KR101898086B1

KR101898086B1 - 장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 증대시키기 위한 배양 및 생육방법

Info

Publication number: KR101898086B1
Application number: KR1020150169412A
Authority: KR
Inventors: 김덕수; 이수용; 김태욱; 김철군; 김해숙
Original assignee: 김태욱; 김철군
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2018-09-12
Also published as: KR20170064143A

Abstract

본 발명은 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법에 관한 것으로, 특히 장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 크게 증대시킬 수 있는 배양 및 생육방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, (a) 장수하늘소 동충하초의 종균을 액체 배지에 접종하여 18~25℃, 광조사량 800~1300 Lux의 조건으로 5~10일 동안 배양하는 단계; (b) (a)에서 배양된 균주를 멸균된 액체배지로 옮겨서 20±2℃ 범위에서 낮과 밤의 기온을 달리하면서 광조사량 800~1300 Lux 조건으로 5~10 동안 배양하는 단계; 및 (c) (b)에서 얻은 배양체를 멸균된 고체배지에 접종하고 20~26℃로 45~55일간 생육시키는 단계를 포함하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법이 제공된다. 본 발명에 따르면, 장수하늘소 동충하초를 높은 수확률과 생산성으로 인공재배할 수 있을 뿐만 아니라 코디세핀의 함량이 크게 증가되어 장수하늘소 동충하초의 가치가 증대된다.

Description

장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 증대시키기 위한 배양 및 생육방법 {Cultivating method of Cordyceps staphylinidicola for increasing its content of cordycepin}

본 발명은 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법에 관한 것으로, 특히 장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 크게 증대시킬 수 있는 배양 및 생육방법에 관한 것이다.

동충하초는 겨울에는 곤충의 몸에 있다가 여름에는 풀처럼 나타난다는 데서 이름지어진 일종의 버섯으로, 곰팡이의 일종인 동충하초균이 살아있는 곤충의 몸속으로 들어가 발생하는 곤충기생성 약용버섯이다. 동충하초로는 코디세프스 시네시스(Cordyceps sinensis), 밀리타리스 동충하초(Codyceps militaris, 번데기 동충하초), 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica) 등이 잘 알려져 있는데, 장수하늘소 유충을 기주로 하는 장수하늘소 동충하초(Cordyceps staphylinidicola)는 가장 많이 이용되는 번데기 동충하초(Cordyceps miliatris)에 비해서도 높은 코디세핀을 함유하는 균주들이 자연에 존재한다.

동충하초는 동의보감을 통해서 오랫동안 많은 효능이 인정되어 각종 성인병 질환의 치료 및 건강유지를 위하여 사용되어 왔다. 중국에서는 육상선수들이 동충하초를 복용하고 기적의 기록들을 나타낸다고 하여 동충하초를 3대 천연식품 건강 명약으로 인정하고 있다.

동충하초는 작물들 중 단백질 함량이 가장 높은 (건조함량의 28%이상) 군에 속하고, 면역력을 강화시키는 물질이 다량 함유되어 있다. 동충하초의 면역활성물질 중에는 키닉산(quinic acid)의 이성체로 밝혀진 '코디세핀(Cordycepin :3'-deoxy-adenosine)' 이 포함되어 있으며, 동충하초 중에서도 밀리타리스 동충하초가 다른 동충하초에 비하여 코디세핀의 함량이 월등히 높다. 코디세핀은 핵산 물질로서 세포의 유전정보에 관여하면서 저하된 면역기능을 활성화하여 정상세포가 암세포로 전환되는 것을 방지하는 작용을 한다. 동충하초를 투입한 임상실험에서 암세포를 죽이는 면역세포인 NK세포(natural killer cell/자연살해세포)와 면역세포에서 분비되는 사이토카인의 함량이 18%~25% 증가되는 것으로 확인되어 혈액암치료용으로 활용되고, 건강기능식품으로서도 많은 관심을 받고 있다. 이러한 결과를 토대로 국내에서는 코디세핀이 함유된 동충하초가 버섯으로는 유일하게 건강기능식품으로 식약처인증을 받았다. 또한 동충하초는 혈압과 당뇨를 조절하는 효능과 폐와 간 기능 등에도 많은 도움을 주는 것으로 임상연구결과가 발표되고 있다.

