CN103704022A - 一种以五龄桑蚕为载体培养人工虫草的方法 - Google Patents

Abstract

一种以五龄桑蚕为载体培养人工虫草的方法，用原产于青藏高原的野生天然冬虫夏草菌株制备菌悬液接种到活体五龄桑蚕上经人工培育而成五龄桑蚕虫草。包括以下步骤：(1)虫草菌菌株的筛选；(2)五龄桑蚕的准备；(3)菌悬液的制作；(4)接种；(5)子座的培育；(6)虫草的收集保存。本发明以家养五龄柞蚕为宿主，人工接种冬虫夏草菌株菌悬液，培育而成。接种成功率、接种后的僵化率达80％以上，子实体的长出率达85％以上，从接种到子实体的成熟约35-48天。

Description

一种以五龄桑蚕为载体培养人工虫草的方法

技术领域

本发明属于药用菌栽培技术领域，涉及一种以五龄桑蚕为载体培养人工虫草的方法，尤其涉及一种用原产于青藏高原的野生天然冬虫夏草菌株制备菌悬液接种到活体五龄桑蚕上经人工培育而成人工虫草的培育方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高和对健康的重视，冬虫夏草及其附属产品成为一个发展迅速的产业。冬虫夏草列为国家二级保护物种，各地政府也出台政策禁挖、限挖，但对冬虫夏草的采挖并未得到遏制。冬虫夏草是我国的一种名贵中药，由于它需要特殊的生长条件，生长期较长，因而在自然界中数量十分稀少，随着环境条件的改变，产量呈逐渐下降趋势，而社会需求越来越大，故十分名贵，价格也不菲，目前市场上达到每千克4万元左右。

蛹虫草隶属子囊菌门、肉座菌日、麦角菌科、虫草属，是虫草属的模式种，为虫生药用真菌。蛹虫草在功能食品、医药利生物学技术方面有很好的实用价值，在营养价值、活性成分和医疗保健功效等方面都和冬虫夏草相似；药理分析结果表明蛹虫草活性成分中虫草素、腺嘌呤明显高于冬虫夏草，因此，蛹虫草在国内外倍受人们的关注。

虽然虫草在国际市场上有很好的发展前景，但由于它的天然形成不易，不能满足需求，将蛹虫草菌悬液接种于家蚕幼虫体内做代替寄主成功地培育出蛹虫草子实体是一条具有综合效益的新途径，一方面模拟其野生形态，使蛹虫草菌感染虫体后长出子实体，更好地恢复其野生能力和感染能力；另一方面提高药用价值，将具有较高药用价值的家蚕和蛹虫草结合在了一起，使其药用价值得到更大的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用原产于青藏高原的野生天然冬虫夏草菌株孢子接种到有机活体五龄桑蚕上人工培育而成五龄桑蚕虫草的培育方法。

为实现上述目的，本发明一种五龄桑蚕虫草的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)虫草菌菌株的筛选

将原产于青藏高原的野生新鲜冬虫夏草菌株，接种于五龄桑蚕粉末(五龄桑蚕烘干后，粉碎)作为氮源的平板培养基上生长，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得长势比较快、性状稳定的冬虫夏草纯菌株数株，以上述菌株作为本发明的目的菌株；

2)五龄桑蚕的准备

在无菌操作台内，将活体蛹用75％酒精消毒6-9分钟左右，用无菌水冲洗5-6次，晾干作宿主；

3)菌悬液的制作

将筛选的虫草菌株接种于以五龄桑蚕粉末作为主要氮源制成的培养基平板上，置20℃下培养，待出现大量菌丝后，挑取一部分接种于液体培养基内培养，培养4-5天，用高速离散器，以10000r/min，匀浆1min既得菌悬液；

4)接种

在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入上述五龄桑蚕尾部或口器，按0.1-0.15毫升/只注入菌液；

5)子座的培育

将处理后的五龄桑蚕放于无菌的玻璃瓶或者大的玻璃平皿，挑选优质桑叶消毒后给蚕喂食饲养，20℃下保护至蛹体僵硬；然后将培养僵硬的蛹体置于15-25℃、空气相对湿度为85-95％的自然光照的无菌培养室中培养；

6)虫草的收集保存

子座成熟后，放在60℃环境下烘干1-5小时，置阴凉干燥处密封保存，或采用真空冷冻干燥后进行低温贮存。

本发明以家养五龄柞蚕为宿主，人工接种冬虫夏草菌株菌悬液，培育而成。接种成功率、接种后的僵化率达80％以上，子实体的长出率达85％以上。从接种到子实体的成熟约35-48天。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

本发明中的活体五龄桑蚕为本公司实验室自主提供。

本发明技术方案：培育人工虫草时，将筛选的虫草菌株接种于以五龄桑蚕粉末作为主要氮源培养平板基上，置20℃下培养，待出现大量菌丝后，挑取一部分放在液体培养基内培养，培养4-5天，用高速离散器打碎菌丝球既得菌悬液，将菌悬液接种于上述五龄桑蚕尾部或口器，至蛹体直至僵硬。然后将僵硬的五龄桑蚕体放在适合蛹虫草菌培养的条件下培养。具体技术方案如下：

