CN105557312A - 一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法。所述方法将筛选得到的蛹虫草[Cordyceps？militaris(L.)Link.]菌株接种于处理后的黄粉虫幼虫上，经过培养得到橙色虫草产品。所述虫草产品中有效成分虫草多糖、虫草素、蛋白质、虫草酸含量丰富。本发明所述方法操作简单，培养期短，适合于工业规模化生产。

Description

一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法

技术领域

本发明涉及一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法。

背景技术

冬虫夏草[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc]是我国一种名贵的中草药，因其具有抗肿瘤、提高免疫力、降血脂、调节内分泌等多种功效，已被现代人们广泛认可和追捧。但由于冬虫夏草的生长条件特殊，只能生长在西藏、青海、四川等高海拔地区，且生长周期较长，产量逐年下降，因此野生冬虫夏草十分稀有珍贵，目前市场价格已达到4万元/千克左右。

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]又称北冬虫夏草，子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属，为蛹虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫蛹体上形成的子座与蛹体的结合，是虫草属的模式种。因其主要活性成分与冬虫夏草相近或高于冬虫夏草，并且已有较成熟的培养条件，现已成为冬虫夏草的有效替代品。

黄粉虫[Tenebriomolitor(L.)]俗称面包虫，鞘翅目拟步行虫科，富含丰富的蛋白质、脂肪、微量元素和维生素等营养物质，具有抗疲劳、调节血脂、抗组织缺氧等功效。并且黄粉虫能够进行大规模人工饲养，为相关研究提供稳定的原料来源。

近年来，将虫草菌接种于黄粉虫以培养出冬虫夏草替代品成为研究的热点。北华大学潘丽梅等人将黄粉虫幼虫通过注射接种虫草菌，60天左右培育出黄粉虫虫草，感染率为30％。安徽农业大学李春如教授等人将黄粉虫幼虫穿刺接种台湾虫草菌，获得了30％的感染率。以上两种方法均为黄粉虫幼虫活体接种，感染率均不高，无法到达规模化生产的要求。

CN1793317A中公开了一种以黄粉虫蛹为寄主的蛹虫草实体及其培育方法。所述方法步骤为菌种制备、对黄粉虫蛹接种感染和出草。CN103688760A中公开了一种将筛选后的野生冬虫夏草菌株制成菌悬液并接种到黄粉虫上培育虫草子实体的方法。上述两项发明均以黄粉虫为寄主，培养最终得到蛹虫草子实体，与大米培养基培养子实体或蚕蛹为寄主培养子实体并无太大差别，且都为黄粉虫蛹或黄粉虫幼虫活体接种，操作繁琐，接种难度大；培养周期均在50～60天，培养周期较长，无法达到规模化生产的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，以及由该方法得到的虫草活性成分含量较高的虫草产品。

本发明所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)蛹虫草母种菌株的筛选

将蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株接种于固体培养基上，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得长势较快、性状稳定的蛹虫草母种菌株。

(2)菌悬液的制备

将筛选得到的蛹虫草母种菌株接种于灭菌处理后的液体培养基中，常温培养7天后，在超净工作台内用双层无菌纱布过滤，即得到菌悬液。

(3)黄粉虫幼虫的准备

将成熟的黄粉虫幼虫置于玻璃瓶中，68～105kPa，115～122℃条件下灭菌15～25min，放凉待用。

(4)接种

在超净工作台内，将灭菌后的成熟黄粉虫幼虫均匀放置在无菌的培养皿中，均匀喷洒菌悬液至虫体表面，培养皿用无菌封口膜封口。

(5)虫草产品的培养

将培养皿置于20～22℃黑暗条件下培养7～8天后可得到被蛹虫草菌侵染的黄粉虫幼虫，然后将其置于20～22℃，自然光照条件下培养，3～4天后虫体转为橙色，即得到本发明所述虫草产品。

本发明所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，与现有技术中在黄粉虫活体上接种冬虫夏草菌得到的虫草子实体不同，本方法得到被蛹虫草菌感染的颜色鲜亮、营养价值丰富的虫体，可作为蛹虫草、冬虫夏草的替代品。

进一步地，本发明所述步骤(1)中采用的蛹虫草菌株选取产于吉林长白山国家自然保护区的野生新鲜蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株。

