加夹带剂萃取物(LYLW)＞(3)挥发油(LYY)＞(4)醇提物>(5)水提物。

四、流感病毒

三种腊梅的四种工艺提取物对三种模型均有效；不同品种的不同样品各有优势；为杀灭、预防和治疗流感病毒三个不同应用领域研究提供较多的选择余地。

五、抗疱疹病毒

柳叶蜡梅、浙江腊梅、山腊梅三种腊梅品种的水提、挥发油和超临界提取物均有不同程度的抗疱疹病毒的作用。具体数据如下：

对单纯疱疹病毒HSV-I：LYS有效浓度(抑制率)为50ug/ml(25％)；SYS有效浓度(抑制率)为200ug/ml(25％)；ZYS有效浓度(抑制率)为200ug/ml(50％)、100ug/ml(25％)；ZYY有效浓度(抑制率)为200ug/ml(50％)、100ug/ml(25％)；SYY有效浓度(抑制率)为100ug/ml(50％)、50ug/ml(25％)；LYLJ-2-Y(2-6)有效浓度(抑制率)为50μg/mL(50％)、25μg/mL(25％)；LYLJ-1-Y(2-3)有效浓度(抑制率)为12.5μg/mL(25％)；LYLJ-1-B(2-4)有效浓度(抑制率)为100μg/mL(25％)、50μg/mL(25％)；LYLWJ-1-B(2-3)有效浓度(抑制率)为50μg/mL(25％)；LYLW-(2-2)有效浓度(抑制率)为50μg/mL(25％)；

对单纯疱疹病毒HSV-II：LYLJ-2-Y(2-6)有效浓度(抑制率)为50μg/mL(75％)、25μg/mL(50％)；LYLJ-1-B(2-4)有效浓度(抑制率)为100μg/mL(50％)、50μg/mL(25％)；LYLJ-1-Y(2-3)有效浓度(抑制率)为12.5μg/mL(25％)；LYLWJ-1-B(2-3)有效浓度(抑制率)为50μg/mL(25％)；LYLW-(2-2)有效浓度(抑制率)为50μg/mL(25％)。

六、抗EV71病毒

EV71可引起手足口病且引发重症病例的概率较高。目前，手足口病治疗无特效药。本发明提供了制备治疗EV71病毒感染的药物的提取物，为EV71病毒感染而引起的手足口病药物的开发提供了潜在的可能性。在本发明的研究过程中发现超临界样品LYLJ对MDCK细胞的最大无毒浓度为4978μl/ul，此浓度时该样品对EV71病毒有明显的抗病毒活性。

七、抗伪狂犬病毒

目前，伪狂犬病遍及全世界50多个国家，在我国有20多个省市发现该病，且仍在不断蔓延扩大，更为严重的是伪狂犬病尚无有效药。本发明提供了制备直接杀灭伪狂犬病毒的药物和制备预防和/或治疗伪狂犬病毒感染的药物的提取物，为伪狂犬病毒的杀灭和伪狂犬病的预防和治疗药物的开发提供了潜在的可能性。

在本发明的研究过程中发现三个品种腊梅柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅的水提、醇提、挥发油和超临界样品对伪狂犬病毒均有不同程度的杀灭、阻断和抑制作用。其中，对病毒的直接杀灭作用尤为显著，杀灭率均大于50％，对病毒的抑制效果也较佳，抑制率接近50％，对病毒亦有明显阻断作用。

八、抗炎

小鼠耳肿胀作为抗炎普筛，筛选出柳叶蜡梅挥发油(LYY)具有一定抗炎苗头。当给药剂量为10g/kg时，其肿胀抑制率为26.4％。

九、镇痛

镇痛试验结果显示，与空白对照组比较，罗通定组动物的扭体数明显降低(P＜0.01)，镇痛率高。柳叶蜡梅显示出一定的镇痛作用，作用比较稳定的样品为LYY。

具体实施方式

提取物制备例

一、(三个种的水提物)

实施例1-4

取粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加水回流提取。第一次加10-16倍水倍水，提取1小时后过滤，第二次加水8-12倍，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩或水浴锅上浓缩，水浴75℃、转速80rpm，浓缩至比重为1.18-1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。柳叶蜡梅的水提物编号LYS，浙江腊梅的水提物编号ZYS，山腊梅的水提物编号SYS。

二、3个品种的醇提物

实施例5-7

醇提：取柳叶腊梅干燥老叶粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加乙醇回流提取。第一次加10倍乙醇，提取1小时后过滤，第二次加乙醇8倍，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩，水浴65℃、转速80rpm，浓缩至比重为1.18-1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。

三、3个品种的水蒸气蒸馏挥发油

实施例8-11

称取适量已粉碎的药材，装入5-20倍水提时，装好挥发油提取器，待油产生后收集。

四、超临界萃取物(柳叶蜡梅)

4.1超临界不加夹带剂

4.1.1不分分离釜收集

实施例12-17

称取200g粉碎好的柳叶腊梅，放入到萃取池中。当温度稳定，通入二氧化碳。当萃取釜的压力达到20MPa，调节分离釜1的压力，稳定，循环，开始计录萃取时间。不同的萃取条件如：

实施例18

称取4.5kg柳叶蜡梅，置于24L萃取釜中，打开冷却系统和加热控制系统。

压力稳定后，萃取开始。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8.5MPa、4.8MPa、4.8MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.6r/min，二氧化碳流速为340-370L/h。

从分离釜II出料口收集产物，当基本无产物时停止实验，用时160min。后处理：分液漏斗分出上层红褐色油状物96.1g，收率2.14％，编号LYLW(2-1)。

实施例19

称取6.5kg柳叶蜡梅，置于24L萃取釜中。压力稳定后，萃取开始。萃取釜、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为210-230L/h。

分离釜II放出300ml黄色膏状泡沫，半个小时后放出少许产品，停止实验，耗时103min；

后处理：分液漏斗分出上层红褐色油状物101g，收率2.05％，编号LYLW(2-2)。

实施例20

称取6.5kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。压力稳定后，萃取开始。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5.5MPa、5.5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为330-360L/h。

分离釜II放出300ml黄色膏状泡沫，半个小时后放出少许产品，停止实验，耗时62min；

后处理：分液漏斗分出上层红褐色油状物150.9g，收率2.32％，编号LYLW(2-3)。

实施例21

称取5.85kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。打开电热系统和制冷系统。压力稳定后，萃取开始。萃取釜、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.6r/min，二氧化碳流速为260-280L/h。

从分离釜II放出200ml黄色油状物和水溶液，当放出少量黄色液体，停止实验，耗时98min；

后处理：分液漏斗分出上层红褐色油状物98.5g，收率1.68％，编号LYLW(2-4)。

实施例22

称取6.05kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。当压力稳定时，萃取开始。萃取釜、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20MPa、8MPa、5.2MPa、5.2MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.6r/min，二氧化碳流速为350-370L/h。

从分离釜II放出黄色油状物泡沫和淡黄色液体，停止实验，耗时72min；

后处理：分液漏斗分出上层红褐色油状物151g，收率2.50％，编号LYLW(2-5)。

4.1.2分分离釜I和II取样

实施例23(序号1)

称取1.2kg粉碎好的柳叶蜡梅原料，置于萃取釜中，设定萃取釜的温度为45℃，分离釜I的温度为55℃，分离釜II的温度为35℃。温度达到设定值，通入二氧化碳，打开压缩机，通过控制阀，调节萃取釜、分离釜I、分离釜II和分离釜III的压力分别为16Mpa、9.8Mpa、4.5Mpa；二氧化碳的流速为19L/H。每隔10min分别从分离釜I、分离釜II和分离釜III的出料口收集样品，130min基本没有产品，萃取结束。

从分离釜I收集到棕褐色膏状物13.17g，有浓郁的清凉味，编号LYLW-1(1-1)。从分离釜II和分离釜III分别收集到30.65g和1.92g产品，合并，上层为黑色油状液体，下层为白色乳液，有浓郁的清凉味，编号LYLW-2(1-1)。

