CN108184540A - 一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，属于珍稀药用真菌人工栽培领域。该方法以活体黄粉虫幼虫为寄主,采用人工注射的方法接种蛹虫草菌液，染菌后的活体幼虫随菌丝在体内生长而慢慢僵化，经培养后长出蛹虫草子实体。采用本发明，黄粉虫幼虫染菌率达到85％以上，僵化率达到80％以上，蛹虫草有效成分虫草多糖、虫草素、虫草酸含量丰富。本发明操作工艺简单、成品率高，成本低，培育出的产品营养丰富、药用价值高，适用于规模化栽培，应用前景广阔。

Description

一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法

技术领域

本发明涉及一种以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，属于珍稀药用菌的人工栽培技术领域。

背景技术

随着人们对冬虫夏草保健功能的认识，需求量剧增，市场资源紧张，价格高昂，由于其受自然条件所限，产量有限，远远满足不了国内外市场日益增长的需求；同时野生资源的无度开采，严重破坏自然植被和生态平衡，因此开发冬虫夏草替代品蛹虫草，满足国内外市场需求，保护生态环境。

蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、北虫草等，经权威部门检测，含有特有的药用和保健作用的物质：虫草素、虫草酸、虫草多糖和丰富的蛋白质、氨基酸、微量元素、维生素等，其主要化学成分和保健功能与天然冬虫夏草很相似，有平喘止咳、壮阳补肾功能，对肺气肿、气管炎有较好疗效，能明显降低血糖、尿糖、降低血压的作用，还有抗菌、抗癌、增强免疫功能和润肌美容等作用。

黄粉虫(Tenebrio molitor)俗称面包虫，被称为“高蛋白昆虫”，被视为全营养食品。它不仅含有大量蛋白质及对人体有着特殊作用的几丁质、抗菌肽防御素和外源性凝集素，还富含人体必需的多种氨基酸、维生素、矿物质元素、不饱和脂肪酸等多种营养成分，且与人体需求的正常比例一致。用黄粉虫制作营养保健品，不仅可提高人体免疫力，还有抗疲劳、延缓衰老、降低血脂以及抗癌等功效。

人工培育蛹虫草不仅需具有特殊的营养价值，而且要有明显的药用功效，以黄粉虫为寄主培育蛹虫草，将两者有机结合，形成由子实体(即草部分)与菌核(即虫体部分)两部分组成的复合体，营养、药用价值显著，完全可以替代冬虫夏草进入市场，为我国名贵药材产业化开发生产开辟了新途径，具有广阔的发展空间和市场前景。

中国专利文件CN 103749149A公开了一种以黄粉虫蛹为载体培养人工虫草的方法，用原产于青藏高原的野生天然冬虫夏草菌株制备菌悬液接种到活体黄粉虫蛹上经人工培育而成黄粉虫蛹虫草。包括以下步骤：(1)虫草菌菌株的筛选；(2)黄粉虫蛹的准备；(3)菌悬液的制作；(4)接种；(5)子座的培育；(6)虫草的收集保存。但是，该方法选用蛹体作为载体，由于黄粉虫蛹体小，接种后菌丝体量少，得到的子实体短少，生物学效率低。

中国专利文件CN 105557312A公开了一种以黄粉虫幼虫为载体培养虫草产品的方法。所述方法将筛选得到的蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link.]菌株接种于处理后的黄粉虫幼虫上，经过培养得到橙色虫草产品。所述虫草产品中有效成分虫草多糖、虫草素、蛋白质、虫草酸含量丰富。但是，该方法幼虫已灭菌死亡，喷洒法接种菌种用量多；蛹虫草菌丝体只附在虫体表面，虫体内菌丝体含量少，且虫体被菌丝体连成一体，子实体成丛生状，商品价值低。

发明内容

针对现有技术的不足，尤其是虫龄的选择、接种部位和接种量不易控制的不足，本发明提供一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，实现蛹虫草的活体人工培养，提高药用价值，部分替代冬虫夏草，保护冬虫夏草野生资源，促进蛹虫草的开发利用。

本发明培育方法包括菌液制备、培养载体、寄主选择、寄主处理、活体接种、发菌培养、见光培养、子实体培养步骤。

本发明的技术方案如下：

一种以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，包括步骤如下：

(1)菌液制备

在液体培养基中于无菌条件下接种蛹虫草斜面菌种，恒温摇床160～180r/min、24℃培养5～6d；当菌丝生物量干重达到500～600mg/100mL时，无菌条件下打碎至粒径200～300μm，得菌液；

