CN101843196B - 冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于真菌栽培技术领域，具体是一种冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法，解决了现有人工冬虫夏草不能规模化培养的问题。步骤如下：选择头孢霉和头棒束；制备头孢霉液体菌种和头棒束孢霉液体菌种；配置固体培养基，原料为：玉米渣、黄豆粉、小麦粒、高粱粒、蚕蛹粉、全鸡蛋、黑豆含皮粗粉、脱脂胡麻籽油以及营养液，营养液包括：鸡血、松针、胡萝卜、黑豆、牛骨；混匀接种；培养得子实体和菌丝体。本发明所得子实体和菌丝体经检测，子实体含腺苷≥0.02％，含虫草素≥0.1％，菌丝体含腺苷≥0.055％，指纹图谱测试结果显示其基因相似度＞97％，急性毒性实验、长毒实验测试显示无毒，可为天然虫草的替代品。

Description

冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法

技术领域

本发明属于真菌栽培技术领域，具体涉及一种冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法。

背景技术

80年代以来，真菌工作者从天然虫草中分离出多个虫草菌种(如头孢、束孢、被孢、头棒束孢等等)，并将菌种接到蝙蝠蛾幼虫体上或人工培养基上，幼虫体上和培养基上都能长出虫草，经检测其菌丝和子座的有效成分均与天然虫草的有效成分相当，而且有些成分高于天然，以此证明了人工虫草可替代天然虫草，然而20多年过去了，人工复合虫草仍然停留在实验室。有些企业以大罐发酵模式把虫草生产发展为规模化，但投资大、成本高、分离不出菌丝体、菌种易退化。

发明内容

本发明为了解决现有人工冬虫夏草不能规模化培养的问题，提供了一种冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法。

本发明采用如下的技术方案实现：

1、一种冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法，其特征在于步骤如下：

1)、菌种的选择，如下两个无性世代试管种：

①、头孢霉【Cephalosporium sinensis chen sp nov.】

②、头棒束孢霉【Isaria cretacea.】

两个无性世代菌种分别在PDA培养基转管培养后，历练复壮处理，提纯复壮后的菌种保存备用，在4℃冰箱中存放，时间不超过2个月；

2)、液体菌种制备，各组成的比例为重量比，

①、头孢霉液体菌种制作：

成分：蚕蛹粉、酵母片、白糖、VB、无机盐添加剂、水，

各成分比例按顺序为：2∶1∶6∶0.3∶0.7∶90，

混合以上比例的成分得到头孢霉液体培养基，调节PH至6～7，高压120℃灭菌处理40分钟，后将100份头孢霉液体培养基中接入复壮保存备用的头孢霉菌种15份，缓慢摇匀，培养一周，温度：15～20℃，即得头孢霉液体菌种，保存备用，

无机盐添加剂包括MgSO₄·7H2O、K₂HPO₄·3H2O、[NH₄]₂SO₄，无机盐添加剂的各组分相对上述头孢霉液体培养基的重量比为：MgSO₄·7H2O 0.2％、K₂HPO₄·3H2O 0.3％、[NH₄]₂SO₄0.2％，

②、头棒束孢霉液体菌种的制作

成分：蚕蛹粉、酵母粉、白糖、VB、玉米粉、水，

各成分的比例：2∶1∶6∶0.1∶6∶85，

各成分混为头棒束孢霉液体培养基，调节PH6～7，高压120℃灭菌40分钟，将100份头棒束孢霉液体培养基中接入复壮保存备用的头棒束孢霉菌种15份，以15～20℃条件下摇匀，培养7天，即得头棒束孢霉液体菌种，保存备用；

3)、固体培养基的配置，两个菌种用同种固体培养基，配方如下：

玉米渣30～40份、黄豆粉2～10份、小麦粒15～20份、高粱粒5～10份、蚕蛹粉2～3份、全鸡蛋5～10份、黑豆含皮粗粉20～30份、脱脂胡麻籽油3～5份，

以上物料分别用水浸泡至无干心后捞出来沥去表皮水分，混匀为湿料，分装加入营养液成固体培养基，灭菌，每份固体培养基包括湿料100g，加入营养液10ml，

营养液：鸡血、松针、胡萝卜、黑豆、牛骨按1∶1∶2∶3∶3比例混合于重量为上述各物料总重量4倍的水中，煮沸2小时，过滤得滤液，然后在滤液中补水得营养液，滤液补水后的总重量与煮沸前各物料和水混合的总重量相等，

4)、混匀接种，

在无菌条件下，每100ml头孢菌液体种中混入10ml的头棒束孢霉液体种，缓慢摇匀即得混合菌种，然后立即接种，每份固体培养基中接入20ml混合菌种，封口后进入培养室培养，