동충하초는 버섯류 중에서도 많은 소비가 이루어지고 있지만 천연에서 채집되는 양은 매우 적어서 수요를 충당할 수 없으므로 전 세계의 많은 농가들이 인공재배법으로 재배사를 만들어서 대량 재배하고 있다. 그러나 동충하초는 성장속도가 느리고, 외부환경에 민감하여 농약을 살포할 수 없는 식물이어서 재배가 매우 까다롭다. 대량재배에 성공하기는 하였지만 오랫동안 재배를 해온 농가에서도 동충하초 재배의 수확률은 저조한 것으로 알려져 있다. 즉, 10개를 배양하여 수확하면 1~2개 정도가 오염되거나 이상 균주가 성장하여 수확율이 낮아진다.

현재 동충하초의 재배에 가장 많이 사용되는 방법은, 누에애벌레에 직접 균을 접종하여 키우는 애벌레 번데기 동충하초 재배법, 누에 번데기가루와 현미를 혼합한 배지에 균을 접종하여 키우는 현미+번데기 가수 동충하초 재배법, 상기 재배방법에 게르마늄 성분들을 강화시킨 재배법 등이며, 멸균된 상태에서 접종하여 평판에서 재배하거나 다른 버섯류와 같이 병에서 재배하는 것이 일반적이다.

1. 대한민국 등록특허공보 10-1264441 2. 대한민국 등록특허공보 10-1421742 3. 대한민국 등록특허공보 10-1036054 4. 대한민국 등록특허공보 10-0365041 5. 대한민국 공개특허공보 10-2004-0032001

본 발명은 장수하늘소 동충하초(Cordyceps staphylinidicola) 균주를 자연에서 채집하여 배양 및 생육하는 방법을 제공하고자 하는 것으로, 특히 인공적인 배양 및 생육방법이 확립되지 않은 장수하늘소의 안정적인 배양 및 생육방법을 제공하는 동시에 장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 크게 증대시키는 배양 및 생육하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 장수하늘소 동충하초의 종균을 PDA 배지에 접종하여 20±1℃의 온도 및 1,000±100Lux의 광조사량 조건으로 5~10일 동안 배양하는 단계;

(b) (a)에서 배양된 균주를 멸균된 PDB 배지로 옮기고, 12시간 동안 18℃ 및 12시간 동안 22℃의 온도 조건에서 1,000±100Lux의 광을 3시간 간격으로 on/off하여 조사하면서 5~10일 동안 배양하는 단계; 및
(c) (b)에서 얻은 균사체 배양액을 균질화하고 멸균된 대두박배지로 옮겨서 22±2℃의 온도에서 5~10일 동안 배양하여 접종원을 얻는 단계; 및

(d) (c)에서 얻은 접종원을, 현미와 물을 포함하고 콜라겐에서 유래한 평균분자량 400~800의 올리고펩타이드를 현미중량 기준으로 5~40중량%로 포함하는 멸균된 현미배지에 접종하고 22±2℃의 온도에서 45~55일 동안 자실체를 생육하는 단계를 포함하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법을 제공한다.

삭제

상기 방법에서, 상기 (d)의 자실체를 생육하는 단계에서 1,000±100Lux의 광을 조사할 수 있다.