实施例24(序号2)

称取1.26kg粉碎好的柳叶蜡梅原料，其余操作和参数同实施例22，但其二氧化碳的流速为30L/H，120min后萃取结束。

从分离釜I收集到12.93g棕黑色膏状物，编号LYLW-1(1-2)；从分离釜II收到41.81g产物，上层为油层，下层为乳浊液，分出油层19.58g，编号LYLW-2(1-2)。

(4.2)超临界加夹带剂

实施例25-28

称取200g粉碎好的柳叶腊梅，放入到萃取釜中。当温度稳定，开启主泵，通入二氧化碳。通过控制阀，调节萃取釜、分离釜I、分离釜II、到设定值。开启副泵，加入50％投料量的夹带剂，每半个小时内加30％g、40％、30％的夹带剂，进行萃取。每隔10-20分钟，从出料口收集混合物，视性状选择过滤或旋转蒸发除去夹带剂，收集到超临界萃取产物，详细参数如下：

(4.2)超临界加夹带剂(95％乙醇)

实施例29(序号3)

称取1.415kg粉碎的柳叶蜡梅叶子，置于5L萃取釜中，其余参数和操作同实施例9。萃取时间为145min；100min内分次加入260ml95％乙醇为夹带剂。

分离I收集到的混合物，在70℃旋转蒸发得到青黑色固体13.55g，编号：LYLJ-1(1-1)。分离II收集到的混合液经过旋转蒸发得到青黑色膏状物11.813g，编号：LYLJ-2(1-1)。

实施例30

称取6.1kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。压力稳定开始循环，并开启副泵(9.1r/min)，泵入3kg95％乙醇，60min内加入夹带剂结束。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.3MPa、8.5MPa、4.8MPa、4.8MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为200-240L/h。

从分离釜I和分离釜II出料口收集产物，基本无产物时停止实验，用时150min。

后处理：抽滤分离I样品，收集到青黑色膏状物23.7g，编号LYLJ-1(2-5)。分离釜II收集的产物，70℃旋转蒸发得180.4g油状物，编号LYLJ-2-Y(2-5)，总收率4.14％。

实施例31

称取6kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。称取3kg95％乙醇，置于副泵的储箱中，开启副泵(R＝8.1r/min)，60min加夹带剂结束。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.5MPa、8.5MPa、4.8MPa、4.8MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.6r/min，二氧化碳流速为230-240L/h。

从分离釜I和分离釜II出料口收集产物，基本无产物时停止实验，用时134min。

后处理：分离釜I得固体17.9g膏状物，编号：LYLJ-1(2-7)。分离釜II收集产品，直接70℃旋转蒸发得到182.6g油状物，编号LYLJ-2(2-7)，总收率3.34％。

(4.3)加夹带剂；

实施例32(序号4)

称取1.296kg粉碎的柳叶蜡梅叶子，置于5L的萃取釜中，其余参数和操作同实施例28，二氧化碳的流速为30-37L/H，萃取时间为105min；75min内分次加入150g95％乙醇。

分离釜I混合液旋转蒸发，得到19.77g，编号LYLJ-1(1-2)；分离釜II收集的混合物抽滤，得棕黄色固体4.783g，编号LYLJ-2-B(1-2)，滤液减压蒸馏得到青黑色油状物10.108g，编号LYLJ-2-Y(1-2)。

实施例33序号9

称取5.8kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。压力稳定开始循环，并开启副泵(r＝15.3r/min，14：20副泵转速调到10.5r/min)，泵入2.9kg95％乙醇作为夹带剂，耗时90min。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.7MPa、8.5MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30r/min，二氧化碳流速为210-260L/h。

从分离釜I和分离釜II出料口收集产物，基本无产物时停止实验，用时180min。

后处理：将收集的液体合并，抽滤，得到膏状滤饼76g，编号LYLJ-B(2-2)，滤液在70℃，-0.095MPa条件下旋转蒸发，到没有液体从冷凝管上滴下，得到青黑色液体176.5g，编号LYLJ-Y(2-2)，总收率4.36％。

实施例34

称取5.65kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。打开电热系统和冷却系统。压力稳定开始循环，并开启副泵(9.1r/min)，泵入2.75kg95％乙醇，90min内加入夹带剂结束。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.5MPa、8.5MPa、4.8MPa、4.8MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝27.6r/min，二氧化碳流速为210-245L/h。

从分离釜I和分离釜II出料口收集产物，基本无产物时停止实验，用时150min。

后处理：抽滤分离釜I样品，收集到青黑色膏状物42.2g，编号LYLJ-1-B(2-4)，滤液70℃旋转蒸发得黑褐色膏状物79.2g，编号LYLJ-1-Y(2-4)。分离釜II样品直接70℃旋转蒸发得黑褐色膏状112.2g，编号LYLJ-2(2-4)，总收率4.13％。

实施例35

开启电热控制系统和制冷系统。称取6.4kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。称取3.2kg95％乙醇，放置于副泵的储箱中，开启副泵(R＝9.1r/min)，60min内加夹带剂结束。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.7MPa、8.5MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为220-240L/h。

从分离釜I和分离釜II出料口收集产物，基本无产物时停止实验，用时135min。

后处理：分离I得到固体1.3g，编号LYLJ-1(2-6)；抽滤分离II收集产品，抽滤得膏状物13g，编号LYLJ-2-B(2-6)；滤液70℃旋转蒸发得187.4g黑色油状物，编号LYLJ-2-Y(2-6)，总收率3.15％。

实施例36

在实施例19的基础上，开启副泵(R＝15.5r/min)，10min加入1.05kg95％乙醇.

从分离釜I和分离釜II收集产品，基本没有产品时，停止实验，耗时62min.

后处理：分离釜I旋转蒸发收集到208.3g膏状物，编号LYLWJ-1(2-1)。分离II样品抽滤，收集到黄色滤饼9.8g，编号LYLWJ-2-B(2-1)，滤液70℃旋转蒸发，得紫黑色油状物31.5g，编号LYLWJ-2-Y(2-1)。

实施例37

在实施例20的基础上，开启副泵(R＝15.5r/min)，10min加入1.05kg95％乙醇。

从分离釜I放出800ml黑色粘稠物，从分II放出600ml淡黄色液体，当基本没有产品，停止实验，耗时80min.

后处理：分离釜I产品旋转蒸发，收集到39.9g膏状物，编号LYLWJ-1(2-2)。分离II的样品抽滤，收集到黄色滤饼1.7g，编号LYLWJ-2-B(2-2)，滤液70℃旋转蒸发，得黑色油状物50g，编号LYLWJ-2-Y(2-2)。

实施例38

在实施例21的基础上，开启副泵(R＝15.5r/min)，15min加入1.55kg95％乙醇。

从分离釜I放出300ml黑色液体，分离釜II放出1100ml黄色液体，停止实验，耗时110min。

后处理：分离釜I收集的产品，抽滤，滤饼86.6g膏状物，编号LYLWJ-1-B(2-3)，滤液减压蒸馏得27g青黑色膏状物，编号LYLWJ-1-Y(2-3)。分离II收集的产品，直接70℃旋转蒸发，得黑色油状物25.1g油状物，编号LYLWJ-2-Y(2-3)，总收率2.29％。

(五)超临界萃取后残渣

实施例39

称取200.09g柳叶腊梅不加夹带剂萃取后的残渣【LYLW(1-1)】，置于2L三口烧瓶中，加入6倍水回流90min，过滤，滤液棕褐色。收集到微黄色挥发油0.859g。第二次提取，在残渣中加入5倍水回流90min后，过滤。合并滤液，浓缩，得棕褐色浸膏51.82g，编号LYLWS，收率25.90％。

实施例40

称取200g柳叶腊梅不加夹带剂萃取后的残渣【LYLW(1-1)】，倒入2L四口烧瓶，加入10倍70％乙醇，回流1h，过滤。在残渣中加入8倍70％乙醇，回流1h，过滤，合并两次滤液，旋转蒸发(75℃、45r/min，-0.085MPa)，100℃水浴锅上蒸发，呈粘稠状停止。真空干燥(75℃，-0.085MPa)，粉碎，收集棕褐色浸膏粉60.4g，编号LYLJC，收率30.2％。