5)、培养

①、避光，17℃±1℃，每日早晚通风两次各30分钟，

②、接种后培养20～26天，以2001x日光灯每日照射≥10小时，培养温度改变为9～24℃，昼夜温差≥15℃，保持6～10天，此时子实体的原基和白色菌丝已经开始生长，此时，在18～23℃的散光中培养15天左右，即可收获，分别取出子实体和菌丝体。

上述要求所用物料均为无污染的天然物料、培养环境所需大气、土壤、水均需无污染。

本发明所得子实体和菌丝体经检测，子实体含腺苷≥0.02％，含虫草素≥0.1％，菌丝体含腺苷≥0.055％，指纹图谱测试结果显示其基因相似度＞97％，急性毒性实验、长毒实验测试显示无毒，可为天然虫草的替代品。

具体实施方式

实施例1：冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法，步骤如下，各组成的比例按比重计算：

1.菌种的选择，如下两个无性世代的试管种

头孢霉【Cephalosporium sinensis chen sp nov.】

头棒束孢霉【Isaria cretacea.】

2.对菌种需要历练和复壮，得到的菌种要转接于PDA试管培养基上，在适当温度(17℃±1℃)中培养7天后，置于36℃高温，-20℃低温、烟雾熏蒸、紫外线照射、杂菌感染环境中历练，使菌种得到强化训练，在复壮的过程中死亡的菌种视为退化种，弃之；不退化生长旺盛的菌种即可使用。每个环境中放置不少于12～24小时。在此基础上置于15～20℃条件下培养并进行提纯复壮后的菌种保存备用(在4℃冰箱中存放时间不得超过2个月)。

3.菌种的特征和液体种的制作。

提纯复壮后的菌种直接用于栽培使用的液体种，按常规灭菌、接种、摇瓶。

液体种配方与制法如下：

①头孢霉配方：蚕蛹粉2份、酵母粉1份、白糖6份、VB 0.3份，无机盐添加剂0.7份(无无机盐添加剂包括MgSO₄·7H2O、K₂HPO₄·3H2O、[NH₄]₂SO₄，无机盐添加剂的各组分相对上述头孢霉液体培养基的重量比为：MgSO₄·7H2O0.2％、K₂HPO₄·3H2O 0.3％、[NH₄]₂SO₄ 0.2％)、水90份，混匀为得到混合液，调节PH6～7，高压120℃灭菌40分钟。按常规操作，将100份混合液体接入上述复壮保存备用的头孢霉菌种15份，15-20℃条件下摇匀，培养7天，即为头孢霉液体种，保存备用。

②头棒束孢霉配方：蚕蛹粉2份、酵母粉1份、白糖6份、VB 0.1份、玉米粉6份、水85份、混为头棒束孢霉液体培养基，调节PH6～7，高压120℃灭菌40分钟。按常规操作，将100份头棒束孢霉液体培养基中接入复壮保存备用的头棒束孢霉菌种15份，以15-20℃条件下摇匀，培养7天，即为头棒束孢霉液体种，保存备用。

4.固体培养基的配置，两个菌种用同种固体培养基，配方如下：

玉米渣40份、黄豆粉10份、小麦粒15份、高粱粒5份、蚕蛹粉2份、全鸡蛋5份、黑豆含皮粗粉20份、脱脂胡麻籽渣3份，

备注：以上分别用水浸泡至无干心后捞出来沥去表面水分，混匀为湿料，分装加入营养液成固体培养基，灭菌，每份固体培养基包括湿料100g，加入营养液10ml，按常规操作灭菌。

营养液：鸡血、松针、胡萝卜、黑豆、牛骨按1∶1∶2∶3∶3比例混合于重量为上述各物料总重量4倍的水中，煮沸2小时，过滤得滤液，然后在滤液中补水得营养液，滤液补水后的总重量与煮沸前各物料和水混合的总重量相等。

5.混匀接种

在无菌操作的环境下，每100ml头孢霉液体菌种中混入10ml的头棒束孢霉液体菌种随手摇匀，然后立即接种：上述每份固体培养基中接入20ml混合菌种封好进入培养室培养。

6.培养

①避光，17℃±1℃，培养20～26天，每日早晚避风两次各30分钟。

②当菌丝生长培养基后，2001x光照每日≥10小时，培养温度改变为9-24℃，昼夜温差＞15℃，保持6～10天。此时子实体的原基和白色菌丝争先共生，在18～23℃的散光中培养15天左右，子实体上长出孢子囊时即可收获，再把菌丝体细心挑出来(为纯菌丝)。所得生物总效率为40％，干品3g左右，(子实体2g，菌丝体1g，为冬虫夏草可替代品复合物)。上述要求所用物料均为无污染的天然物料、培养环境所需大气、土壤、水均需无污染。

产品质量：所得子实体和菌丝体经检测，子实体含腺苷＝0.023％，含虫草素＝0.13％，菌丝体含腺苷＝0.058％，指纹图谱测试结果显示其基因相似度＝97.3％，急性毒性实验、长毒实验测试显示无毒，可为天然虫草的替代品。