(2)培养载体

在容器内将细砂粒和水按重量比为1︰0.1～0.15混合，密封灭菌；

(3)寄主选择

选择体长2.6cm以上，6～7龄第5～6d的老熟活体黄粉虫幼虫为寄主；

(4)寄主处理

将步骤(3)选择的黄粉虫幼虫用酒精对体表擦拭消毒；

(5)活体接种

在步骤(4)处理后的每个活体黄粉虫幼虫第3、4体节间体内注入0.03～0.12mL菌液，放入步骤(2)制备的培养载体上；

(6)发菌培养

将步骤(5)接种的黄粉虫幼虫在20～22℃环境下避光培养7～10d；

(7)见光培养

当步骤(6)培养的虫体体节间有可见菌丝时，将其置于环境温度为19～20℃，湿度为70～75％，光照强度为400～1000Lx的培养室内24h见光培养；

(8)子实体培养

步骤(7)培养的虫体原基长至0.5～1cm高时，调整光照强度为200～400Lx，培养温度为19～23℃，湿度为85～95％，每天见光6～9h，培养时间为30～35d，即得蛹虫草产品。

根据本发明，优选的，步骤(1)中蛹虫草液体培养基的接种量为4～6块1～3mm²的斜面菌种块，菌液粒径为200～300μm。

优选的，所述的液体培养的营养组成为：每升水中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏3g、维生素B₁ 0.5mg、花生油0.5mL。

根据本发明，步骤(1)中所述的蛹虫草斜面菌种是由市购蛹虫草菌种按现有技术接种到斜面培养基中进行活化培养得到。其中：蛹虫草菌种购自CGMCC，菌种保藏号：3.4655。

根据本发明，优选的，步骤(2)中灭菌的方式为：用0.11MPa、121℃的水蒸汽灭菌50min，冷却至室温；

优选的，密封采用聚丙烯薄膜密封。

根据本发明，优选的，步骤(3)中选择体长2.6～3.3cm、7龄第5～6d的黄粉虫幼虫作为寄主。

根据本发明，优选的，步骤(4)中所述的酒精体积浓度为70-80％。

根据本发明，优选的，步骤(5)中所述的接种部位为3、4体节间，体内菌液注入量为0.05～0.1mL。

根据本发明，优选的，步骤(6)、(7)中所述的培养均为密闭培养，密闭的方式为采用聚丙烯薄膜密封。

根据本发明，优选的，步骤(7)中光照强度为600～900Lx、24h见光。

根据本发明，优选的，步骤(8)中所述的培养为开口培养，开口培养的方式为在聚丙烯薄膜上扎4～6个孔径为2mm的圆孔，光照强度为200～400Lx、6～9h见光。

本发明的有益效果是：

1、采用本方法和步骤培育的蛹虫草，周期短，染菌率、僵化率明显提高，子实体颜色鲜艳，长2.5cm以上，生物学效率达80％以上。

2、采用本发明，黄粉虫幼虫染菌率达到85％以上，僵化率达到80％以上，蛹虫草有效成分虫草多糖、虫草素、虫草酸含量丰富。

3、本方法培育的蛹虫草，主要营养及药物成分如虫草素高于冬虫夏草2.96％，其它有效成分基本一致，具有很好的药用保健价值，完全可替代野生冬虫夏草，既保护了野生资源又维持了生态平衡，且易推广，效益显著。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限于此。

实施例中所用的蛹虫草斜面菌种由市购蛹虫草菌种按现有技术接种的斜面培养基中进行活化培养得到。其中：蛹虫草菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，菌种保藏号：3.4655。

实施例1

一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，包括步骤如下：

(1)菌液制备

用500mL三角烧瓶，盛装300mL液体培养基，液体培养基含有的营养成分为：每升水中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏3g、维生素B₁ 0.5mg、花生油0.5mL；0.11MPa、121℃水蒸汽灭菌40min，冷却至室温，无菌条件下接入4块1mm²的适龄蛹虫草斜面菌种块，静止培养24h，恒温摇床160r/min、24℃条件下培养5d，菌丝生物量干重达到500mg/100mL，无菌条件下打碎至粒径200～300μm的菌液。

(2)培养载体

500mL透明容器内加入细砂粒150g、水15g，搅拌均匀，聚丙烯薄膜封口，0.11MPa、121℃水蒸汽灭菌50min，冷却至室温。

(3)寄主选择

选择体长3.0cm，7龄第5～6d的活体黄粉虫幼虫为寄主；

(4)寄主处理

无菌条件下，将步骤(3)选择的黄粉虫幼虫用75％酒精棉球擦拭体表消毒。

(5)活体接种

无菌条件下，用5mL医用注射器吸取菌液，规格6～7号注射针头在每个活体黄粉虫幼虫第4体节间体内注入0.05mL菌液，放入步骤(2)制备的培养载体上，每瓶放入10条，聚丙烯薄膜封口。

