CN106007980B - 一种沉香属植物结香的诱导剂及沉香生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种安全和高效的沉香生产方法，该方法先在沉香属植物的树干上钻孔，然后利用植物蒸腾拉力同时将真菌激发子——葡聚六糖和植物营养液输入沉香树体，处理3个月后割取树干中棕褐色油状物以及黄棕色变色木质部，晒干后即为沉香。真菌激发子和植物营养液构成的的结香液为天然成分，不添加任何激素、化学药物、人工香料等成分，安全可靠；结香3个月可以达到国家药典2015年版的沉香中药材标准，快速高效。该方法实现了安全和高效生产沉香，将产业化生产沉香变为现实。

Description

一种沉香属植物结香的诱导剂及沉香生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，公开了一种沉香属植物结香的诱导剂及沉香生产方法。
背景技术
沉香为瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria植物含有黑色树脂的木质部。沉香是我国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材和名贵的天然香料，其味辛、苦，性微温，能行气止痛、温中止呕、纳气平喘。目前沉香仍然是世界上最昂贵的香料之一，仅新加坡每年出口沉香的价值就超过12亿美元。国际市场需求极大，长期以来沉香属所有物种均遭到掠夺式砍伐，其原始林已经基本破坏殆尽，被列入了《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ。白木香A.sinensis为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一植物来源，现已被列为国家二级濒危保护植物。
国内外的研究认为，沉香的形成可能是树干受到伤害后被真菌侵染，真菌的代谢产物使木材薄壁细胞的淀粉粒发生生物化学变化，形成脂类，经多年沉积而形成沉香。国外学者从沉香属植物树体的结香部位分离到的真菌种类很多，包括砖红镰孢Fusariumlaseritum、青霉Penicillium spp.、曲霉Aspergillus spp.、毛霉Mucor spp.、色二孢菌Diplodia spp.、可球二孢菌Botryodiplodia theobromae、木霉Trichoderma spp.、裂褶菌Schizophyllum spp.、镰刀菌Fusarium spp.等。在国内，也有学者分离出黄绿墨耳菌Menanotus flavolives，并认为它与沉香形成有关，做了大量的实验支持其观点。但是这些传统的接菌结香有诸多缺陷，如1)菌种生长繁殖受环境影响大且极易死亡，造成结香效率和产量低；2)接菌结香操作复杂，费时费力；3)菌种生长缓慢造成沉香形成时间长，时间成本高。近年来，利用特定的真菌菌株作为激发子以提高植物细胞次生代谢产物的积累，在植物细胞悬浮培养中已取得了成功的应用并具有了商品化潜力。尤其对源于大豆大雄疫霉(Phytophthora megasperma f.sp.glycinea Kuan&Erwin)的寡聚半乳糖醛酸激发子的研究较为深入。该β连接的葡聚七糖激发子是能在DNA转录水平上调节特殊代谢、基因表达的分子，l0ng(10-8g)应用于1g植物组织即能产生足够的植保素，相当于1g寡糖激活剂可使1000t作物的组织产生足够量的植保素，迄今为止它是已发现植保素激发子中效率最高的。
发明内容
有鉴于传统接菌结香效果差、效率低、成本高等诸多缺点，本发明的目的在于提供一种安全、快速、高效和稳定的沉香生产方法，使得该方法生产的沉香能够达到国家药典2015年版的标准，实现了安全和高效生产沉香，将产业化生产沉香变为现实。
首先，本发明提供一种用于沉香属植物结香的诱导剂，其含有葡聚六糖、大量元素、微量元素和有机物。
其中，所述的葡聚六糖的浓度为10～1000pg/L。
其中，所述大量元素为100～200mg/L的磷酸二氢钾，100～200mg/L的氯化镁，300～600mg/L的硝酸钙，300～600mg/L的硝酸铵和800～1200mg/L的硫酸钾。
其中，所述微量元素为0.1～1.0mg/L的硫酸铜，0.1～1.0mg/L的钼酸钠，5～15mg/L的硼酸，5～15mg/L的硫酸锌，20～60mg/L的硫酸锰和20～60mg/L的乙二胺四乙酸铁(Ⅲ)钠。
其中，所述有机物为5～20mg/L的甘氨酸，50～150mg/L的肌醇、1000～3000mg/L的葡萄糖。本发明还提供一种沉香生产方法，在沉香属植物的树干上钻孔，然后利用植物蒸腾拉力将所述的用于沉香属植物结香的诱导剂注入所述沉香属植物树体中，然后封住孔洞，处理3～24个月后割取树干中棕褐色油状物以及黄棕色变色木质部，晒干后即为沉香。