상기 방법에서, 상기 (d)의 자실체를 생육하는 단계는, 상부에 덮개가 있는 재배용기에 상기 현미배지를 담고 물을 첨가한 후 고온 고압으로 멸균시킨 다음 배양체를 접종하여 배지 자체의 수분만으로 45~55일간 생육시키는 것이 바람직하다.
상기 방법에서, 상기 현미배지는 기주곤충 분말을 더 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 상기 재배용기의 덮개는 안쪽에 필터가 구비되고 측면에 통기공이 형성되어, 통기공을 통해 들어온 공기가 필터를 거쳐 재배용기 내부로 공급되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 배양 및 생육방법으로 얻은, 코디세핀 함량이 증대된 장수하늘소 동충하초를 제공한다. 본 발명에 따라 배양 및 생육된 장수하늘소 동충하초는, 45일 이상 생육시 바람직하게는 코디세핀 함량이 1500ppm 이상, 특히 바람직하게는 2000ppm 이상이며, 자실체의 높이는 12㎝ 이상이다.

본 발명에서는 장수하늘소 동충하초(Cordyceps staphylinidicola)에 대하여 안정적인 인공 배양 및 생육방법을 제공하며, 특히 장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 크게 증대시킬 수 있는 배양 및 생육방법을 제공한다. 본 발명에 따라 배양 및 생육된 장수하늘소 동충하초는, 코디세핀 함량이 많게는 2000~2500ppm 이상에 이르며, 자실체의 높이나 굵기도 커서 높이가 12㎝에서 16㎝에 이른다. 본 발명에 따르면, 장수하늘소 동충하초를 높은 수확률과 생산성으로 인공재배할 수 있을 뿐만 아니라 코디세핀의 함량이 크게 증가되어 장수하늘소 동충하초의 가치를 증대시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 재배용기의 바람직한 일 실시예이다.

본 발명의 장수하늘소 동충하초의 코디세핀 함량을 증대시키기 위한 배양 및 생육방법을 단계별로 자세히 설명한다.

종균 배양 단계

삭제

장수하늘소 동충하초의 종균은 자연에서 채취한 장수하늘소 동충하초 자실체로부터 직접 포자를 얻어 분리 배양하여 사용하거나, 이렇게 배양되어 온 종균을 이용할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 자연에서 채취한 장수하늘소 동충하초 자실체를 페트리디쉬 뚜껑 내부에 멸균테이프로 고정시킨 후 PDA 배지가 담긴 페트리디쉬 위에 상기 뚜껑을 덮고 닫힌 크린벤치 안에서 12시간 동안 유지시키고, 배지에 떨어진 포자를 분리하여 20℃ 항온기에서 17일 동안 배양하여 종균을 얻었다.
장수하늘소 동충하초의 종균을 액체 배지에 접종하여 18~25℃, 광조사량 800~1300 Lux의 조건으로 5~10일 동안 배양한다. 20±1℃의 온도 및 1,000±100Lux의 광조사량 조건으로 배양하는 것이 보다 바람직하며, 7±1일 동안 배양하는 것이 보다 바람직하다.

액체 배지는 특별히 한정되지는 않으나 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 PDA 배지는 탄소원으로 포도당을 포함할 수 있다.

삭제

균사체 배양 단계

상기 단계에서 배양된 균주를 멸균된 액체배지로 옮겨서 20±2℃ 범위에서 낮과 밤의 기온을 달리하면서 광조사량 800~1300 Lux 조건으로 5~10 동안 배양한다.

이때 항온배양기에서 12시간 동안 18℃, 12시간 동안 22℃의 온도 조건을 유지하여, 자연에서와 같은 낮과 밤의 온도차를 맞추는 것이 바람직하다.
광조사량은 1,000±100Lux인 것이 보다 바람직하며, 광조사는 3시간 간격으로 on/off하면서 조절하는 것이 바람직하다.

액체 배지는 특별히 한정되지는 않으나 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 PDB 배지는 탄소원으로 포도당을 포함할 수 있다.
접종원 배양 단계
상기 균사체 배양액을 균질화하고, 균질화된 배양액을 멸균된 대두박 배지로 옮겨서 22±2℃에서 5~10일 동안 자실체 생육을 위한 접종원을 배양한다.
대두박에서 배양된 배양체를 자실체 생육을 위한 접종원으로 사용한다.

