CN103651151A

CN103651151A - 一株促进沉香属植物产生沉香的真菌及其应用

Info

Publication number: CN103651151A
Application number: CN201310593250.6A
Authority: CN
Inventors: 魏建和; 陈旭玉; 杨云; 刘洋洋; 张争; 甘炳春; 苏智
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN103651151B

Abstract

本发明公开了一株促进沉香属（Aquilaria）植物产生沉香的真菌及其应用。该真菌为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01CGMCC NO.7802。拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01接种6个月后即可促进白木香结香且形成的沉香中间不易腐烂。并且该菌株在pH2-11和温度15-40℃的条件下仍能生长，说明拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01具有很强的环境耐受力。

Description

一株促进沉香属植物产生沉香的真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及微生物应用领域，具体涉及一株促进沉香属植物如白木香产生沉香的真菌及其应用，该菌株在pH2-11和温度15-40℃培养，其菌株、发酵液、除菌后的滤液、滤液中的活性成分及菌液/滤液浓缩制剂可促进沉香属植物结香。

背景技术

沉香为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）植物含有树脂的木材，沉香属植物包含13个种，最常见的有马来沉香（Aquilaria malaccensis）,越南沉香（Aquilaria crassna）和白木香（Aquilaria sinensis）。白木香是珍贵国产药材沉香的唯一植物资源，主产于我国的海南、广东、云南、广西等地。马来沉香（A.malaccensis）,越南沉香（A.crassna）主要产于印度尼西亚、马来西亚、越南、泰国等地。沉香自古以来就已经被公认为“香中之王”、“药中黄金”，具行气止痛，温中止呕，纳气平喘之功效。

沉香的形成非常特殊，健康的白木香不能产生沉香类物质，只有受到物理伤害、化学伤害及真菌侵染等外界的伤害后才诱导结香。质量高的沉香需要几年甚至几十年方能形成。由于天然沉香形成的特殊性及结香周期长，所以结香技术成为研究的热点。

目前，结香技术有砍伤法、断枝法、半断干法、打钉法、凿洞法、烫伤法、火烧法、火烙法、风吹法、雷击创伤发法、偏心灌注法、高压注射法、输液法、瓶插法、真菌接种法、签插法等。通过以上方法使沉香结香的促进剂有：①PH值1.5-3的甲酸或乙酸或者两者的混合，进一步与真菌注入；②植物激素（茉莉酸甲酯、乙烯利等）和钠盐、铁盐等输入白木香木质部；③氯化亚铁5％，甲酸钠5％，乙烯利2％，加水88％；④液态裂褶菌5-10％，葡萄糖或砂糖1.5-2％，乙酸或苹果酸0.5-1％，水85-95％；⑤亚硫酸氢钠0.5-3.0%，甲酸铵0.1-2.0%，酸性溶液0.1-2.0%，葡萄糖酸钠0.01-0.2%，余量为水；⑥微生物和钾盐溶液按体积比1:2-1:32组成；⑦吲哚丁酸钾1-20克、4％赤霉素1-20毫升、40％乙烯利1-50毫升、氯化钠（甲酸钠）1-50克、亚硫酸氢钠1-5克各配制成1000毫升溶液。或吲哚丁酸钾1-20克和甲酸钠1-50克配制成1000毫升溶液；或吲哚丁酸钾、乙烯和亚硫酸氢钠按比例混合，配制成1000毫升溶液。以上方法结合促进剂输入白木香树上均能促使沉香的形成。

很多学者认为真菌对沉香的形成发挥着重要的作用，并发现真菌能促进结香，但真菌结香技术一直未见广泛应用，所以寻找一种能提高沉香品质的菌株应用于生产有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的是解决沉香属（Aquilaria）植物如白木香结香问题，针对现有的技术，筛选一株具有优异的促进沉香属（Aquilaria）植物如白木香结香效果的真菌，并在生产上应用。本发明首次发现一株拟层孔菌（Fomitopsis sp.）菌株能促进沉香的形成并且形成的沉香中间不易腐烂，对沉香的产业化有着重要的意义，将其命名为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01。

本发明的拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01从白木香的结香层中分离获得，已于2013年6月24号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为：CGMCC NO.7802。

拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01在PDA培养基上的形态特征为：在PDA的培养基上，菌落白色，匀质状，边缘整齐；菌丝纤细，有叉状分枝，不易产孢。拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01，其rDNA的ITS长度为656bp，序列为序列表中序列1所示的核苷酸序列。

上述拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01在促进沉香属（Aquilaria）植物产生沉香中的应用也属于本发明的保护范围；所述沉香属（Aquilaria）植物为马来沉香（Aquilaria malaccensis）,越南沉香（Aquilaria crassna）或白木香（Aquilariasinensis）；优选为白木香（Aquilaria sinensis）。

在拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01促进沉香属（Aquilaria）植物产生沉香中的应用中，本发明利用拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株、发酵液、除菌的滤液及滤液中的活性成分促进结香，具体的技术方案为：将拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株、菌株发酵液、除菌的滤液及滤液中的活性成分接种到白木香根、茎或分枝上。所述接种方式为钻洞接种或通体结香技术接种方式。所述钻洞接种为在待接种的沉香属（Aquilaria）植物自根部到地上50cm-1m处部位钻洞，洞深至3-5cm，将上述接种拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌丝或发酵菌液注入洞中；所述通体结香技术接种：将接种拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01发酵菌液、或发酵液去除菌体后的滤液通过输液装置注入沉香属（Aquilaria）植物，利用植物的蒸腾作用疏导至植物茎干、枝条、根等各器官，促使整个植株内部结香。所述沉香属（Aquilaria）植物为马来沉香（Aquilaria malaccensis）,越南沉香（Aquilaria crassna）或白木香（Aquilaria sinensis）；优选为白木香（Aquilaria sinensis）。所述白木香的树龄为3年以上，优选为树龄为6年的白木香。

上述拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株、菌株发酵液、除菌的滤液、滤液中的活性成分和菌株发酵液或者滤液浓缩制剂作为促进白木香结香的结香剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种结香剂，其活性成分为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株、拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株发酵液或者拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株发酵液去除菌体后的菌液。

上述菌株发酵液的获得方法为将拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株接种于温度为15-40℃的液体培养基中培养,得到菌株发酵液。所述液体培养基的pH值可以为pH2-11；具体的培养基可以为液体PDA培养基，培养的时间可以为3-15天，培养的方式可以为摇床培养。培养的温度具体可以为35℃。

本发明的优点是：结香菌株拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01接种6个月后即可形成比较厚的沉香层并且中间不易腐烂。该菌株在PH2-11和温度15-40℃的条件下仍能生长，说明具有很强的环境耐受力。本发明首次发现菌株（Fomitopsis sp.）ASAF01能促进白木香结香且形成的沉香中间不易腐烂，对沉香的产业化有着重要的意义。

附图说明

图1为本发明的拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株促进沉香形成及真菌形态学特征观察；其中A为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）促进结香效果图；B为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）的菌落；C为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）菌丝形态。

图2为本发明的拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株的ITS序列PCR产物。

图3为本发明的拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株促进结香所产沉香的薄层鉴定；BK为健康的白木香，ST为色酮对照，CK为中国药典规定的对照药材，IW为ASAF01菌株接种6个月的沉香，EA为优等的野生沉香。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中所用的PDA液体培养基：称量去皮马铃薯200g,切成小块，加水煮30min,纱布过滤，加葡萄糖20g，最后定容至1L。固体PDA培养基为：称量去皮马铃薯200g,切成小块，加水煮30min,纱布过滤，加葡萄糖20g，加15-20g琼脂，最后定容至1L。

实施例1、拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株的分离、筛选和鉴定

本发明利用组织分离法进行菌株分离。具体方法如下所述：在海南省万宁市南药园采取天然的沉香样品，在水龙头下冲洗30min，然后用70%的酒精消毒3-5min,用无菌水冲洗3次，然后用10%（质量百分浓度）的次氯酸钠浸泡5min，再用无菌水冲洗3次，然后切成2mm-3mm的小段放在含有链霉素的培养基中，最后一次无菌水作对照。3d后每天检查并挑取菌株并纯化，直至2周。

将分离到的菌株在PDA液体培养基培养3-15d，接种真菌菌丝、或者利用通体结香技术输入发酵液、除菌滤液，含滤液中的活性成分的提取液对白木香进行筛选，发现有一株菌株接种6个月后木质部沉香层轮廓清晰可见（图1中A），将该菌株命名为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01。将这株能结香的菌株拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01在培养基上培养观察，菌落为圆形、白色、匀质状，边缘整齐（图1中B）。利用电子显微镜对其进行观察发现菌丝较纤细，叉状分支（图1中C）。由于该菌株不产孢，采用分子方法鉴定，提取ASAF01菌株DNA，以ITS1(5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物进行PCR扩增，PCR扩增结果如图2所示，克隆测序获得656bp的ITS序列，碱基序列如序列表中序列1所示。将获得的序列在Genbank数据库中进行Blast比对，结果显示其序列与Fomitopsis meliae（AccessionNo.HQ248221）同源性达97%，与Fomitopsis cf.meliae（AB540581；GQ982889；FJ372675；FJ372673.1）同源性达96%。通过形态特征和分子特征将其鉴定为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01。

拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01已于2013年6月24号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为：CGMCC NO.7802。