其中，所述沉香属植物的树龄为3～30年、胸径至少5cm。
其中，钻孔深度至少2cm，至多为树木胸径的2/3。
本发明对钻孔数量不加限制，可以为一个，也可以为多个。
本发明调整现有沉香诱导剂的组分，用天然的真菌激发子(葡聚六糖)替代人工合成的植物激素(茉莉酸甲酯和乙烯利等)诱导沉香属植物启动防御反应，产生与植物防御有关的药用次生代谢产物，如倍半萜类和2-(2-苯乙基)色酮类具有抑菌活性的防御物质(药材沉香的主要化学成分)。首次将树木营养液(大量元素、微量元素和有机物)添加到沉香诱导剂中，这是因为其能够迅速补充树木所需的各种营养成分，改善树势，为沉香形成提供足够的营养成分。本发明所生产的沉香完全满足市场需求和要求，可用于大规模、标准化、商品化的生产，既可提高香农收入，又可保护野生沉香和白木香资源，具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
选取5年树龄，胸径大于10cm的白木香树，在距离地面5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深5cm的孔。配置质量百分浓度为10pg/L真菌激发子——葡聚六糖和植物营养液(0.1mg/L五水合硫酸铜、20mg/L乙二胺四乙酸铁(Ⅲ)钠、硼酸5.0mg/L、20mg/L一水合硫酸锰、0.1mg/L二水合钼酸钠、5.0mg/L七水合硫酸锌、300mg/L四水合硝酸钙、100mg/L磷酸二氢钾、800mg/L硫酸钾、100mg/L氯化镁、300mg/L硝酸铵、5mg/L甘氨酸、50mg/L肌醇、1000mg/L葡萄糖)溶液500ml，从钻孔通过植物蒸腾拉力输入白木香树体，输液完毕后用橡胶塞封住输液孔，防止沉香诱导剂流出和雨水冲刷。输液结束后数天内未观察到树叶掉落。输液结香处理3、6个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
对本实施例诱导生产的沉香随机挑选三份样品的醇浸出物进行了含量测定，同一批样品平行试验5次，得实验产出的沉香样品浸出物含量均高于10％，而且沉香四醇(C17H18O6)含量也均高于0.1％，达到药典要求水平。沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测结果显示得到提高。检测方法如下：
1)醇溶性浸出物含量检测：
割取的沉香参照2015年《中华人民共和国药典》所载醇溶性浸出物测定法项下的热浸法制取沉香油，并对所得沉香样品的醇溶性浸出物含量进行了测定。精密称取沉香药材粉末2.0g，置250ml的锥形瓶中，精密加入无水乙醇50ml，塞紧，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷，取下圆底烧瓶，塞紧，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，即得沉香油。精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，移至干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，以干燥品计算药材中醇溶性浸出物的含量(％)。
2)沉香油含量和沉香油中倍半萜含量检测：
沉香样品粉碎过26目筛，精密称取100g置于5000ml圆底烧瓶中，加入2500ml蒸馏水浸泡过夜。安装水蒸气蒸馏装置Clevenger，微沸提取12h。收集挥发油，加入适量无水硫酸钠，使用0.45μm的有机相微孔膜过滤器后即得挥发油。
将样品的挥发油进行GC-MS分析。仪器为美国瓦里安公司的Varian 450GC-300MS联用仪。色谱柱为石英毛细管柱VF-5MS，30m×0.25mm，膜厚0.25μm。
升温程序：从50℃开始以10℃/min升到155℃，保留15min；再以8℃/min升到280℃，保留10min.载气为He，柱流量1ml/min，进样量1μl。进样口温度为250℃，不分流。质谱条件：EI源；电离电压：70eV；离子源温度：250℃；全扫描范围：50～500amu。1μl的C8-C40正构烷烃混标以同样的方法进行检测。用峰面积归一化法计算出各峰化合物的相对百分含量，每个峰对应的RI指数根据AMDIS软件直接计算。各峰所得质谱通过检索NIST 08标准质谱图库、参考文献报道。再在NIST Chemistry WebBook(http://webbook.nist.gov/chemistry/)上比对相似度较高化合物的RI值，鉴定出倍半萜类化合物，计算总的倍半萜百分比含量。