实施例41

称取200.09g柳叶腊梅不加夹带剂萃取后的残渣【LYLW(1-1)】，置于2L三口烧瓶中，加入6倍水回流90min，收集到微黄色挥发油0.859g，编号LYLWY。

实施例42

称取200.66g加夹带剂萃取柳叶腊梅残渣【(LYLJ(1-1)】。置于置于2L三口烧瓶中，加入7倍水回流90min，过滤。收集到微黄色挥发油0.928g。在滤渣中加入5倍水，回流1.5h，过滤，合并滤液。水浴锅上蒸发，蒸发呈粘稠状，放到真空干燥箱中，干燥，收集浸膏40g，编号LYCS，收率20％。

实施例43

称取170g无水乙醇为夹带剂萃取柳叶腊梅残渣【(LYLJ(1-1)】，倒入2L四口烧瓶，加入10倍(1700g)70％乙醇，回流1h，过滤。在残渣中加入8倍(1360g)70％乙醇，回流1h，过滤，合并两次滤液，旋转蒸发(75℃、45r/min，-0.09MPa)，100℃水浴锅上蒸发，呈粘稠状停止。真空干燥(80℃，-0.085MPa)，磨碎，得棕褐色浸膏粉52g，编号LYCLJJC，收率30.6％。

实施例44

称取200.66g加夹带剂萃取柳叶腊梅残渣【LYLJ(1-1)】。置于置于2L三口烧瓶中，加入7倍水回流90min，收集到微黄色挥发油0.928g，编号LYLJY。

药理实验

抗菌

试验例1.1抗耐药菌及敏感菌筛选

1.试验菌株及其培养方法

葡萄球菌：MH培养基(OXOID生产)加2％NaCl，35-37℃孵育24h。

其它菌种：常规MH培养基，35-37℃孵育16-18h观察结果。

表 体外抗菌活性筛选的受试临床分离菌株

备注：表中标注*为耐药菌

2.体外抗菌试验方法

中药样品体外抗菌最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)的测定参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)抗菌药物敏感性试验操作规程【(Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing；Twenty-Third Informational Supplement)M02-A11、M07-A9和M11-A8，2013】推荐的琼脂二倍稀释法。

2.1头孢吡肟对照品称取药品9.5mg，加入4.1ml的生理盐水，混匀，各吸取1ml于两个培养皿中，再加入15ml的培养基，使其终浓度为145ug/ml，再吸取2ml于西林瓶中，再在该西林瓶中加入2ml的生理盐水，混匀，各吸取1ml加入两个平皿中，再加入15ml的培养基，使其终浓度为72.4ug/ml，依照此法倍比稀释，使平皿内所含药物终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008ug/ml。待冷却后用多点接种仪(MIT-P，SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为10⁴CFU/ml，每皿接种27株菌，2个皿接种54株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。

2.2样品分别取药品于烧杯中，加入50ml的培养基，混匀，各吸取15ml于两个培养皿中，使其终浓度为0.167ml/ml，再在烧杯中加入30ml的培养基，再各吸取15ml于两个培养皿中，使其终浓度为0.083ml/ml，依照此法倍比稀释，使药物终浓度依次为0.167、0.083、0.042、0.021、0.010ml/ml。待冷却后用多点接种仪(MIT-P，SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为10⁴CFU/m1，每皿接种27株菌，2个皿接种54株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MIC)。

3.实验结果及统计方法

以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。统计各受试药物对试验菌株的MIC值及其MIC值范围，并与对照样品进行比较。

表1中药MIC测定结果表(琼脂二倍稀释法)

*注：

MRSA：甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌

MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌

MRSE：甲氧西林耐药表皮葡萄球菌

MSSE：甲氧西林敏感表皮葡萄球菌

ECO：非产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌

ECO⁺：产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌

KPN^-：非产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌

AR：多耐药鲍曼不动杆菌

KPN⁺：产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌

KR：多耐药肺炎克雷伯菌

PAE：铜绿假单胞菌

PR：多耐药铜绿假单胞菌

试验例1.2抗肠道致病菌筛选

1.仪器

多点接种仪；培养箱(用于37℃恒温培养)；接种环(环状部分需细丝状)；二级生物安全柜；一次性灭菌培养皿(材质：塑料；数量：160个；规格：直径9mm)；麦氏比浊管(品牌：梅里埃)或麦氏比浊仪；MH培养基；电热炉(用于培养基配制时加热)；小试管(规格：10*100mm，数量：80个)及试管塞；酒精灯：20ul移液枪及枪头；分析天平；注射器(规格：20ml；数量：15个)；试管架2个；烧杯(规格：500ml；数量：6个)；小药芍6个；

2.试剂

MH培养基；0.9％生理盐水200ml；新洁尔灭；

3.菌株表

4.体外抗菌实验方法

中药样品体外抗菌最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)的测定参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)抗菌药物敏感性试验操作规程【(Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing；Twenty-Third Informational Supplement)M02-A11、M07-A9和M11-A8，2013】推荐的琼脂二倍稀释法。

5.样品及对照品配制及接菌

移取样品约4g于烧杯中，加入30ml的培养基，混匀，吸取15ml于培养皿中，使其终浓度为133.333mg/ml，再在烧杯中加入15ml的培养基，再吸取15ml于培养皿中，使其终浓度为66.667mg/ml，依照此法倍比稀释，共15个浓度。待冷却后用多点接种仪(MIT-P，SUKUMA)接种细菌，接种菌量约为10⁶CFU/ml，每皿接种13株菌，盖上皿盖。置于35-37℃培养箱内培养18-20h，观察记录结果。以平皿内未见细菌生长的药物最低浓度，判断为最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。

6.实验结果及统计方法

以平皿内未见细菌生长的样品最低浓度，判断为最低抑菌浓度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)。统计各受试样品对试验菌株的MIC值及其MIC值范围，并与对照样品进行比较。

7.实验测定结果

表2

试验例1.3抗菌体内筛选

1.供试品

3个中药提取物供试品信息见表1

表 供试品信息

2.试验菌株和动物

2.1.受试菌株

根据体外实验结果筛选出甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA 15-2(感染菌量3.0×10⁷CFU/ml)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 15-5(感染菌量3.0×10⁷CFU/ml)作为体内实验的测试菌株。

2.2.试验动物

健康4周龄左右昆明种小鼠，体重为18-22g，雌雄各半，SPF级。

动物使用许可证：SYXK(川)2013-119(四川省实验动物管理委员会颁发)

3.实验方法

3.1.体内保护试验方法

3.1.1.菌液配备

将试验用菌于感染前一天，挑取2-3个单菌落接种于2ml MH肉汤，37℃培养6h，取此菌液0.1ml转种于10ml MH肉汤中，37℃培养18h，该菌液即为原菌液。将该菌液用5％干酵母液进行倍比稀释备用(当日新鲜配制)。

3.1.2.最小致死菌量【Minimum lethal(bacteria amount)Dose，MLD】试验

取健康昆明种小白鼠，体重18～22克，随机分组，每组5只小鼠，雌雄兼用，吸取上述不同稀释浓度菌液，分别腹腔注射入小鼠体内，每20g鼠重注射0.5ml，感染后观察7-14天，并记录小鼠死亡数，以引起小鼠100％死亡的最低菌量作为最小致死菌量【Minimumlethal(bacteria amount)Dose，MLD】，用该菌量作为体内保护试验的感染菌量。

3.1.3.药液配备及给药途径

药液配备：柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY及对照药TQS和莲花请瘟颗粒均用0.5％CMC(羧甲基纤维素)配制成所需浓度的混悬液，备用(灌胃)。

给药途径：灌胃给药

给药容量：0.5ml/20g鼠重

3.1.4.体内保护实验方法

采用预防给药(感染细菌前3天给药，每日1次)，分别于第3日给药后1小时感染受试菌液，4小时后再给药1次，此后每日给药1次(联续给药3天)，至给药组出现死亡，各给药组停止给药，观察各给药组动物的临床症状及死亡时间和死亡动物数。

