CN103283515A - 一种人工诱导血竭的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种人工诱导血竭的方法。该方法在龙血树属植物枝条底部上钻孔，用输液法或注射法将植物激素、无机盐，或者植物激素和无机盐的混合物输入龙血树属植物枝条中，然后封住孔洞，每1-2个月处理1次，处理6-24个月后，割取树干中形成的红色木质部，晒干即得血竭。本发明利用相适宜的植物激素和无机盐试剂刺激龙血树属植物枝条的防御系统，使其产生合成血竭化学成分的相关酶类，使得树干迅速产血竭中相关化学成分，经过积累，最终形成红色木质部，经采集晒干后得到血竭。与现有技术诱导的血竭相比，在同等诱导时间下，本发明诱导形成的血竭产量明显得到提高，具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。

Description

一种人工诱导血竭的方法
技术领域
本发明涉及制生物技术领域，具体涉及一种人工诱导血竭的方法。
背景技术
中药血竭(Dragon's blood)是龙血树属植物等基源植物受外界伤害后为抵御外界的进一步入侵而形成的深红色的树脂，富含黄酮类成分，是植物防卫素的一种。血竭为珍稀名贵中药，具活血化瘀、消肿止痛，收敛止血，生肌敛疮、补血之功效，常用于各种血症，《本草纲目》称之为“和血之圣药”。北非、西亚阿拉伯地区的龙血树(Dracaena.draco)、朱红龙血树(D.cinnabariBalf.f.)和索科特拉龙血树(D.surculosa Lindle.)等龙血树属植物是血竭最早的基源植物。东南亚地区如泰国、越南和柬埔寨产的龙血树属植物D.loureiriGagnep.也可形成血竭。在国内，目前发现该属两种植物剑叶龙血树[D.cochinchinensi(Lour.)S.C.Chen.]和海南龙血树(D.cambodiana Pierre exGagnep.)可形成血竭。我国中药和植物工作者发现，剑叶龙血树的树脂可作为血竭代用品，1991年被国家批准为一类新药(药材)，名为广西血竭。近年来，经植物和药物工作者的共同努力，并经初步医学临床证明：海南龙血树的树脂与进口血竭(麒麟竭)在药理和临床疗效上基本一致，可作为进口血竭的代用品。海南龙血树是国产血竭的另一新基源。现在我国有血竭生产企业十余家，以剑叶龙血树含脂木为原料生产的药物产值每年达5亿多元，全国药剂中含血竭成分的多达60多种。
国产血竭原料龙血树资源因多年来大量的采集应用，已日渐稀少。国内血竭原料年消耗量约600多吨，90%以上为从东南亚进口的剑叶龙血树野生药材，而国外野生资源也将枯竭。为此，急需开展国产血竭原料植物海南龙血树等植物的栽培和血竭的人工培育生产。研究表明，龙血树活体组织的主要成分为甾体皂苷类化合物，而血竭中的主要成分为黄酮类化合物。在自然界，血竭的形成是一个非常缓慢的过程，需要几年，甚至几十年的时间。因此，采用一些人工方法和技术，诱导血竭成分的产生，加快血竭的形成是海南龙血树栽培和血竭产业持续发展的关键。
国外未开展人工诱导血竭的研究，也无血竭原料植物的栽培生产。我国自上世纪90年代以来，分别以人工接菌法和植物激素诱导法对人工诱导血竭进行了初步探索，取得了很好的效果。其中，植物激素诱导法无需对微生物进行分离培养，因而比较方便。专利公开号CN101032207A公开了一种人工栽培龙血树诱导生产血竭的方法，其在三年生海南龙血树的两年生枝干上钻孔并注入诱导物6-BA，在枝干周围纵切纵沟，用脱脂棉吸湿诱导物6-BA后填充至纵沟中，再用透明塑料薄膜将整条枝干封住，待整条枝干变红后，将枝干整条截取，粉碎，提取，得血竭。
虽然上述专利技术大大缩短了血竭的形成时间，具有很大的实用价值，但是血竭产量仍需进一步提高，同时该技术在诱导过程中不但需要钻孔，还需要切沟等工序，较为繁琐。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人工诱导血竭的方法，使得该方法诱导的血竭能够提高血竭的产量。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种人工诱导血竭的方法，在龙血树属植物枝条底部上钻孔，用输液法或注射法将诱导剂输入龙血树属植物枝条中，然后封住孔洞。每1-2个月处理1次，处理6-24个月后，割取树干中形成的红色木质部，晒干即得血竭；
其中，所述诱导剂为植物激素、无机盐，或者植物激素和无机盐的混合物，所述植物激素为茉莉酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、6-BA中的一种或两种以上；所述无机盐为由下述任意阳离子和任意阴离子组成的一种或两种以上，但钙离子和硫酸根离子不能同时存在：
阳离子：钠离子、铁离子、亚铁离子、镁离子、钾离子、钙离子、锌离子和铝离子；
阴离子：氯离子、硫酸根、亚硫酸根、硝酸根和磷酸二氢根离子；
特殊的情况，当诱导剂仅为一种植物激素时，植物激素不能为6-BA。
在本发明的一些实施方案中，所述无机盐为：
⑴Na2SO4、AlCl3和KNO3；
⑵MgCl2和NaH2PO4；