3)沉香四醇(C17H18O6)含量测定
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇10ml，称定重量，浸泡0.5小时，超声处理(功率250W，频率40kHZ)1小时，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。参照2015年《中华人民共和国药典》所载高效液相色谱法(通则0512)测定。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入Waters高效液相色谱仪，采用Agilent-C18柱(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml；柱温为检测波长为252nm。理论板数按沉香四醇峰计算应不低于6000。
表1 梯度洗脱程序
对上述方法制备的沉香进行醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、挥发油含量、挥发油中倍半萜含量、沉香产量、醇溶性浸出物产量、沉香四醇产量、挥发油产量、总倍半萜产量进行测定，见下表。
表2 沉香质量检测
上表数据显示，本发明结香3个月的沉香达到国家药典2015年版的标准(醇溶性浸出物含量不低于10％和沉香四醇含量不低于0.1％)，醇溶性浸出物含量为14.7％和沉香四醇含量为0.16％，均远高于药典标准的47％和60％。与结香3个月相比较，结香6个月能够显著提高沉香的醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、挥发油含量、挥发油中倍半萜含量，可提高28.71～56.25％。
实施例2
选取10年树龄，胸径大于15cm的白木香树，在距离地面10cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深6cm的孔。配置质量百分浓度为100pg/L真菌激发子--葡聚六糖和植物营养液(0.5mg/L五水合硫酸铜、40mg/L乙二胺四乙酸铁(Ⅲ)钠、硼酸10.0mg/L、40mg/L一水合硫酸锰、0.5mg/L二水合钼酸钠、10.0mg/L七水合硫酸锌、450mg/L四水合硝酸钙、150mg/L磷酸二氢钾、1000mg/L硫酸钾、150mg/L氯化镁、40mg/L硝酸铵、15mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、1500mg/L葡萄糖)溶液500ml，从钻孔通过植物蒸腾拉力输入白木香树体，输液完毕后用橡胶塞封住输液孔，防止沉香诱导剂流出和雨水冲刷。输液结束后数天内未观察到树叶掉落。输液结香处理3和6个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(C17H18O6)含量测定方法同实施例1。
表3 沉香质量检测
上表数据显示，本发明结香3个月的沉香达到国家药典2015年版的标准(醇溶性浸出物含量不低于10％和沉香四醇含量不低于0.1％)，醇溶性浸出物含量为15.96％和沉香四醇含量为0.23％，均远高于药典标准的64.4％和130.00％。与结香3个月相比较，结香6个月能够显著提高沉香的醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、挥发油含量、挥发油中倍半萜含量，可提高15.38～39.13％。
实施例3
选取8年树龄，胸径大于13cm的白木香树，在距离地面10cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深5cm的孔。配置质量百分浓度为1000pg/L真菌激发子--葡聚六糖和植物营养液(1.0mg/L五水合硫酸铜、60mg/L乙二胺四乙酸铁(Ⅲ)钠、硼酸15.0mg/L、60mg/L一水合硫酸锰、1.0mg/L二水合钼酸钠、15.0mg/L七水合硫酸锌、600mg/L四水合硝酸钙、200mg/L磷酸二氢钾、1200mg/L硫酸钾、200mg/L氯化镁、600mg/L硝酸铵、20mg/L甘氨酸、150mg/L肌醇、2000mg/L葡萄糖)溶液500ml，从钻孔通过植物蒸腾拉力输入白木香树体，输液完毕后用橡胶塞封住输液孔，防止沉香诱导剂流出和雨水冲刷。输液结束后数天内未观察到树叶掉落。输液结香处理3、6个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(C17H18O6)含量测定方法同实施例1。
表4 沉香质量检测