给药剂量：参考有关该类中药的临床有关资料及体外实验结果，拟设给药剂量为2.0、1.0、0.5g/kg，精确称取受试药物，用药均用0.5％CMC(羧甲基纤维素)配制成所需浓度混悬液，剂量组间矩为1∶0.5。

将小鼠于试验前18小时停食供水，按体重随机分组，每组10只小鼠，雌雄各半，分别腹腔注射感染试验菌液，每20g鼠重注射0.5ml；感染后1h、4h按设计剂量灌胃给药，每20g鼠重给予0.5ml；观察并记录小鼠死亡数，连续观察7-14天，根据小鼠死亡数，用孙瑞元等主编DAS1.0软件按Bliss法计算半数有效剂量ED₅₀及95％可信限。

同时设感染对照组、空白对照组、高剂量药物对照组、溶剂对照组(感染对照组：只感染细菌不给药，感染细菌后即灌胃等体积的生理盐水；空白对照组：不感染细菌，灌胃等体积的生理盐水；高剂量药物对照组：不感染细菌，灌胃等体积的高剂量药物；溶剂对照组：不感染细菌，灌胃等体积的溶剂(0.5％CMC)。

4.试验结果统计

柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY及对照药TQS、莲花请瘟颗粒全身系统感染模型的体内保护实验结果见表3、表4及附表1和附表2。

3个中药提取物及对照药TQS在本次实验条件下对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA15-2和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA15-5所致小鼠全身系统感染呈现有抗菌保护作用；对甲氧西林敏感金葡菌MSSA 15-5的体内保护作用强于耐药金葡菌MRSA 15-2，在2g/kg给药剂量下其死亡率分别依次为40、60、50、30％和60、80、60、40％(见表3、表4)。其半数有效剂量ED₅₀分别依次为1.59、2.26、1.82、1.01g/kg和2.26、＞2.00、2.17、1.60g/kg。3个中药提取物的体内抗菌保护作用与对照TQS相当，较莲花请瘟颗粒(死亡率均为100％)强。各给药组感染受试菌后1-2天临床症状均表现为自主活动明显减少，精神萎靡；死亡动物多发生在感染细菌后1-3天内；未死亡动物7-14天临床症状未见明显逆转。

药物高剂量组：柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY及对照药TQS、莲花请瘟颗粒在2g/kg给药剂量(高剂量药物对照组)下均无动物死亡，临床症状未见异常。表明该给药剂量为无毒剂量。

5.结论

本次试验结果表明：3个柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY经预防给药对小鼠系统感染甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌MRSA 15-2和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌MSSA 15-5具有一定的保护作用。

本次试验所选用的动物模型为小鼠系统感染败血症模型，对于金葡菌所致感染一般在24-48小时即可至动物死亡，因此本次试验中3个柳叶蜡梅提取物LYLW-(2-2)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYY未达到100％的保护率，这可能与中药抗细菌感染的起效比较缓慢有关。

2.1抗幽门螺旋杆菌的筛选

1.材料与方法：

1.1材料

1.1.1实验菌株

ATCC700392：为标准菌株，所用菌株为H.PyloriATCC 700392，购自ATCC(美国菌种保藏中心)；

SS1：为标准菌株，所用菌株为H.pylori悉尼株SS1，由张建中教授惠赠，传代次数在10代以内。

H.pylori多重耐药菌株：发明人对前期收集的贵州医科大学消化科诊断为消化性溃疡或慢性胃炎病人的胃粘膜标本并分离的出具有3种以上抗生素耐药性的H.pylori菌株，进行耐药情况核实后，作为本次实验的临床多重耐药株。

1.1.2实验药物：

(1)待测药物：

表1样品状态

(2)对照药物：阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素。

1.1.3主要仪器

表2主要仪器

1.1.4主要试剂：

表3主要试剂

Table 3 Main Reagent

1.1.5主要试剂的配制

1.1.5.1哥伦比亚血琼脂平板

称取哥伦比亚血琼脂干粉3.9g，加入89mL去离子水，121℃高压灭菌20min，待温度降至50～55℃时，加入无菌脱纤维羊血10mL及混合抗生素1mL后混匀，快速倾倒于4个无菌平板中，每板约25mL。冷却凝固后从中随机取出一个平板置于37℃恒温箱内培养24h做无菌试验，其余保存至4℃冰箱备用。

1.1.5.2脑心浸液肉汤

称取脑心浸液粉3.7g，加入100mL去离子水，121℃高压灭菌20min冷却后4℃保存。

1.1.5.3脑心浸液保存液

称取脑心浸液琼脂干粉3.7g，加入甘油20mL及去离子水80mL，121℃高压灭菌20min后分装于EP管中，每管1mL，冷却后-20℃保存备用。

1.1.5.4混合抗生素

称取万古霉素30mg、多粘菌素B 20mg、两性霉素20mg、TMP 25mg，加入100mL无菌去离子水后混匀，分装于15mL离心管中，每管10mL，4℃保存备用。

1.1.5.5 800mg/mL LYY药物母液

称取LYY原液40g，加入DMSO 50mL，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.6 800mg/mL LYLJ-2-Y药物母液

称取LYLJ-2-Y原液40g，加入DMSO 50mL，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.7 160mg/mL LYC药物母液

称取LYC 32g，加入双蒸水200ml，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.8 160mg/mL LYS药物母液

称取LYS 32g，加入双蒸水200ml，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.9 400μg/mL甲硝唑母液配制

称取甲硝唑粉末20mg，加入无菌去离子水50mL，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.10 400μg/mL克拉霉素母液配制

称取克拉霉素粉末20mg，加无菌去离子水50mL，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.11 400μg/mL阿莫西林母液配制

称取阿莫西林粉末20mg，加无菌去离子水50mL，混匀溶解，4℃保存备用。

1.1.5.12含畲药平板的配制：

根据体外药敏实验要求，称取1.95g哥伦比亚血琼脂粉溶解于43.5mL去离子水中，高压灭菌后，待培养基冷却至50～55℃时加入5mL脱纤维无菌羊血(10％)、0.5mL混合抗生素(1％)，将800mg/mL母液进行倍比稀释，加入对应稀释度的药液1mL，混匀后倒入2个无菌平板中。药平板配制具体方法如下表4：

表4畲药平板配制方法

1.1.5.13含对照药物平板的配制

方法同畲药血平板的配制，将400μg/mL母液进行倍比稀释，加入对应稀释度的药液1mL，混匀后倒入2个无菌平板中。药平板浓度如下表5：

表5对照药物平板配制方法

1.1.5.14含溶媒血平板的配制(溶剂对照)：方法同畲药血平板的配制，并加入相应体积的DMSO替代药物稀释液。

1.2实验方法

1.2.1H.pylori的复苏

从-80℃冰箱中取出H.pylori，室温溶解后倾倒于哥伦比亚血琼脂平板内，涂布均匀；37℃三气恒温培养箱(5％O₂，10％CO₂，85％N₂，相对湿度95％以上)培养48h；观察细菌生长情况并进行革兰氏染色、氧化酶、触酶、尿素酶试验进行鉴定。将革兰氏染色为阴性，生化鉴定试验均为阳性的细菌进行传代培养48h后重复观察细菌生长情况，稳定传代后用于后续实验。

1.2.2菌液的制备：

将血平板上的菌苔刮至含15mL预冷脑心浸液肉汤的玻璃试管中，离心洗涤一次后，重悬于4℃脑心浸液肉汤中。将此菌液作10倍、100倍、1000倍稀释后，在紫外分光光度计上测菌液的OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值位于0.1～1.0之间时该数值与菌液浓度有较好的线性关系，菌液含量的计算公式如下：菌量/mL＝2.2×10⁸×OD₆₀₀值×稀释倍数，将菌液稀释到3×10⁸CFU/mL，在15min内完成菌液配制和接种，接种过程中菌液需保持在4℃。