进一步地，本发明所述步骤(2)中，得到的菌悬液其孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL(用血球计数板计数)。

进一步地，本发明所述步骤(3)中，在100～105kPa，120～122℃条件下灭菌15～20min。

进一步地，本发明所述步骤(5)中，培养的温度为22℃。

更进一步地，本发明所述步骤(3)中，在100kPa，121℃条件下灭菌15min。

本发明还提供了一种以黄粉虫幼虫为载体培养得到的虫草产品，其特征在于采用本发明上述培养方法培养得到。

本发明所述虫草产品，其特征还在于其有效成分虫草酸含量达10％以上，虫草多糖含量达15％以上，虫草素含量达12％以上，蛋白质含量达31％以上。

现有技术中采用的黄粉虫活体接种冬虫夏草菌存在诸多问题，例如因黄粉虫为活体，会将一部分注射(或穿刺)的菌悬液排出体外，活的黄粉虫体对蛹虫草菌也有一定的抗性，在注射(或穿刺)量不够或未成功注射(或穿刺)进虫体内时无法成功感染黄粉虫。另外，活体接种难度较大，操作繁琐且耗时，注射过程中若操作不当将导致黄粉虫死亡，并且由于这些方法只对虫体进行表面灭菌，所以一旦在接种过程中导致黄粉虫死亡，虫体就会腐烂发臭，不能继续使用，因此不能达到较高的感染率。本发明所述方法是将黄粉虫幼虫在68～105kPa，115～122℃条件下灭菌15～25min，这样处理后有以下优点：1.在处死黄粉虫幼虫的同时有效灭菌；2.最大程度的保持了黄粉虫的可利用养分；3.在灭菌后僵死的蛹体上喷施蛹虫草菌悬液，避免了现有技术中活体接种存在的问题，依本发明所述方法，并经多次反复验证，黄粉虫接种蛹虫草菌成功率均可达到100％，接种后10～12天即可达到收获条件，大大缩短了培养时间，且操作简单易行，提高了生产效率，能够达到工厂规模化生产的需求。

本发明所述方法得到的橙黄色虫草产品中有效成分虫草多糖、虫草素、蛋白质、虫草酸含量丰富，可以作为虫草子实体的替代品或作为大量提取虫草活性成分的原料。

附图说明

图1为虫草酸测定标准曲线。

图2为虫草素测定标准曲线。

图3为虫草多糖测定标准曲线。

图4为虫草蛋白质测定标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

本发明中的黄粉虫幼虫为本实验室培养。

实施例1

1、菌种筛选

选取高产、优质、早熟、产于吉林长白山国家自然保护区的野生新鲜蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株，去除表面杂物后置于超净工作台内，分别用75％乙醇表面消毒1分钟、0.1％升汞表面消毒30秒，无菌去离子水清洗5～6次，用无菌组织刀切成1mm²组织块放在斜面培养基上培养。待菌丝布满斜面后再纯化，经反复纯化后获得蛹虫草母种数株。

将母种扩大培养后，无菌接种于以大米为主要营养物质的有机培养基上，于20℃～22℃下培养30天左右，观察生长情况，若有杂菌污染，则需对母种进一步纯化；若无杂菌污染，则继续培养30～40天后即长出橙色子实体，证明母种可靠。经培养，得到橙色蛹虫草子实体，证明已筛选得到优质的蛹虫草菌株用于本发明的开展。

2、菌悬液的制备

将液体培养基分装于250ml三角瓶中，121℃灭菌20分钟，放入超净工作台冷却至室温备用。在无菌条件下，将母种用接种环接种到三角瓶中，置于摇床中，120r/min，22℃培养7天，待形成均匀菌球后用双层无菌纱布过滤，即得到菌悬液，用血球计数板计数菌悬液孢子浓度为10⁶个/mL。

3、黄粉虫幼虫的准备

将成熟的黄粉虫幼虫置于玻璃瓶中，100kPa，121℃灭菌15min，置于超净工作台内放凉待用。

4、接种

在超净工作台内，将灭菌后的成熟黄粉虫幼虫均匀放置在无菌的培养皿中，均匀喷洒菌悬液至虫体表面，培养皿用无菌封口膜封口。

5、虫草产品的培养

将培养皿置于培养箱内，22℃黑暗条件下培养7天，得到被蛹虫草菌侵染的黄粉虫幼虫，接种成功率达100％，然后将其置于22℃自然光照条件下培养3天，使虫体转色为橙色，即为以黄粉虫幼虫为载体培养得到的虫草产品。