(6)发菌培养

将步骤(5)接种的黄粉虫幼虫在20～22℃环境下避光培养7～10d。

(7)见光培养

步骤(6)培养的虫体僵化、体节间有可见菌丝时，置于环境温度为19～20℃，湿度为70～75％，光照强度为800Lx的培养室内24h见光培养。

(8)子实体培养

步骤(7)培养的虫体原基长至0.5～1cm高时，调整环境光照强度为300Lx，培养温度为19～23℃，湿度为85～95％，聚丙烯薄膜上扎4～6个孔径2mm的圆孔，每天见光6～9h，培养时间为30～35d，即得蛹虫草产品。

实施例2

一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，包括步骤如下：

(1)菌液制备

用500mL三角烧瓶，盛装300mL液体培养基，液体培养基含有的营养成分为：每升水中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏3g、维生素B₁ 0.5mg、花生油0.5mL；0.11MPa、121℃水蒸汽灭菌40mi n，冷却至室温，无菌条件下接入4块1.5mm²的适龄蛹虫草斜面菌种块，静止培养24h，恒温摇床160r/min、24℃条件下培养5d，菌丝生物量干重达到500mg/100mL，无菌条件下打碎至粒径200～300μm的菌液。

(2)培养载体

500mL透明容器内加入细砂粒150g、水20g，搅拌均匀，聚丙烯薄膜封口，0.11MPa、121℃水蒸汽灭菌50min，冷却至室温。

(3)寄主选择

选择体长2.6cm，6龄第5～6d的老熟活体黄粉虫幼虫为寄主；

(4)寄主处理

无菌条件下，将步骤(3)选择的黄粉虫幼虫用75％酒精棉球擦拭体表消毒。

(5)活体接种

无菌条件下，用5mL医用注射器吸取菌液，规格6～7号注射针头在每个活体黄粉虫幼虫第3体节间体内注入0.08mL菌液，放入步骤(2)制备的培养载体上，每瓶放入10条，聚丙烯薄膜封口。

(6)发菌培养

将步骤(5)接种的黄粉虫幼虫在20～22℃环境下避光培养7～10d。

(7)见光培养

步骤(6)培养的虫体僵化、体节间有可见菌丝时，置于环境温度为19～20℃，湿度为70～75％，光照强度为600Lx的培养室内24h见光培养。

(8)子实体培养

步骤(7)培养的虫体原基长至0.5～1cm高时，调整环境光照强度为200Lx，培养温度为19～23℃，湿度为85～95％，聚丙烯薄膜上扎4～6个孔径2mm的圆孔，每天见光6～9h，培养时间为30～35d，即得蛹虫草产品。

实施例3

一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，包括步骤如下：

(1)菌液制备

用500mL三角烧瓶，盛装300mL液体培养基，液体培养基含有的营养成分为：每升水中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏3g、维生素B₁ 0.5mg、花生油0.5mL；0.11MPa、121℃水蒸汽灭菌40mi n，冷却至室温，无菌条件下接入4块1.5mm²的适龄蛹虫草斜面菌种块，静止培养24h，恒温摇床160r/min、24℃条件下培养5d，菌丝生物量干重达到500mg/100mL，无菌条件下打碎至粒径200～300μm的菌液。

(2)培养载体

500mL透明容器内加入细砂粒150g、水22.5g，搅拌均匀，聚丙烯薄膜封口，0.11MPa、121℃水蒸汽灭菌50min，冷却至室温。

(3)寄主选择

选择体长3.3cm，7龄第5～6d的活体黄粉虫幼虫为寄主；

(4)寄主处理

无菌条件下，将步骤(3)选择的黄粉虫幼虫用75％酒精棉球擦拭体表消毒。

(5)活体接种

无菌条件下，用5mL医用注射器吸取菌液，规格6～7号注射针头在每个活体黄粉虫幼虫第4体节间体内注入0.1ml菌液，放入步骤(2)制备的培养载体上，每瓶放入10条，聚丙烯薄膜封口。