자실체 생육 단계

상기 단계에서 얻은 배양체(균주+배지)를 멸균된 고체배지에 접종하고 20~26℃로 45~55일 동안 생육한다. 22±2℃의 온도에서 45~55일 동안 생육하는 것이 보다 바람직하다.

삭제

상기 고체배지는 곡물 배지인 것이 바람직하다. 고체배지로는 현미배지를 사용하는 것이 보다 바람직한데, 본 발명에서 "현미배지"는 현미를 주성분으로 하는 고체배지로 정의된다. 현미와 현미중량의 1~2배의 물을 포함하는 현미배지를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 고체배지는 바람직하게는 평균분자량 400~800의 저분자펩타이드(올리고펩타이드)를 고체배지 중 고형분의 중량을 기준으로 5~40중량%로 포함한다. 저분자 펩타이드(올리고펩타이드)를 포함함으로써 장수하늘소 동충하초의 생육이 촉진되고 코디세핀의 함량이 크게 증대되게 된다. 본 발명에서 사용하는 저분자 펩타이드(올리고펩타이드)는 콜라겐으로부터 유래된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 고체배지는, 필요에 따라 기주곤충인 장수하늘소 유충의 분말을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 유충 분말은 고체배지의 고형분 중량의 1/2 내지 1/10을 사용하는 것이 바람직하다.
자실체 생육 단계에서도 선택적으로 광을 조사할 수 있다. 광조사를 하는 경우, 광조사량은 800~1,300Lux인 것이 바람직하고, 1,000±100Lux인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 이 자실체 생육 단계에서 상부에 덮개가 있는 재배용기를 사용한다.

재배용기의 바람직한 일 실시예는 도 1과 같다. 재배용기(100)는 몸체(10)와 상부의 덮개(20)로 이루어지며, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE) 등의 플라스틱 재질로 형성될 수 있다. 덮개(20)는 상하 2중으로 형성된 윗면(21b)과 이를 둘러싼 측면(21a)으로 이루어지며, 2중으로 형성된 윗면의 상하부 사이에 필터(24)가 구비되되, 상기 하부에는 통공(23)이 형성되어 있어 필터를 통과하여 공기가 재배용기 내외부로 소통될 수 있다. 상기 덮개의 측면(21a) 하단에는 통기공(22)이 형성되어 있어, 이 통기공(22)을 통해 들어온 공기가 필터를 거쳐 재배용기 내부로 공급될 수 있다.

상기 재배용기(10)에 상기 고체배지를 담고 물을 첨가한 후 고온 고압으로 멸균시킨 다음 배양체를 접종하면 배지 자체의 수분만으로 별도의 수분 보충 없이 수확시 까지 생육이 가능하다. 이렇게 본 발명의 재배용기를 사용할 경우 잡균에 의한 오염의 우려가 없으며 한번 용기에 넣고 접종하면 수확할 때까지 별도로 수분을 보충할 필요가 없어 사람의 손을 요하지 않으므로 매우 간편하고 생산성이 높다.

생육기간은 환경 조건에 따라 달라질 수 있으나, 통상 45~55일 정도가 외관이나 코디세핀 함량 면에서 바람직하다.

[ 실시예 ]

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

자연에서 채취한 장수하늘소 동충하초 자실체를 페트리디쉬 뚜껑 내부에 멸균테이프로 고정시킨 후 PDA 배지가 담긴 페트리디쉬 위에 상기 뚜껑을 덮고 닫힌 크린벤치 안에서 12시간 동안 유지하였다. 배지에 떨어진 포자를 분리하여 20℃ 항온기에서 17일 동안 배양하여 종균으로 사용할 균주를 얻었다.

< 실시예 2>

온도에 따른 균사체의 성장

실시예 1에서 얻은 균주를 현미배지에 접종하여 배양온도에 따른 균의 활착, 균사체의 형성, 코디세핀 함량을 측정하였다. 접종 후 27일 경과 후에 균사체의 코디세핀 함량을 측정하고 선정된 균은 다음의 실험 기준으로 하였다.