1.2.3.临床多重耐药株验证试验：

将培养48h的H.Pylori临床多重耐药菌株用脑心浸液肉汤制备菌悬液，调配其浓度在3×10⁸CFU/mL，分别用无菌棉签沾取菌悬液均匀涂布于浓度为甲硝唑256μg/mL，克拉霉素256μg/mL，阿莫西林256μg/mL的药物培养板及空白培养板上，每个药物浓度涂抹两个平板，置于微需氧环境中37℃培养48h。以空白平板上生长良好的H.Pylori多重耐药菌株作参照，观察其生长情况，并对所生长细菌做革兰氏染色和生化鉴定试验。

1.2.4LYY、LYLJ-2-Y、LYC、LYS抗H.Pylori活性检测：

(1)菌液涂布：用无菌棉签蘸取浓度为3×10⁸CFU/mL的菌液，在琼脂表面均匀涂布，同时设置阴性对照(即不加菌)、空白对照(即不加药)、溶剂对照(即仅加溶剂)和药物对照(甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林)。每种样品每个浓度均涂布2块平板。

(2)培养：将平板置于37℃三气培养箱(85％N₂，10％CO₂，5％O₂)中培养48h后观察结果。

(3)药物抑菌效果判定：在阴性对照无菌生长，空白对照和溶剂对照生长良好，药物对照(甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林)结果相符的情况下的条件下，以肉眼下无菌生长的样品最高稀释度为该样品对相应菌株的最低抑菌浓度(MIC)。实验重复三次。

2.实验结果

2.1溶剂对H.Pylori生长的影响

配制含2％石油醚、1.1％及2％DMSO的哥伦比亚血平板，分别均匀涂布H.pylori，培养48h。结果显示：与空白对照相比，含2％石油醚的平板表面凹凸不平，无法直接观察H.pylori的生长状况，影响实验结果的判断，若将其作为溶剂进行后续实验可能无法得到准确的MIC；而含1.1％及2％的DMSO平板上的H.pylori生长情况与空白对照无明显差异。

2.2临床多重耐药株的验证实验：

将从临床收集并分离的H.pylori多重耐药菌株进行复苏，并对耐药情况核实。结果显示，H.pylori多重耐药菌株在甲硝唑药物浓度为256μg/mL，克拉霉素为256μg/mL，阿莫西林为256μg/mL的药平板上均生长状态良好，与空白组无区别。

2.3LYY、LYC、LYS、LYLJ-2-Y及对照西药抗H.pylori活性的药敏结果：

本次实验在阴性对照无菌生长、空白对照和溶剂对照生长良好的情况下，LYY对H.pyloriATCC700392和SS1的MIC均为4mg/mL，对临床多重耐药菌株的MIC为2mg/mL；LYLJ-2-Y对H.pyloriATCC700392的MIC为2mg/mL，对SS1的MIC为8mg/mL，对临床多重耐药菌株的MIC为4mg/mL；LYC对H..pyloriATCC700392、SS1、临床多重耐药菌株的MIC分别为1mg/ml、4mg/ml、16mg/ml；LYS对3株菌的MIC都为8mg/mL，各药物的MIC详见表6。

表6各药物的MIC

综上所述，畲药LYC、LYS、LYY及LYLJ-2-Y具有一定的H.Pylori抗菌活性。

实验例3.1抗结核菌筛选

1材料

1.1药物

1.1.1受试样品

表1.各个药物配制浓度

样品用二甲基亚砜(DMSO)配成母液并稀释成工作溶液备用。贮存温度：4℃。

1.1.2.阳性对照：利福平(简称：RIF)。失效日期，2017.11；批号，R0808；Amresco公司产品；纯度＞95％(HPLC)；红色粉末状；贮存温度：-20℃。

1.1.3.阴性对照：溶剂二甲亚砜(DMSO)。贮存温度：常温。

1.2菌种：本实验室制备的无毒力自主发光标准结核菌Autoluminescent H37Ra(简称AlRa)。

1.3核心仪器：Glomax2020发光检测仪：美国Promega公司；生化培养箱(LRH-70)：上海恒科；台式恒温振荡器(THZ-D)：太仓市实验设备厂；电子天平(JE3002)：上海浦春仪器公司。

2方法与结果

2.1方法：37℃培养AlRa菌液至对数期。用7H9培养基稀释菌液，使发光值在15000-25000RLU/mL之间。取稀释后的菌液195ul与稀释后的药液5ul混合，每药物每个浓度设2-3重复，并设置阳性对照(RIF：终浓度1ug/ml)和阴性对照(DMSO)。阴性空白对照的发光值作为第0天的发光值，之后每天检测样品发光值1次，共检测3天。

第3天平均发光值达到阴性空白对照组发光值一半以下的最低浓度为这个样品的IC50(ug/ml)；第3天抑制90％菌的生长的浓度为该样品的MIC(ug/ml)。

2.2结果：如表2所示：

表2.各个药物的MIC和IC50值

试验例4.1：柳叶腊梅样品对流感病毒H3N2活性检测实验

1)实验病毒株

流感病毒H3N2，由浙江省丽水市疾控中心从临床分离鉴定所得。

2)实验试剂、材料、设备和场地

试剂：DMEM(1X)；FBS；HBSS(1X)；PBS(1X)；0.25％Trypsin-EDTA(1X)；均为GIBCO产品。

L-Glutamine，Liquid；青链霉素混合液(100X)；均为Solarbio产品。

材料：96孔板；10ml一次性移液管；6孔板；均为Costar产品。

50ml离心管；15ml离心管；25cm²细胞培养瓶；均为Corning产品。

血凝滴度板；移液枪及枪头。

设备：CO₂培养箱；倒置显微镜；二级生物安全柜。

场地：细胞培养BSL-2实验室。

3)实验方法

样品配制：称取样品0.0200g于1.5ml EP管中，用1ml DMSO溶解后吸取100ul用900ul维持液稀释后即浓度为2mg/ml，于4℃冷藏备用。

培养病毒：将状态良好细胞洗去胎牛血清，加入病毒液于35℃，5％CO₂培养箱中孵育1-2小时后将病毒液弃去，加入维持液于35℃，5％CO₂培养3-7天，待70％的细胞死亡，将该病毒培养液冻融3次后进行HA试验。待测定TCID50之后将病毒液稀释分装于-80℃冰箱中冻存以备用。HA试验方法：将O型血血清弃去，取200ul的血红细胞于1.5mlEP管中，用1ml的PBS清洗3次，吸取100ul的红细胞用PBS稀释至10ml混匀为1％的血红细胞。将培养好的病毒液倍比稀释为数个浓度1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等，每个浓度的病毒液取50ul分别加入50ul的1％血红细胞混匀，待40分钟后查看结果，若红细胞分散即为有病毒，若红细胞聚集成一点即为无病毒。

样品最大无毒浓度确定：将状态良好的浓度约为10⁵个/ml的细胞均匀铺于96孔板中，培养至第二天长成单层后，将配制好的样品加入细胞并倍比稀释为8个浓度，于37℃、5％CO₂条件下培养48小时后观察细胞的状态。

样品抗病毒实验步骤：CCK-8细胞显色法。

①预防模型：将浓度为10⁵个/ml的细胞液100ul/孔铺于96孔板，待第二天细胞长至单层后用HBSS 50ul/孔将细胞板洗一次，再加入配制好的样品，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h后弃去，再加入病毒液(HA＝1)10ul，再于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h后弃去，再加入100ul维持液培养48h后观察结果。

阻断率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照平均值-病毒对照平均值)]×100％

②治疗模型：将浓度为10⁵个/ml的细胞液100ul/孔铺于96孔板，待第二天细胞长至单层后用HBSS 50ul/孔将细胞板洗一次，再加入HA＝1的H3N2病毒液10ul/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时，孵育之后将病毒液弃去，再加入配制好的药液100ug/孔，培养48小时观察细胞状态。