实施例2

1、菌种筛选

选取高产、优质、早熟、产于吉林长白山国家自然保护区的野生新鲜蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株，去除表面杂物后置于超净工作台内，分别用75％乙醇表面消毒1分钟、0.1％升汞表面消毒30秒，无菌去离子水清洗5～6次，用无菌组织刀切成1mm²组织块放在斜面培养基上培养。待菌丝布满斜面后再纯化，经反复纯化后获得蛹虫草母种数株。

将母种扩大培养后，无菌接种于以大米为主要营养物质的有机培养基上，于20℃～22℃下培养30天左右，观察生长情况，若有杂菌污染，则需对母种进一步纯化；若无杂菌污染，则继续培养30～40天后即长出橙色子实体，证明母种可靠。经培养，得到橙色蛹虫草子实体，证明已筛选得到优质的蛹虫草菌株用于本发明的开展。

2、菌悬液的制备

将液体培养基分装于250ml三角瓶中，115℃灭菌30分钟，放入超净工作台冷却至室温备用。在无菌条件下，将母种用接种环接种到三角瓶中，置于摇床中，120r/min，22℃培养7天，待形成均匀菌球后用双层无菌纱布过滤，即得到菌悬液，用血球计数板计数菌悬液孢子浓度为10⁷个/mL。

3、黄粉虫幼虫的准备

将成熟的黄粉虫幼虫置于玻璃瓶中，68kPa，115℃灭菌25min，于超净工作台内放凉待用。

4、接种

在超净工作台内，将灭菌后的成熟黄粉虫幼虫均匀放置在无菌的培养皿中，均匀喷洒菌悬液至虫体表面，培养皿用无菌封口膜封口。

5、虫草产品的培养

将培养皿置于培养箱内，20℃黑暗条件下培养8天，得到被蛹虫草菌侵染的黄粉虫幼虫，接种成功率达100％，然后将其置于20℃自然光照条件下培养4天，使虫体转色为橙色，即为以黄粉虫幼虫为载体培养得到的虫草产品。

实施例3

虫草产品的收集与活性成分的检测

转色完成后，将培养皿打开，60℃烘箱烘干至恒重，折干率为4.5～5:1，然后用中药粉碎机粉碎，过80目筛，分别检测其中活性成分虫草酸、虫草素、虫草多糖和蛋白质含量。

1、虫草酸的测定采用高点酸钾比色法测定虫草酸。虫草酸的化学成分为D-甘露醇，用甘露醇配制系列标准溶液，与420nm处测定吸光度，得到甘露醇(C_甘露醇)含量与吸光度(D)的回归方程：D＝0.009C_甘露醇-0.005，R²＝0.996。

2、虫草素的测定采用HPLC法测定虫草素，上清液经0.2um微孔滤膜压滤，色谱条件为：C18(4.6×150mm，5um)，流动相为甲醇：水＝15:85，流速为1mL/min，柱温为30℃，进相量为20ul，检测波长为260nm。虫草素标准曲线回归方程为y＝16839x+16475，R²＝0.998，其中y为色谱峰面积，x为虫草素质量浓度。

3、虫草多糖的测定采用苯酚-硫酸法测定虫草多糖。多糖在酸性条件下水解成葡萄糖等单糖，用葡萄糖配制系列标准溶液，于490nm处测定吸光度，得到葡萄糖含量(C_葡萄糖)与吸光度(D)的回归方程：D＝0.009C_葡萄糖+0.014，R²＝0.995。

4、虫草蛋白质的测定采用考马斯亮蓝法测定虫草蛋白质含量。用牛血清蛋白配制系列标准溶液，于595nm处测定吸光度，得到牛血清蛋白含量(C_{牛血清蛋白})与吸光度(D)的回归方程：D＝0.076C_{牛血清蛋白}-0.014，R²＝0.993。