⑶FeSO4、ZnCl2和NaNO3；
⑷Fe2(SO4)3和NaCl；
或者⑸CaCl2。
在一些实施方案中，所述植物激素的质量百分浓度为0.01-16%，在另外一些实施方案中为0.01-0.1%，在其余的实施方案中为0.01-0.05%，
在一些实施方案中，所述无机盐的质量百分浓度优选为0.1-20%，在另外一些实施方案中为0.1-10%，在其余的实施方案中为0.1-5%。
在一些实施方案中，所述龙血树属植物为树龄2年以上的龙血树属植物，比如海南龙血树（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.）、剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen.]、龙血树[Dracaena draco(L.)L.]、朱红龙血树（Dracaena cinnabari Balf.f.）、阿拉伯龙血树（Dracaenaschizantha）、索科特拉龙血树（Dracaena surculosa Lindle.）和Dracaena loureiriGagnep.；
在一些实施方案中，本发明所述钻孔深度为枝条直径的1/3-1/2，本发明对钻孔数量不加限制，可以为一个，也可以为多个。此外，每次处理输入的诱导剂优选为500mL。
由上述技术方案可知，本发明利用相适宜的植物激素和无机盐试剂刺激龙血树属植物枝条的防御系统，使其产生合成血竭化学成分的相关酶类，使得树干迅速产血竭中相关化学成分，经过积累，最终形成红色木质部，经采集晒干后得到血竭。与CN101032207A专利诱导的血竭相比，在同等诱导时间下，本发明诱导形成的血竭产量明显得到提高，缩短了血竭的生产周期，满足市场需求，还可用于大规模、标准化、商品化的生产，既可提高农民收入，又可保护野生龙血树资源，具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。
具体实施方式
本发明公开了一种人工诱导血竭的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明诱导形成的血竭，可按本技术领域常规提取方法进行提取，如专利CN101032207A公开的甲醇提取方法。
以下就本发明所提供的一种人工诱导血竭的方法做进一步说明。
实施例1：输液法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取2年树龄，枝条直径为4cm的海南龙血树（Dracaena cambodianaPierre ex Gagnep.），在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条中心。配制含0.1%的茉莉酸、0.1%的Na2SO4、0.1%的AlCl3和0.2%的KNO3的诱导剂500mL，用输液器将其缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。每1个月输入一次，6个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例2：输液法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取3年树龄，枝条直径为5cm的剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen.]，在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条直径的三分之一。配制含0.01%的6-BA、3%的MgCl2、1%的NaH2PO4的诱导剂500mL，用输液器将其缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。每2个月输入一次，12个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例3：注射法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取5年树龄，枝条直径为6cm的龙血树[Dracaena draco(L.)L.]，在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条中心。配制含0.01%的6-BA、15%的乙烯利和1%的茉莉酸甲酯的诱导剂500mL，用注射器将其缓慢注入钻孔，注射完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。每2个月注入一次，12个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例4：注射法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取5年树龄，枝条直径为6cm的朱红龙血树（Dracaena cinnabari Balf.f.），在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条中心。