实施例2、拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株生长条件检测。

将拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01的菌丝接种于含有固体PDA培养基的培养皿中心，在分别设置为10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃的恒温箱中培养，结果发现，ASAF01在15℃至40℃条件均能生长，但35℃最适合生长。用0.1mol/L HCL和0.1mol/L NaOH调节PDA培养基的pH值，制成PH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的液体PDA培养基，将菌丝接种置于不同pH值的液体PDA培养基中，在35℃200转/分摇床培养，结果发现，菌株在PH2至PH11均能生长，最适pH值为7。

实施例3、拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01促进沉香产生效果验证

将拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株培养3-15d,得到菌株菌丝、发酵液，除菌滤液，根据树的大小按不同的剂量接种、钻洞或者利用通体结香技术将含菌体的发酵液，发酵液除去菌体的滤液接种白木香促进结香，具体接种方法如下：

1、接种材料的获得：拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株用液体培养基培养获得的菌丝，即为接种菌丝1。菌丝接种至PDA液体培养基中，在35℃200转/分摇培3-15天，得到培养液，即为菌液2。同时按照上述方法培养拟层孔菌（Fomitopsissp.）ASAF01菌株获得培养液后，过滤去除菌体，得到除菌滤液，即为滤液3。菌液或滤液喷雾浓缩得到的浓缩物，即为浓缩制剂4，菌株、菌液或滤液提取的主要成分，即为主成分5。

2、接种：以白木香（Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg）为接种对象进行接种，接种方法如下：1）钻洞接种：在6年树龄白木香的自根部到地上50cm处部位钻洞，洞深至3-5cm，将上述接种菌丝1或菌液2分别注入洞中；或者2）通体结香技术接种：在6年树龄的白木香上分别将菌液2、滤液3、浓缩制剂4或主成分5分别通过输液装置利用植物的蒸腾作用疏导至植物茎干、枝条、根等各器官，促使整个植株内部结香。结果表明，上述接种方式均可以使白木香结香。其中，以滤液3结合通体结香技术跟接种菌丝1、菌液2利用钻洞法接种相比，具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点。滤液3结合通体结香技术也比相同体积的菌液2、浓缩制剂4或主成分5结合通体结香技术所获得的沉香效果好。但是上述方法均可使白木香在六个月内结香。

上述接种操作6个月，将结香的白木香砍下，剖香，然后进行薄层鉴定。具体方法为：取上述方法获得的ASAF01菌株接种6个月获得的沉香样品粉末1g置于具塞三角瓶中，加甲醇25ml，超声处理60min，过滤，滤液定容至25ml，作为供试品溶液。野生沉香药材（中国药典规定的对照药材，购自中国药品检定研究院，批号：121222201102）的样品和优等的野生沉香（2012年购于海南沉香博览会）及健康白木香（茎部磨成粉末），制备方法同上分别作为对照药材溶液，取6,7-二甲氧基-2（2-苯乙基）色酮加甲醇配制成每毫升含0.05mg6,7-二甲氧基-2（2-苯乙基）色酮的色酮对照品溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和色酮对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙醚（v﹕v=10﹕1）为展开剂，展开两次，取出晾干，置紫外光灯（254nm和365nm）下检视，拍照。图3中的BK为健康的白木香，ST为色酮对照（6,7-二甲氧基-2（2-苯乙基）色酮加甲醇），CK为中国药典规定的对照药材，IW为ASAF01菌株接种（滤液3用通体结香技术输液的沉香）6个月的沉香，EA为优等的野生沉香。从图3中可知，ASAF01菌株接种6个月后可促进沉香的形成，且通过观察可知，用ASAF01菌株菌丝、菌液和去除菌体的过滤液用钻洞或者通体结香技术形成的沉香中间不腐烂。

Claims

1.拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.7802。

2.拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01CGMCC NO.7802在促进沉香属（Aquilaria）植物产生沉香中的应用。

3.拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株菌丝、菌株发酵液、发酵液除菌获得的滤液、滤液中的活性成分或菌株发酵液/滤液浓缩制剂作为促进沉香属（Aquilaria）、拟沉香属（Gyrinops）或其他诱导型植物结香的结香剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述菌株发酵液的获得方法为将拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株接种于温度为15-40℃的液体培养基中培养,得到菌株发酵液。

5.一种结香剂，其活性成分为拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌丝、拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株发酵液、拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株发酵液去除菌体后的滤液或菌株发酵液/滤液浓缩制剂。

6.根据权利要求5所述的结香剂，其特征在于，所述拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株发酵液的获得方法为将拟层孔菌（Fomitopsis sp.）ASAF01菌株接种于温度为15-40℃的液体培养基中摇床培养,得到菌株发酵液。

7.一种促进沉香属（Aquilaria）植物产沉香的方法，是将权利要求5或6所述的结香剂接种于沉香属（Aquilaria）植物根、茎和/或分枝上。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述接种的方法为钻洞接种或者通体结香技术接种。