将本发明培养获得的虫草虫与以下几种产品进行有效成分含量比较，并用SPSS19.0软件对检测结果进行多组均数之间的显著性检验。其中，养殖蛹虫草为利用实施例1步骤1中所分离的蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌种接种在大米培养基上培养所得；黄粉虫幼虫为实施例1步骤3中得到的灭菌后的黄粉虫幼虫；野生蛹虫草为吉林长白山国家自然保护区的野生新鲜蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株；检测结果均为三次实验取平均值所得。冬虫夏草(报道中)与蛹虫草(报道中)为张显科等发表的文献(辽宁大学学报，《蛹虫草的研究Ⅳ.蛹虫草与冬虫夏草化学成分比较》，张显科、王玉柱、刘文霞等，1996，23(4)80-83)中报道含量。分析结果见表1。

由表1可见，以本发明所述方法培养得到的虫草产品，其主要有效活性成分虫草酸、虫草多糖、虫草素、蛋白质均高于养殖蛹虫草、长白山野生蛹虫草以及黄粉虫幼虫，其中虫草酸含量与长白山野生蛹虫草相比无在P＝0.05水平上不具有显著性差异，其余几项均在P＝0.05水平上具有显著性差异；与张显科等发表的文章《蛹虫草的研究Ⅳ.蛹虫草与冬虫夏草化学成分比较》中报道含量进行比较发现，本发明所述虫草产品的主要活性成分虫草酸、虫草多糖、蛋白质均高于报道中所述冬虫夏草与蛹虫草这几项成分的含量，在P＝0.05水平上具有显著性差异；本发明所述虫草产品的主要活性成分虫草素高于报道中所述冬虫夏草此成分的含量，在P＝0.05水平上具有显著性差异；本发明所述虫草产品的主要活性成分虫草素低于报道中所述蛹虫草此成分的含量，在P＝0.05水平上具有显著性差异。综合比较，以本发明所述方法培养得到的虫草产品，在有效成分含量方面与养殖蛹虫草、长白山野生蛹虫草及文献中报道的冬虫夏草和蛹虫草相比具有明显优势。

表1.本发明所述虫草产品与其它虫草产品有效成分含量对比表

	虫草酸(％)	虫草多糖(％)	虫草素(mg/g)	蛋白质(％)
					本发明所述虫草产品	10.303	15.287	12.563	31.111
养殖蛹虫草	8.445*	11.090*	5.284*	29.605*
					黄粉虫幼虫	2.357*	0.144*	0.030*	20.699*
长白山野生蛹虫草	9.429	9.370*	5.192*	28.272*
					冬虫夏草(报道中)	6.8*	12*	4.8*	26.21*
蛹虫草(报道中)	8*	13*	20*	25.73*

注：*代表与本发明所述虫草产品相比在P＝0.05水平上差异显著。

Claims (8)

1.一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)蛹虫草母种菌株的筛选

将蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株接种于固体培养基上，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得长势较快、性状稳定的蛹虫草母种菌株；

(2)菌悬液的制备

将筛选得到的蛹虫草母种菌株接种于灭菌处理后的液体培养基中，常温培养7天后，在超净工作台内用双层无菌纱布过滤，即得到菌悬液；

(3)黄粉虫幼虫的准备

将成熟的黄粉虫幼虫置于玻璃瓶中，68～105kPa，115～122℃条件下灭菌15～25min，放凉待用；

(4)接种

在超净工作台内，将灭菌后的成熟黄粉虫幼虫均匀放置在无菌的培养皿中，均匀喷洒菌悬液至虫体表面，培养皿用无菌封口膜封口；

(5)虫草产品的培养

将培养皿置于20～22℃黑暗条件下培养7～8天后可得到被蛹虫草菌侵染的黄粉虫幼虫，然后将其置于20～22℃，自然光照条件下培养，3～4天后虫体转为橙色，即得到本发明所述虫草产品。

2.如权利要求1所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用的蛹虫草菌株选取产于吉林长白山国家自然保护区的野生新鲜蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link.]菌株。

3.如权利要求1所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，得到的菌悬液用血球计数板计数，菌悬液孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL。

4.如权利要求3所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，在100～105kPa，120～122℃条件下灭菌15～20min。

5.如权利要求3或4所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，培养的温度为22℃。

6.如权利要求1-5中任一项所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，在100kPa，121℃条件下灭菌15min。

7.一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于采用如权利要求1所述的培养方法培养得到。

8.如权利要求7所述的一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法，其特征在于：其有效成分虫草酸含量达10％以上，虫草多糖含量达15％以上，虫草素含量达12％以上，蛋白质含量达31％以上。