实施例2：

固体培养基的配方如下：玉米渣30份、黄豆粉8份、小麦粒20份、高粱粒7份、蚕蛹粉3份、全鸡蛋8份、黑豆含皮粗粉24份、脱脂胡麻籽渣5份，其余步骤同实施例1。

产品质量：所得子实体和菌丝体总效率为40％，干品3.2g，(子实体2g，菌丝体1.2g)，经检测，子实体含腺苷＝0.021％，含虫草素＝0.15％，菌丝体含腺苷＝0.062％，指纹图谱测试结果显示其基因相似度为97.5％，急性毒性实验、长毒实验测试显示无毒，可为天然虫草的替代品。

实施例3：

固体培养基的配方如下：玉米渣35份、黄豆粉2份、小麦粒18份、高粱粒10份、蚕蛹粉2.5份、全鸡蛋10份、黑豆含皮粗粉30份、脱脂胡麻籽油4份，其余步骤同实施例1。

产品质量：所得子实体和菌丝体总效率为40％，干品3.1g，(子实体2.1g，菌丝体1g)，所得子实体和菌丝体经检测，子实体含腺苷＝0.022％，含虫草素＝0.12％，菌丝体含腺苷＝0.056％，指纹图谱测试结果显示其基因相似度为97.3％，急性毒性实验、长毒实验测试显示无毒，可为天然虫草的替代品。

Claims (1)

1.一种冬虫夏草菌丝体和子实体的栽培方法，其特征在于步骤如下：

1)、菌种的选择，如下两个无性世代试管种：

①、头孢霉 (Cephalosporium sinensis chen sp nov.)

②、头棒束孢霉 (Isaria cretacea)

两个无性世代菌种分别在PDA培养基转管培养后，历练复壮处理，提纯复壮后的菌种保存备用，在4℃冰箱中存放，时间不超过2个月；

2)、液体菌种制备，各组成的比例为重量比，

①、头孢霉液体菌种制作：

成分：蚕蛹粉、酵母片、白糖、VB、无机盐添加剂、水，

各成分比例按顺序为：2∶1∶6∶0.3∶0.7∶90，

混合以上比例的成分得到头孢霉液体培养基，调节PH至6～7，高压120℃灭菌处理40分钟，后将100份头孢霉液体培养基中接入复壮保存备用的头孢霉菌种15份，缓慢摇匀，培养一周，温度：15～20℃，即得头孢霉液体菌种，保存备用，

无机盐添加剂包括MgSO₄·7H2O、K₂HPO₄·3H2O、[NH₄]₂SO₄，无机盐添加剂的各组分相对上述头孢霉液体培养基的重量比为：MgSO₄·7H2O 0.2％、K₂HPO₄·3H2O 0.3％、[NH₄]₂SO₄ 0.2％，

②、头棒束孢霉液体菌种的制作

成分：蚕蛹粉、酵母粉、白糖、VB、玉米粉、水，

各成分的比例：2∶1∶6∶0.1∶6∶85，

各成分混为头棒束孢霉液体培养基，调节PH6～7，高压120℃灭菌40分钟，将100份头棒束孢霉液体培养基中接入复壮保存备用的头棒束孢霉菌种15份， 以15～20℃条件下摇匀，培养7天，即得头棒束孢霉液体菌种，保存备用；

3)、固体培养基的配置，两个菌种用同种固体培养基，配方如下：

玉米渣30～40份、黄豆粉2～10份、小麦粒15～20份、高粱粒5～10份、蚕蛹粉2～3份、全鸡蛋5～10份、黑豆含皮粗粉20～30份、脱脂胡麻籽油3～5份，

以上物料分别用水浸泡至无干心后捞出来沥去表皮水分，混匀为湿料，分装加入营养液成固体培养基，灭菌，每份固体培养基包括湿料100g和加入的营养液10ml，

营养液：鸡血、松针、胡萝卜、黑豆、牛骨按1∶1∶2∶3∶3比例混合于重量为上述各物料总重量4倍的水中，煮沸2小时，过滤得滤液，然后在滤液中补水得营养液，滤液补水后的总重量与煮沸前各物料和水混合的总重量相等，

4)、混匀接种，

在无菌条件下，每100ml头孢菌液体种中混入10ml的头棒束孢霉液体种，缓慢摇匀即得混合菌种，然后立即接种，每份固体培养基中接入20ml混合菌种，封口后进入培养室培养，

5)、培养

①、避光，17℃±1℃，每日早晚通风两次各30分钟，

②、接种后培养20～26天，以2001x日光灯每日照射≥10小时，培养温度改变为9～24℃，昼夜温差≥15℃，保持6～10天，此时子实体的原基和白色菌丝已经开始生长，此时，在18～23℃的散光中培养15天左右，即可收获，分别取出子实体和菌丝体。