抑制率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照平均值-病毒对照平均值)]×100％

③杀灭模型：将浓度为10⁵个/ml的细胞液100ul/孔铺于96孔板，待第二天细胞长至单层备用。第二天用HA＝1的病毒液将样品稀释为试验浓度，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时后加入用HBSS清洗后的细胞板，于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后观察结果。

杀灭率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照平均值-病毒对照平均值)]×100％

结果判断方法：通过CCK-8细胞显色法测定显色液的OD值，再结合倒置显微镜观察细胞的状态，综合评价样品的抗H3N2的效果。

4)实验结果

抗H3N2预防、治疗和杀灭三种模型筛选结果

表1.水提物抗H3N2筛选结果表

注：倒置显微镜观察活细胞较多的标记为红色，下同。

如表显示：水提物杀灭、预防、治疗三种模型均有效。

表2.醇提物抗H3N2筛选结果表

如表显示：醇提物杀灭、预防、治疗三种模型均有效。

表3.挥发油抗H3N2筛选结果表

如表显示：水蒸气蒸馏挥发油杀灭、预防、治疗三种模型均有效。

表4.超临界萃取物不加夹带剂分釜收集样品抗H3N2筛选结果

如表显示：超临界不加夹带剂提取物杀灭、预防、治疗三种模型均有效。

表5.超临界萃取物加夹带剂分釜收集样品抗H3N2筛选结果

如表显示：起临界加夹带剂提取物杀灭、预防、治疗三种模型均有效。

表6.超临界萃取物补加夹带剂分釜收集样品抗H3N2筛选结果

如表显示：超临界先不加夹带剂再加夹带剂提取物杀灭、预防、治疗三种模型均有效。

实验例5.1：腊梅样品抗疱疹病毒活性检测实验

1.材料

1.1.实验病毒株

病毒：单纯疱疹病毒HSV-I和HSV-II，为复旦大学药学院抗病毒药物研究室保存，临用时新鲜制备。

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)。

1.2.样品：

为制备实施例1、3、4、10、11、12、13、14、15所得5个样品：LYS(140601)、SYS(161217)、ZYS(161218)、ZYY(161030)、SYY(161030)、LYLW(2-2)、LYLJ-1-Y(2-3)、LYLJ-2-Y(2-6)、LYLJ-1-B(2-4)、LYLWJ-1-B(2-3)。

1.3.主要仪器：CO₂细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋(SANYO)公司；电子天平：Sartorius 1700型，德国W-Germany；超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂；酸度计：ORION STARA211，Thermo公司；酶标仪：BIO-RAD680型，美国伯乐BIO-RAD公司；生物倒置显微镜：XDS-1B型，重庆光学仪器厂；电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司；微量振荡仪：MH-1型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；漩涡混合器：WH-861型，江苏太仓华利达实验设备有限公司。

1.4.试剂：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；0.25％胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；完全培养液(含10％胎牛血清以及双抗的DMEM培养液)；细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养液)；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，本实验室自制。

2.实验方法

2.1.样品配制方法

测试样品溶解于DMSO中，预先配置成40mg/ml浓度，然后用细胞培养液稀释，按照常规测试浓度，以200ug/ml开始倍比稀释。

2.2.样品细胞毒性试验

Vero细胞接种于96孔培养板，培养24小时，形成细胞单层后，加入不同浓度的样品稀释液，继续培养72小时后，显微镜观察细胞形态变化并用MTT法测定细胞活性，确定样品对细胞的毒性浓度。

2.3.体外抗病毒试验

细胞活性大于90％以上的最大药物浓度作为药效测试的最大起始浓度，倍比稀释5个浓度进行药效活性检测。Vero细胞接种于96孔培养板，培养24小时，形成细胞单层后，加入相应病毒液感染细胞，然后换入对细胞最大无毒浓度及以下的5个样品稀释液，再经72小时培养后，显微镜下观察细胞病变(CPE)，确定样品对病毒的抑制作用。

2.4.实验结果判定方法

MTT法测定样品对细胞的毒性，观察细胞病变作用CPE(cytopathic effect)确定样品对病毒的抑制作用。TC50和IC50值按照Reed-Muench法原理进行计算。

3抗单纯疱疹病毒病毒筛选结果

3.1样品对Vero细胞的毒性

3.2)样品体外抗单纯疱疹病毒HSV-I作用

3.3)样品体外抗单纯疱疹病毒HSV-II作用

实验例6.1：腊梅样品抗EV71病毒活性检测实验

1.材料

1.1实验病毒株：EV71病毒毒株从浙江大学第一附属医院传染病防治所获得。

细胞：非洲绿猴肾细胞(简称：Vero)。

1.2待测药物：样品编号LYLJ-2(2-6)

1.3主要仪器：CO₂细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋(SANYO)公司；电子天平：Sartorius 1700型，德国W-Germany；超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂；酸度计：ORION STARA211，Thermo公司；酶标仪：BIO-RAD680型，美国伯乐BIO-RAD公司；生物倒置显微镜：XDS-1B型，重庆光学仪器厂；电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司；微量振荡仪：MH-1型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；漩涡混合器：WH-861型，江苏太仓华利达实验设备有限公司。

1.4试剂：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；0.25％胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；完全培养液(含10％胎牛血清以及双抗的DMEM培养液)；细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养液)；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，本实验室自制。

1.5主要试剂的配制

培养液的配制方法：每500mlRPMI 1640培养液中加入50ml的FBS和5ml 100UI/ml的双链霉素混合液。

其它试剂均可直接使用。

2.实验方法

2.1Vero细胞复苏和培养

复苏Vero细胞，用含10％FBS，100UI/ml双抗的RPMI 1640培养液制成细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于5％CO₂，37℃恒温培养箱内培养。待细胞生长至对数期并且生长状态良好时，收集细胞，离心，4℃，1700rpm，5min，弃去上清液，重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至10⁴个/ml左右，用于96孔板接种。

2.2EV71的100％致死率测定

取EV71病毒原液倍比稀释至1/20、1/40、……、1/20480，共11个浓度。具体步骤为：取病毒原液100μl，加1900μl培养液稀释至1/20浓度；取1/20浓度EV71病毒液1ml，加1ml培养液稀释至1/40浓度；依次等比稀释至1/20480浓度。选择1/20到1/20480共11个浓度，每个浓度1ml。

取96孔板，在实验所用孔中加入含Vero细胞的悬液100μl，约有10³个/孔，置于培养箱内培养24h。然后加入不同浓度EV71病毒，观察EV71病毒对Vero细胞的影响：

1)阴性对照组：50μl培养液；

2)实验组：50μl不同浓度梯度的EV71病毒。

96孔板内细胞经不同浓度病毒处理后，置于培养箱，观察Vero细胞生长情况。

2.3试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定

取LYLJ-2-Y(2-6)45μl，加855μl培养基后，溶于500μl无水乙醇混匀作为原液备用。

取LYLJ-2-Y(2-6)原液90μl，加810μl培养基稀释至1/10浓度，再取其450μl，加等体积培养基稀释至1/20浓度，依次等比稀释至1/640浓度，选择1/40到1/640共5个浓度，每个浓度450μl。

取96孔板，在实验所用孔中加入Vero细胞悬液100μl，约10³个细胞/孔，置于培养箱内培养24h。然后加入不同浓度LYLJ-2-Y(2-6)，观察其对Vero细胞生长的影响：

1)阴性对照组：50μl含2％乙醇的培养基；

2)实验组：50μl不同浓度梯度的LYLJ-2-Y(2-6)。

96孔内细胞经不同干预处理后，置于培养箱，观察Vero细胞生长情况。

2.4LYLJ-2-Y(2-6)对EV71病毒的作用情况

取96孔板，在实验所用孔中加入Vero细胞悬液100μl，约10³个细胞/孔，置于培养箱内培养24h。分别加入不同浓度化合物，再加入1/40、1/80、1/160浓度病毒，观察其对Vero细胞生长的影响：