[표 1]

온도에 따른 균사체의 성장 실험( 27일 경과 후)

완성된 균사는 노란색~홍색으로 짙게 나타났다. 일반적으로 균사가 활착되는 초기의 단계에는 외관상 현미 배지에 현미의 각 사이로 백색의 균이 활착되며 활착의 밀도가 높아지고 시간이 경과되면서 옅은 홍색 또는 노란색으로 착색이 나타나며 자실이 형성되기 바로 전에 붉은 색이 많아지면서 현미 배지의 형태를 감출 정도로 균사가 형성되었다.

<실시예 3>

광 조사량에 따른 균사체의 성장 및 코디세핀 함량

실시예 1에서 얻은 종균 균주를 PDA 39g/ℓ, 포도당 20g/ℓ을 포함하는 액체배지를 사용하여 10일 동안 배양하였다.
상기 배양된 종균 균주를 PDB 24g/ℓ, 포도당 45g/ℓ를 포함하는 액체배지를 사용하여 10일 동안 배양하여 균사체를 얻었다. 이때 항온배양기에서 온도조건은 타이머를 이용하여 12시간 동안 18℃, 12시간 동안 22℃로 유지하고, 광조사량은 100Lux씩 변화를 주면서 광조사시간은 타이머를 이용하여 3시간 간격으로 on/off하여 배양하였다.

다른 조건을 동일하게 한 상태에서 광조사량만 다르게 하여 재배하였을 때 아래 표 2와 같은 결과를 얻었다.

[표 2]

상기 표 2의 결과에서와 같이, 광조사량은 장수하늘소 동충하초의 성장 및 코디세핀 함량과 밀접한 관계가 있는 것으로 확인되었다.
빛과 조사량이 강할 때 우수한 균사의 성장을 보였으나, 일정한 조도를 넘으면 균의 활착이 오히려 떨어지는 것으로 나타났다. 따라서 1000Lux 전후가 가장 적합함을 알 수 있었다.

<실시예 4>

배지의 종류와 성장기일에 따른 코디세핀 함량 변화

실시예 2 및 3의 결과에 따라 균사의 활착에 가장 적합한 조건인 20℃의 온도에서 1000Lux의 광조사량으로 실시예 1에서 얻은 균주를 PDA 배지에서 7일 동안 배양하였다.

삭제

(1) 배지의 조건에 따른 균에 활착과 생육상태

동일한 조건 하에서 배지 첨가물만을 달리하여 자실체의 생육 및 코디세핀 함량에 미치는 영향을 다음과 같이 분석하였다.
배양된 종균 균주를 500㎖ 삼각플라스크 내의 200㎖ PDB 액체배지에 접종한 후 12시간 동안 18℃, 12시간 동안 22℃의 온도 조건에서 1,000Lux의 광을 타이머를 이용하여 3시간 간격으로 on/off하여 조사하면서 7일 동안 정치배양하였다. 균사체를 배양한 후 활성화된 배지를 균질화하였다.
그런 다음 대두박배지(물 160ℓ, 탈지대두분 48g, 설탕 4.8kg, 제일인산 80g, 황산마그네슘 80g, 식용유 160cc)를 제조하여 습윤감압멸균하고(121℃, 1.5psi, 60min) 식힌 뒤 상기 균질화된 배양액을 옮겨서 22℃에서 7일 동안 접종원을 배양하였다.

배양된 접종원은 101℃에서 4시간 동안 상압살균한 현미배지에 상기 접종원 15cc씩 액체 접종기를 이용하여 접종하였따. 이때 현미배지는 물 65g, 현미 50g 및 배지첨가제 2.5g을 포함하며, 배지첨가제로는 물, 우유, 고분자펩타이드 및 저분자펩타이드를 각각 사용하였다.