配制含1%的FeSO4、2%的ZnCl2和0.5%的NaNO3的诱导剂500mL，用注射器将其缓慢注入钻孔，注射完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。每2个月注入一次，24个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例5：输液法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取4年树龄的阿拉伯龙血树，枝条直径为5.5cm的海南龙血树（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.），在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条中心。配制含1%的Fe2(SO4)3、0.05%的茉莉酸甲酯、0.1%的NaCl的诱导剂500mL，将其缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。4天后海南龙血树部分叶子掉落。每2个月输入一次，24个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例6：输液法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取4年树龄的索科特拉龙血树，枝条直径为5.5cm的海南龙血树（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.），在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条中心。配制含30%的CaCl2的诱导剂500mL，将其缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。4天后海南龙血树部分叶子掉落。每2个月输入一次，24个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例7：输液法诱导血竭形成（%为质量百分数）
选取4年树龄，枝条直径为5.5cm的Dracaena loureiri Gagnep.，在枝条底端与枝条保持45度使用普通电钻转孔，钻头直径为0.6cm，钻孔深至枝条中心。配制含20%的乙烯利的诱导剂500mL，将其缓慢输入钻孔，输完后用橡胶塞封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。4天后海南龙血树部分叶子掉落。每2个月输入一次，24个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例8：对比例诱导血竭
选取4年树龄，枝条直径为5.5cm的海南龙血树（Dracaena cambodianaPierre ex Gagnep.），在枝条中间钻孔，钻孔深至枝条中心。分别配制含1.0mg/L的6-BA溶液，将6-BA溶液缓慢注入枝条的钻孔，用脱脂棉封住孔洞，防止药剂流出和雨水冲刷。再在枝条的四周纵切4条宽1cm、深至木质部，长40cm的纵沟，并用脱脂棉分别吸湿1.0mg/L的6-BA溶液，填充至纵沟内，然后用透明薄膜包扎，两头封口。4天后海南龙血树部分叶子掉落。分别于6、12、24个月后，割取枝条上红色木质部，晒干，即得血竭。
实施例9：本发明和对比例的血竭产量比较
采集实施例1-8所制备的人工血竭，称重。同时将形成血竭的整个枝条刮去树皮，将木质部称重。统计实施例1-8的血竭产量，结果见表1。
表1人工诱导血竭的产量
组别 诱导时间（月） 血竭重量（g） 占枝条木质部总重量（%）
实施例1 6 318 54
实施例2 12 683 71
实施例3 12 966 73
实施例4 24 1246 100
实施例5 24 956 100
实施例6 24 948 100
实施例7 24 968 100
实施例8 6 319 33
实施例8 12 471 48
实施例8 24 528 55
由表1可知，在相同诱导时间的前提下，按照本发明的方法诱导形成的血竭产量明显高于CN101032207A专利诱导的血竭（对比例，实施例8），同时还可以看出，在本发明诱导12个月的时候，血竭产量就已经超过了对比例诱导24个月的血竭产量，表明本发明所述方法不仅能够提高产量，而且还能缩短诱导时间。
实施例10：人工诱导血竭的质量评价
将实施例1-8诱导形成的人工血竭和天然血竭进行止血和活血化瘀活性的质量评价。其中，天然血竭采自海南省昌江黎族自治县霸王岭，形成时间至少10年。将天然血竭与人工血竭分别用95%乙醇提取后，减压浓缩至浸膏，得血竭提取物。
1、止血活性