1)阴性对照组：100μl含2％乙醇的培养基；

2)实验组：50μl不同浓度化合物，50μl不同浓度梯度的病毒。

96孔板内细胞经不同干预处理后，置于培养箱，观察Vero细胞生长情况。

注：目前EV71病毒无特效药物，故无阳性对照组。

3试验结果

3.1EV71的100％致死率测定结果

A1孔接种1/20浓度的EV71病毒，24h后Vero细胞全部死亡。

A2孔接种1/40浓度的EV71病毒，48h后Vero细胞仅有少数存活。

A3孔接种1/80浓度的EV71病毒，24h后Vero细胞少量死亡，48h后部分存活。

A4孔接种1/160浓度的EV71病毒，24h后个别Vero细胞死亡，48h大部分细胞均存活，且细胞形态未发生明显改变。

3.2试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定

A1孔加入1/20浓度的化合物1，24h后Vero细胞全部死亡。说明LYLJ-2-Y(2-6)在该浓度药物细胞毒性强。

A2孔加入1/40浓度的LYLJ-2-Y(2-6)，24h后部分Vero细胞膜表面有白色斑点；48h后Vero细胞部分存活；说明1/40浓度的的LYLJ-2-Y(2-6)有较强细胞毒性。

A3孔加入1/80浓度的LYLJ-2-Y(2-6)，24h后少数Vero细胞膜表面出现白色斑点，48h后部分Vero细胞膜表面白色斑点增加，该浓度LYLJ-2-Y(2-6)仍有少量细胞毒性。

A4孔加入1/160浓度的LYLJ-2-Y(2-6)，24h和48h观察，Vero细胞均正常生长，细胞形态无异常，说明在该浓度LYLJ-2-Y(2-6)无细胞毒性。

3.3试验药物抗EV71病毒筛选结果

当LYLJ-2-Y(2-6)浓度为1/40时，Vero细胞分别感染1/40、1/80和1/160浓度的EV71病毒，24h后观察，不能判断LYLJ-2-Y(2-6)的抗EV71病毒活性，且由于LYLJ-2-Y(2-6)细胞毒性的作用，大部分Vero细胞死亡；48h后观察，Vero细胞全部死亡。

当LYLJ-2-Y(2-6)浓度为1/80时，Vero细胞分别感染1/40、1/80和1/160浓度的EV71病毒，24h后观察，LYLJ-2-Y(2-6)的抗EV71病毒作用有所显现，但是由于此浓度LYLJ-2-Y(2-6)细胞毒性的依旧存在，约半数Vero细胞死亡；48h后观察，仅有个别Vero细胞存活。

当LYLJ-2-Y(2-6)浓度为1/160时，Vero细胞分别感染1/40、1/80和1/160浓度的EV71病毒，24h后观察，LYLJ-2-Y(2-6)的抗EV71病毒作用明显，且此浓度LYLJ-2-Y(2-6)的细胞毒性较小，Vero细胞生长状况良好。

结论：1/160浓度的LYLJ-2-Y(2-6)，既能抗不同浓度的EV71病毒，还具有最小的细胞毒性。

实施例7.1：腊梅样品抗猪伪狂犬病毒活性检测实验

1.材料

1.1实验病毒株：猪伪狂犬病病毒(PRV，Bartha K61株)：硕腾公司美国查理斯堡公司。

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)，浙江大学动物科学学院天然药物实验室传代保存。

1.2样品：实施例1、3、4、5、8、10、11、12所得产物。

1.3主要仪器：CO₂细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋(SANYO)公司；电子天平：Sartorius 1700型，德国W-Germany；超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂；酸度计：ORION STAR A211，Thermo公司；酶标仪：BIO-RAD680型，美国伯乐BIO-RAD公司；生物倒置显微镜：XDS-1B型，重庆光学仪器厂；电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司；微量振荡仪：MH-1型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；漩涡混合器：WH-861型，江苏太仓华利达实验设备有限公司。

1.4试剂：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；0.25％胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；完全培养液(含10％胎牛血清以及双抗的DMEM培养液)；细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养液)；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，本实验室自制。

1.5主要试剂的配制

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液：称取MTT粉末，加入PBS，溶解，制成2mg/ml的MTT溶液。

2.实验方法

2.1Vero细胞复苏和培养

从液氮灌中取出冻存的Vero细胞，于37℃水浴快速融化，用75％乙醇擦拭冻存管口，将冻存管中液体转移至预先加有预冷PBS的离心管中，1200r/min离心5min，弃上清。细胞沉淀以含10％胎牛血清的DMEM完全培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，倒置显微镜观察细胞生长情况。

2.2PRV的TCID₅₀测定

Vero细胞以0.75×10⁵/ml浓度接种96孔细胞培养板，贴壁培养24h。将PRV液按10倍作倍比稀释，加入到铺满Vero细胞的96孔培养板中，每个稀释度重复8孔，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育，期间每隔30分钟摇晃一次。2h后弃去上清，加入维持液继续培养。分别于接毒后12、24、48、72h置倒置显微镜下观察。比较不同稀释度的细胞病变情况(CPE)，有细胞病变的判为阳性，无细胞病变的为阴性，采用Reed-Muench法计算PRV在Vero细胞中的TCID₅₀。

2.3试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定

Vero细胞以0.75×10⁵/ml的浓度接种96孔细胞培养板，贴壁培养24h。LYY初始浓度(400μg/ml)采用DMEM培养液作2倍倍比稀释至25μg/ml，LYLJ初始浓度(40μg/ml)向下2倍倍比稀释至0.625μg/ml，依次加到长成单层Vero细胞的96孔细胞板上，100μL/well，每个稀释度重复8孔，另设细胞对照孔，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养。孵育2h后，弃培养上清，加入维持液继续培养，每天观察细胞状态，以48h时，8孔均未出现细胞病变的浓度作为最大安全浓度。同时，另一批细胞于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1NHCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD₄₉₂)。

2.4对PRV吸附细胞的阻断作用

以最大安全浓度作为初始浓度，用DMEM培养液作2倍倍比稀释后，分别加入到长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板上，每个浓度8个复孔，100μL/well，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养。孵育2h后弃去上清，每孔加入100TCID₅₀的PRV病毒液100μL，于37℃、5％CO₂细胞培养箱继续孵育2h，每隔30分钟摇晃一次。另设细胞对照和病毒对照。2h后弃去病毒液后，每孔加入100μL维持液，继续培养，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况。于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解后采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD₄₉₂)，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算阻断率。

阻断率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值-病毒对照平均值)]×100％。

2.5对PRV增殖的抑制作用

在长满单层的Vero细胞孔中按100μL/well加入100TCID₅₀的PRV病毒液，于37℃、5％CO₂细胞培养箱吸附2h，每隔30分钟摇晃一次。弃去病毒液，按100μL/well加入不同稀释度的药物稀释液，每个稀释度重复8孔，于37℃、5％CO₂细胞培养箱孵育。。2h后弃去药液，每孔加入100μL维持液，继续培养，同时设细胞对照和病毒对照，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况。同时，于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算抑制率。

抑制率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值-病毒对照平均值)]×100％。

2.6对PRV的杀灭作用

将不同稀释度的药物稀释液分别与等体积的200TCID₅₀病毒液混合，于37℃、5％CO₂细胞培养箱孵育2h，每隔30分钟摇晃一次。然后将混合液按100μL/well加入长成单层的Vero细胞中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，间隔30分钟摇晃一次。2h后弃去上清，每孔加入100μL维持液，继续培养，同时设细胞对照和病毒对照。每天于倒置显微镜下观察细胞病变。于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD₄₉₂)，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算杀灭率。

杀灭率(％)＝[(给药组平均值-病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值-病毒对照平均值)]×100％。

3试验结果

3.1试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定

表1 8种中药提取物对Vero细胞无毒性的最大浓度

3.2样品对PRV的阻断作用

表2.LYC和LYS对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^eP＜0.01和^fP＜0.001^fP＜0.001。

表3.ZYS和ZYY对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^fP＜0.001。

表4.SYS和SYY对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^eP＜0.01和^fP＜0.001。