(6)发菌培养

将步骤(5)接种的黄粉虫幼虫在20～22℃环境下避光培养7～10d。

(7)见光培养

步骤(6)培养的虫体僵化、体节间有可见菌丝时，置于环境温度为19～20℃，湿度为70～75％，光照强度为400Lx的培养室内24h见光培养。

(8)子实体培养

步骤(7)培养的虫体原基长至0.5～1cm高时，调整环境光照强度为300Lx，培养温度为19～23℃，湿度为85～95％，聚丙烯薄膜上扎4～6个孔径2mm的圆孔，每天见光6～9h，培养时间为30～35d，即得蛹虫草产品。

对比例1

如实施例1所述，不同的是：

步骤(3)中寄主虫龄调整为4龄。结果，虫体染菌率、僵化率降低，子实体短、生物学效率降低，虫草多糖含量明显降低。

对比例2

如实施例1所述，不同的是：

步骤(3)中寄主虫龄调整为9龄时。结果，虫体发满菌时间延长。

对比例3

如实施例1所述，不同的是：

步骤(5)中接种部位调整为第1体节。结果，僵化率降低、虫体发满菌时间延长，生物学效率降低，虫草素含量明显降低。

对比例4

如实施例1所述，不同的是：

步骤(5)中接种部位调整为第6体节。结果，接种后染菌率降低，生物学效率降低，虫草酸含量降低。

对比例5

如实施例1所述，不同的是：

步骤(5)中菌液注射量调整为0.02ml。结果，染菌率、僵化率均降低，虫体发满菌时间延长，生物学效率降低。

对比例6

如实施例1所述，不同的是：

步骤(5)中菌液注射量调整为0.2ml。结果，染菌率、僵化率均降低，虫体发满菌时间延长，生物学效率降低。

试验例

测试实施例1-3和对比例1-6培育的蛹虫草综合性状，结果如表1所示。

表1

由表1可知，本发明的蛹虫草综合农艺性状好于冬虫夏草，有效成分虫草素含量明显高于冬虫夏草，其它有效成分基本一致，达到冬虫夏草要求的效果，完全可以替代冬虫夏草。

Claims (10)

1.一种以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，包括步骤如下：

(1)菌液制备

在液体培养基中于无菌条件下接种蛹虫草斜面菌种，恒温摇床160～180r/min、24℃培养5～6d；当菌丝生物量干重达到500～600mg/100mL时，无菌条件下打碎至粒径200～300μm，得菌液；

(2)培养载体

在容器内将细砂粒和水按重量比为1︰0.1～0.15混合，密封灭菌；

(3)寄主选择

选择体长2.6cm以上，6～7龄第5～6d的老熟活体黄粉虫幼虫为寄主；

(4)寄主处理

将步骤(3)选择的黄粉虫幼虫用酒精对体表擦拭消毒；

(5)活体接种

在步骤(4)处理后的每个活体黄粉虫幼虫第3、4体节间体内注入0.03～0.12mL菌液，放入步骤(2)制备的培养载体上；

(6)发菌培养

将步骤(5)接种的黄粉虫幼虫在20～22℃环境下避光培养7～10d；

(7)见光培养

当步骤(6)培养的虫体体节间有可见菌丝时，将其置于环境温度为19～20℃，湿度为70～75％，光照强度为400～1000Lx的培养室内24h见光培养；

(8)子实体培养

步骤(7)培养的虫体原基长至0.5～1cm高时，调整光照强度为200～400Lx，培养温度为19～23℃，湿度为85～95％，每天见光6～9h，培养时间为30～35d，即得蛹虫草产品。

2.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(1)中蛹虫草液体培养基的接种量为4～6块1～3mm²的斜面菌种块，菌液粒径为200～300μm。

3.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的液体培养的营养组成为：每升水中含有葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母膏3g、维生素B₁ 0.5mg、花生油0.5mL。

4.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(2)中灭菌的方式为：用0.11MPa、121℃的水蒸汽灭菌50min，冷却至室温。

5.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(2)中密封方式为采用聚丙烯薄膜密封。

6.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(3)中选择体长2.6～3.3cm、7龄第5～6d的黄粉虫幼虫作为寄主。

7.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的酒精体积浓度为70-80％。

8.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的接种部位为3、4体节间，体内菌液注入量为0.05～0.1mL。

9.根据权利要求1所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(6)、(7)中所述的培养均为密闭培养，密闭的方式为采用聚丙烯薄膜密封；

优选的，步骤(7)中光照强度为600～900Lx、24h见光。

10.根据权利要求9所述的以黄粉虫活体幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其特征在于，步骤(8)中所述的培养为开口培养，开口培养的方式为在聚丙烯薄膜上扎4～6个孔径为2mm的圆孔，光照强度为200～400Lx、6～9h见光。