1)虫草菌菌株的筛选

将原产于青藏高原的野生新鲜冬虫夏草菌株，接种于五龄桑蚕粉末(五龄桑蚕烘干后，粉碎)作为氮源的平板培养基上生长，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得长势比较快、性状稳定的冬虫夏草纯菌株数株，以上述菌株作为本发明的目的菌株；

2)五龄桑蚕的准备

在无菌操作台内，将活体蛹用75％酒精消毒6-9分钟左右，用无菌水冲洗5-6次，晾干作宿主；

3)菌悬液的制作

将筛选的虫草菌株接种于以五龄桑蚕粉末作为主要氮源制成的培养基平板上，置20℃下培养，待出现大量菌丝后，挑取一部分接种于液体培养基内培养，培养4-5天，用高速离散器，以10000r/min，匀浆1min既得菌悬液；

4)接种

在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入上述五龄桑蚕尾部或口器，按0.1-0.15毫升/只注入菌液；

5)子座的培育

将处理后的五龄桑蚕放于无菌的玻璃瓶或者大的玻璃平皿，挑选优质桑叶消毒后给蚕喂食饲养，20℃下保护至蛹体僵硬；然后将培养僵硬的蛹体置于15-25℃、空气相对湿度为85-95％的自然光照的无菌培养室中培养；

6)虫草的收集保存

子座成熟后，放在60℃环境下烘干1-5小时，置阴凉干燥处密封保存，或采用真空冷冻干燥后进行低温贮存。

实施例一：

(一)虫草菌菌株的筛选

1、菌种制作

选取高产、优质、早熟、原产于青藏高原的野生新鲜冬虫夏草子实体，用75％的酒精进行表面消毒，用无菌水清洗数次(一般5-6次)，将冬虫夏草中的虫体去掉，剩余部分放置于培养基中培养。待菌丝布满平板后再纯化。经反复纯化后获得数株母种。

将母种扩大培养后，置于以五龄桑蚕粉末作为氮源有机培养基上，于18℃-25℃下培养20-30d，观察生长情况，若见有杂菌污染，应对母种进一步纯化；若无杂菌污染，可继续培养，一个月后即有橙红色子实体产生，说明母种可靠。

将液体培养基分装于500ml三角瓶中，121℃，灭菌20分钟，将母种在无菌条件下用接种环接到三角瓶中。接种后置于18-22℃条件下，摇种培养6d左右，待形成均匀小球后用高速分散器高速10000r/min，处理1min既得菌悬液。

2、宿主准备

在无菌操作台内，将活体蛹用75％酒精消毒6-9分钟左右，用无菌水冲洗1分钟，晾干作宿主；

3、接种

在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入上述五龄桑蚕尾部或口器，按0.1-0.15毫升/只注入菌悬液；

4、子座的培育

将处理后的五龄桑蚕放于无菌的玻璃瓶或者大的玻璃平皿，20℃下保护至蛹体僵硬；然后将培养僵硬的蛹体置于15-25℃、空气相对湿度为85-95％的自然光照的无菌培养室中培养；

5、五龄桑蚕虫草的收集保存

子座成熟后，放在60℃环境下烘干1-5小时，置阴凉干燥处密封保存，或者为了防止高温破坏虫草中的部分营养物，可采用真空冷冻干燥后，低温贮存。

Claims (1)

1.一种以蚕蛹为载体培养人工虫草的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)虫草菌菌株的筛选

将原产于青藏高原的野生新鲜冬虫夏草菌株，先接种于蚕蛹粉末(去除表皮腊质)作为氮源平板生长，待菌丝体长满平板，反复筛选直至获得长势比较快、性状稳定的冬虫夏草纯菌株数株，以上述菌株作为本发明的目的菌株；

2)宿主准备

将家养柞蚕的茧去茧壳得活体蛹作为本发明的宿主，注意在去除茧时不破坏柞蚕的蛹；

3)菌悬液的制作

将筛选的虫草菌株接种于以蚕蛹粉末(去除表皮腊质)作为主要氮源制成的培养基平板上，置20℃下培养，待出现大量菌丝后，挑取一部分接种于上述液体培养基内培养，培养4-5天，用高速离散器，以10000r/min，匀浆1min既得菌悬液；

4)接种前蚕蛹准备

在无菌操作台内，将活体蛹用75％酒精消毒6-9分钟左右，用无菌水冲洗5-6次，晾干作宿主；

5)接种

在无菌操作台内，用无菌注射器吸取菌悬液注入上述蚕蛹尾部或口器，按0.1-0.15毫升/只注入菌液；

6)子座的培育

将处理后的蚕蛹放于无菌的玻璃瓶或者大的玻璃平皿，20℃下保护至蛹体僵硬；然后将培养僵硬的蛹体置于15-25℃、空气相对湿度为85-95％的自然光照的无菌培养室中培养；

7)蚕蛹虫草的收集保存

子座成熟后，放在60℃环境下烘干1-5小时，置阴凉干燥处密封保存，或采用真空冷冻干燥后进行低温贮存。