表5.LYY(2015)和LYLJ-2-Y(2-6)对PRV吸附细胞阻断作用的MTT法检测结果

注：与病毒对照组比较，^cP＜0.001；与细胞对照组比较，^eP＜0.01，^fP＜0.001。

3.3样品对PRV的增殖抑制作用

表6.LYC和LYS对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^eP＜0.01和^fP＜0.001。

表7.ZYS和ZYY对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^fP＜0.001。

表8.SYS和SYY对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^eP＜0.01和^fP＜0.001。

表9.LYY(2015)和LYLJ-2-Y(2-6)对PRV增殖抑制作用的MTT法检测结果

注：与病毒对照组比较，^cP＜0.001；与细胞对照组比较^eP＜0.01，^fP＜0.001。

此处补表

3.4样品对PRV直接杀灭作用

表10.LYC和LYS对PRV杀灭作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^bP＜0.01和^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^fP＜0.001。

表11.ZYS和ZYY对PRV杀灭作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^fP＜0.001。

表12.SYS和SYY对PRV杀灭作用MTT法检测结果

注：与正常细胞对照组比较，^cP＜0.001；与病毒对照组比较，^fP＜0.001。

表13.LYY(2015)和LYLJ-2-Y(2-6)对PRV杀灭作用MTT法检测结果

注：与病毒对照组比较，^bP＜0.01，^cP＜0.001；与细胞对照组比较，^fP＜0.001。

实验例8.1抗炎

1.受试动物

实验动物为KM雄性小鼠，18-22g，SPF级。

2.对照品

阳性对照药，抗炎为地塞米松片剂。

3.样品：实施例1和5所得棘茎楤木提取物浸膏。

4.方法

每组动物连续给药5-6天，所有小鼠在末次给药后右耳涂上致炎剂，致炎剂为巴豆油。4小时后，处死动物，剪下左右两耳，用打孔器于同一部位冲下两耳片。计算肿胀度和肿胀抑制率，与空白对照组统计比较。

5.实验结果

结论：小鼠耳肿胀作为抗炎普筛，筛选出柳叶蜡梅挥发油(LYY)具有一定抗炎苗头。当给药剂量为10g/kg时，其肿胀抑制率为26.4％。

实验例9.1小鼠扭体镇痛试验

1.剂量设置与分组

试验分为空白对照组、阳性对照组和LYY和LYS供试品组，9只/组，剂量设定为10g～40g生药/kg之间。给药量为0.2ml/10g，具体剂量设置如下：

4.2.2试验方法

每组动物连续给药6天，末次给药后1小时小鼠腹腔注射0.6％冰醋酸溶液0.2ml/只，立即观察记录20分钟内每只动物的扭体次数，计算各组动物平均扭体次数，给药组分别与对照组进行比较。

4.2.3试验结果

5.试论

镇痛试验结果显示，与空白对照组比较，罗通定组动物的扭体数明显降低(P＜0.01)，镇痛率高。柳叶蜡梅显示出一定的镇痛作用，作用比较稳定的样品为LYY。

Claims (42)

1.一种腊梅属植物提取物的制备方法，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤：

原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述的溶剂选自水、无水乙醇、乙醇水溶液。

3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的溶剂选自60％-80％的乙醇水溶液。

4.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其特征在于，所述的溶剂用量是原药材用量的2-30倍。

5.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤的温度是室温到溶剂回流的温度。

6.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取次数是1～5次。

7.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取时间是每次0.5～5小时。

8.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其特征在于，所述滤液浓缩的温度是55～90℃。

9.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其特征在于，所述滤液浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5。

10.一种腊梅属植物提取物的制备方法，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤：

原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。

11.一种腊梅属植物提取物的制备方法，其特征在于，所述提取物是原药材腊梅属植物经超临界二氧化碳提取并获得，提取的条件选自如下任意一种或多种：

(1)不加夹带剂的提取物；

(2)加夹带剂的提取物；

(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。

12.根据权利要求11的制备方法，其特征在于，所述提取物进行超临界二氧化碳提取时的条件选自如下(1)-(6)中的任意一项或多项：

(1)萃取温度为30-70℃；

(2)萃取压力为10-40Mpa；

(3)分离温度为25-70℃；

(4)分离压力为2-17Mpa。

13.根据权利要求12的制备方法，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

(1)萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升；

(2)萃取时间为：30-400分钟。

14.根据权利要求12-13中任一项的制备方法，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括使用夹带剂。

15.根据权利要求14的制备方法，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮中至少一种。

16.根据权利要求15的制备方法，其特征在于，所述的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。

17.根据权利要求14-16中任一项的制备方法，其特征在于，所述夹带剂的量以每公斤药材计为0.10-2.5L/Kg。

18.根据权利要求12-13中任一项的制备方法，其特征在于，

分离釜I压力和温度：

分离釜I的温度为30-70℃，分离釜I的压力为4-17Mpa；

分离釜II压力和温度：

分离釜II的温度为25-50℃，分离釜II的压力为2-8Mpa。

19.根据权利要求12-13中任一项的制备方法，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

1)是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，

2)萃取釜温度为45℃-60℃，压力为15Mpa-40Mpa，

3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，

4)分离釜I的温度为35℃-45℃，压力为7.5Mpa-9Mpa；

5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，

6)分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。

20.根据权利要求12-13中任一项的制备方法，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

1)对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜；

2)萃取釜温度为45℃-60℃，压力为15Mpa-40Mpa,加入夹带剂；

3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，

4)分离釜I的温度为35℃-45℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，

5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；

6)分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。

21.根据权利要求12-13中任一项的制备方法，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

1)是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，

2)原药材加入萃取釜，萃取釜温度为45℃-60℃，压力为15Mpa-40Mpa，

3)分离釜I的温度为35℃-45℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，

4)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；

5)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250L/H·Kg，萃取时间为90-300分钟；

6)放出分离釜中的提取物；

7)再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为100-250L/H·Kg，再萃取90-300分钟；

8)分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。

22.根据权利要求20-21中任一项的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮。

23.一种腊梅属植物提取物的制备方法，其特征在于，权利要求11-21中任一项的原药材经二氧化碳超临界提取后，将提取过的药材再加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。

24.根据权利要求23的制备方法，其特征在于，所述的溶剂选自水、无水乙醇、乙醇水溶液。

25.根据权利要求24的制备方法，其特征在于，所述的溶剂选自60％-80％的乙醇水溶液。

26.根据权利要求23-25中任一项的制备方法，其特征在于，所述的溶剂用量是原药材用量的2-30倍。

27.根据权利要求23-25中任一项的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤的温度是室温到溶剂回流的温度。

28.根据权利要求23-25中任一项的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取次数是1～5次。

29.根据权利要求23-25中任一项的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取时间是每次0.5～5小时。

30.根据权利要求23-25中任一项的制备方法，其特征在于，所述滤液浓缩的温度是55～90℃。

31.根据权利要求23-25中任一项的制备方法，其特征在于，所述滤液浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5。

32.根据权利要求1-30中任一项的制备方法，其特征在于，所述的腊梅属植物选自柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。

33.根据权利要求1-31中任一项的制备方法，其特征在于，所述的腊梅属植物药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合。

34.权利要求1-33中任一项制备方法获得的腊梅属植提取物。

35.一种药物组合物，其特征在于，包括有效剂量的权利要求34的腊梅属植提取物和药效学上可接受的载体。

36.权利要求1至35任一项所述的腊梅属提取物或组合物在制备抗炎药物中的应用。

37.权利要求1至35任一项所述的腊梅属提取物或组合物在制备镇痛药物中的应用。

38.权利要求1至35任一项所述的腊梅属提取物或组合物在制备防治动物微生物感染疾病的药物中的应用。

39.根据权利要求38的应用，其特征在于，所述的动物选自家畜、家禽、伴侣动物、野生动物、鸟类。

40.权利要求1至35任一项所述的腊梅属提取物或组合物在制备畜牧饲料添加剂的应用。

41.权利要求1至35任一项所述的腊梅属提取物或组合物在制备消杀剂中的应用。

42.腊梅属植物作为畜牧饲料的应用。