上表数据显示，本发明结香3个月的沉香达到国家药典2015年版的标准(醇溶性浸出物含量不低于10％和沉香四醇含量不低于0.1％)，醇溶性浸出物含量为16.44％和沉香四醇含量为0.21％，均远高于药典标准的64.4％和110.00％。与结香3个月相比较，结香6个月能够显著提高沉香的醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、挥发油含量、挥发油中倍半萜含量，可提高23.84～38.10％。
对比例1
选取6年树龄，胸径大于10cm的白木香树，在距离地面5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深5cm的孔。配置质量百分浓度为植物营养液(0.5mg/L五水合硫酸铜、50mg/L乙二胺四乙酸铁(Ⅲ)钠、硼酸5.0mg/L、30mg/L一水合硫酸锰、0.5mg/L二水合钼酸钠、10.0mg/L七水合硫酸锌、600mg/L四水合硝酸钙、200mg/L磷酸二氢钾、1200mg/L硫酸钾、300mg/L氯化镁、500mg/L硝酸铵、20mg/L甘氨酸、150mg/L肌醇、1000mg/L葡萄糖)溶液500ml，从钻孔通过植物蒸腾拉力输入白木香树体，输液完毕后用橡胶塞封住输液孔，防止沉香诱导剂流出和雨水冲刷。输液结束后数天内未观察到树叶掉落。输液结香处理3和6个月后，割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(C17H18O6)含量测定方法同实施例1。
表5 沉香质量检测
上表数据显示，未添加激发子的结香方法生产的3个月沉香未能达到国家药典2015年版的标准(醇溶性浸出物含量不低于10％和沉香四醇含量不低于0.1％)，醇溶性浸出物含量仅为9.48％和沉香四醇含量为0.07％，均低于国家药典沉香药材标准。与结香3个月相比较，结香6个月仅仅达到但未显著高于国家药典2015年版的标准。
对比例2
参照申请号201310150138.5“一种生产沉香的方法”专利实施例1方法实施。选取5年树龄，胸径大于10cm的白木香树，在距离地面5cm处，垂直树干使用普通电钻，钻头直径为0.6cm，钻2个深5cm的孔。配制含0.1％的茉莉酸甲酯、0.5％的NaCl和0.3％的苯乙醇溶液500ml，将其缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止沉香药剂流出和雨水冲刷。3天后白木香树部分叶子掉落。每1个月滴加一次，3个月后割取创伤周围形成的棕褐色油状物及黄褐色的变色木质部，经晒干后得到沉香。
醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(C17H18O6)含量测定方法同上。
表6 沉香质量检测
上表数据显示，对照方法结香3个月的沉香未能达到国家药典2015年版的标准(醇溶性浸出物含量不低于10％和沉香四醇含量不低于0.1％)，其沉香四醇含量仅为0.09％，低于国家药典沉香药材标准。与结香3个月相比较，结香6个月仅仅达到但未显著高于国家药典2015年版的标准。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于沉香属植物结香的诱导剂，其含有葡聚六糖、大量元素、微量元素和有机物，所述的葡聚六糖的浓度为10～1000pg/L，所述大量元素为100～200mg/L的磷酸二氢钾，100～200mg/L的氯化镁，300～600mg/L的硝酸钙，300～600mg/L的硝酸铵和800～1200mg/L的硫酸钾，所述微量元素为0.1～1.0mg/L的硫酸铜，0.1～1.0mg/L的钼酸钠，5～15mg/L的硼酸，5～15mg/L的硫酸锌，20～60mg/L的硫酸锰和20～60mg/L的乙二胺四乙酸铁（Ⅲ）钠，所述有机物为5～20mg/L的甘氨酸，50～150mg/L的肌醇、1000～3000mg/L的葡萄糖。
2.一种沉香生产方法，其特征在于，在沉香属植物的树干上钻孔，然后利用植物蒸腾拉力将权利要求1所述的用于沉香属植物结香的诱导剂注入所述沉香属植物树体中，然后封住孔洞，处理3-24个月后割取树干中棕褐色油状物以及黄棕色变色木质部，晒干后即为沉香。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述沉香属植物的树龄为3-30年、胸径至少5cm。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，钻孔深度至少2cm，至多为树木胸径的2/3。
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