배지 첨가제 중 고분자펩타이드는 돈피콜라겐에 알칼라제 0.1중량%를 가하고 55±5℃에서 3~6시간 분해하여 얻은 평균분자량 4,000~10,000의 폴리펩타이드 10% 멸균정제수용액를 사용하였다. 저분자펩타이드는 콜라겐에서 유래한 평균분자량 400~800의 올리고펩타이드 10% 멸균정제수용액을 사용하였다.

삭제

접종원을 접종한 후 생육실로 옮겨서 22℃에서 47일 동안 생육한 후 자실체의 형성을 관찰하고 자실체가 완성된 후의 코디세핀 함량을 측정하였다. 그 결과는 아래 표 3과 같다.

[표 3]

현미배지에서 하늘소 동충하초가 잘 활착하여 생육되는 것을 확인하였고, 동충하초가 성장되는 자연과 같은 조건에서 펩타이드를 첨가하여 아미노산을 적절하게 공급함으로써 코디세핀의 함량에 큰 변화가 있음을 확인하였다.

(2) 생육 기간에 따른 적합한 성장기일(수확기)

현미배지에 표 3의 배지첨가제 중 저분자펩타이드(올리고펩타이드)를 첨가한 배지를 사용하고, 기타 조건은 상기 (1)에 기재된 것과 동일한 조건으로 자실체를 생육하였다. 생육 기간에 따른 외관과 자실의 높이, 코디세핀 함량을 표 4에 나타내었다.

생육 기간이 어느 정도 지나면 자실이 마르고 균사체 밑으로 물이 형성되며, 전체적인 밝은 홍색의 빛도 퇴색 되고 어두어졌다. 따라서 적합한 생육기간은 환경 조건에 달라지겠지만 대체로 45~55일이 적합한 것으로 판단되었다.

[표 4]

Claims

(a) 장수하늘소 동충하초의 종균을 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 접종하여 20±1℃의 온도 및 1,000±100Lux의 광조사량 조건으로 5~10일 동안 배양하는 단계;
(b) (a)에서 배양된 종균 균주를 멸균된 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지로 옮기고, 12시간 동안 18℃ 및 12시간 동안 22℃의 온도 조건에서 1,000±100Lux의 광을 3시간 간격으로 on/off하여 조사하면서 5~10일 동안 배양하는 단계;
(c) (b)에서 얻은 균사체 배양액을 균질화하고 멸균된 대두박배지로 옮겨 22±2℃의 온도에서 5~10일 동안 배양하여 접종원을 얻는 단계; 및
(d) (c)에서 얻은 접종원을, 현미와 물을 포함하고 콜라겐에서 유래한 평균분자량 400~800의 올리고펩타이드를 현미중량 기준으로 5~40중량%로 포함하는 멸균된 현미배지에 접종하고 22±2℃의 온도에서 45~55일간 자실체를 생육하는 단계를 포함하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법.
제1항에 있어서,
상기 (d)의 자실체를 생육하는 단계에서 1,000±100Lux의 광을 조사하는 것을 특징으로 하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법.
제1항에 있어서,
상기 (d)의 자실체를 생육하는 단계는, 상부에 덮개가 있는 재배용기에 상기 현미배지를 담고 물을 첨가한 후 고온 고압으로 멸균시킨 다음 배양체를 접종하여 배지 자체의 수분만으로 45~55일간 생육하는 것을 특징으로 하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법.
삭제
삭제
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 현미배지는 기주곤충 분말을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법.
제3항에 있어서,
상기 재배용기의 덮개는 안쪽에 필터가 구비되고 측면에 통기공이 형성되어, 통기공을 통해 들어온 공기가 필터를 거쳐 재배용기 내부로 공급되는 것을 특징으로 하는, 장수하늘소 동충하초의 배양 및 생육방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배양 및 생육방법으로 얻은, 코디세핀 함량이 증대된 장수하늘소 동충하초.