测定人工诱导血竭和天然血竭提取物对小鼠断尾出血的影响。取小鼠90只，雌雄各半，随机分成九组，每组雌雄各半，灌胃给药，空白组给蒸馏水，阳性组给天然血竭，给药组给人工血竭（本发明实施例1-7所制备的血竭），对比组给现有技术人工诱导血竭（实施例8制备的血竭），每天一次，连续给药10d，于末次给药后1h，以利剪将小鼠尾尖1cm处横断,待血液自动溢出开始计时,每隔20s用滤纸吸去血滴一次，直至血液自然停止(滤纸吸时无血)为止，记录出血时间，与空白组比较，进行t检验和校正t检验，结果见表2。
表2血竭对小鼠断尾出血的影响（与空白对照相比，*P<0.001）
组别 剂量（g/Kg） 出血时间（min）
空白对照 0 4.50±0.98
天然血竭 3.5 2.31±0.39*
实施例1血竭 3.5 2.44±0.41*
实施例2血竭 3.5 2.31±0.18*
实施例3血竭 3.5 2.24±0.25*
实施例4血竭 3.5 2.29±0.31*
实施例5血竭 3.5 2.12±0.28*
实施例6血竭 3.5 2.19±0.25*
实施例7血竭 3.5 2.10±0.18*
对比血竭 3.5 2.26±0.21*
由表2可知，小鼠服用血竭后，其断尾出血时间和空白对照相比明显减少，和阳性对照天然血竭相当，表明上述方法制备的血竭外用具有止血的功效，与天然血竭质量等同。
2、活血化瘀
测定人工诱导血竭和天然血竭提取物对胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的影响。取小鼠100只，雌雄各半，随机分成十组，每组10只，雌雄各半，分别灌胃给药，空白组给相同体积的蒸馏水，阳性组给阿司匹林，给药组给人工血竭（本发明实施例1-7所制备的血竭），对比组给现有技术人工诱导血竭（实施例8制备的血竭），每天一次，连续给药5d，于末次给药后1h，每只小鼠尾静脉注射胶原蛋白(每只100μg)-肾上腺素(每只5μg)混悬液0.2ml，观察注射后5min内小鼠死亡数，计算存活率(即对血栓形成的保护率)，与空白组比较，比较各组存活率差异(表3)。
表3血竭对小鼠体内血栓形成的影响
组别 剂量（g/Kg） 存活率（%）
空白对照 0 0
阿司匹林 0.20 70
天然血竭 7.2 65
实施例1血竭 3.5 59
实施例2血竭 3.5 60
实施例3血竭 3.5 62
实施例4血竭 3.5 63
实施例5血竭 3.5 61
实施例6血竭 3.5 65
实施例7血竭 3.5 64
对比血竭 3.5 63
由表3可知，给药组小鼠的存活率明显高于空白对照组，接近阳性对照阿司匹林组。且人工诱导血竭组小鼠的存活率与天然血竭组在统计学意义上无显著差异，说明上述方法得到的人工诱导血竭的药效与天然血竭相当。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人工诱导血竭的方法，其特征在于，在龙血树属植物枝条底部上钻孔，用输液法或注射法将诱导剂输入龙血树属植物枝条中，然后封住孔洞，每1-2个月处理1次，处理6-24个月后，割取树干中形成的红色木质部，晒干即得血竭；
其中，所述诱导剂为植物激素、无机盐，或者植物激素和无机盐的混合物，所述植物激素为茉莉酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、6-BA中的一种或两种以上；所述无机盐为由下述任意阳离子和任意阴离子组成的一种或两种以上，但钙离子和硫酸根离子不能同时存在：
阳离子：钠离子、铁离子、亚铁离子、镁离子、钾离子、钙离子、锌离子和铝离子；
阴离子：氯离子、硫酸根、亚硫酸根、硝酸根和磷酸二氢根离子；
特殊的情况，当诱导剂仅为一种植物激素时，植物激素不能为6-BA。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述无机盐为：
⑴Na2SO4、AlCl3和KNO3；
⑵MgCl2和NaH2PO4；
⑶FeSO4、ZnCl2和NaNO3；
⑷Fe2(SO4)3和NaCl；
或者⑸CaCl2。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述植物激素的质量百分浓度为0.01-20%。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述无机盐的质量百分浓度为0.1-30%。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述龙血树属植物为树龄2年以上的龙血树属植物。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述龙血树属植物为海南龙血树、剑叶龙血树、龙血树、朱红龙血树、阿拉伯龙血树、索科特拉龙血树或Dracaena loureiri Gagnep.。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述钻孔深度为枝条直径的1/3-1/2。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导剂的用量为500mL/次。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述无机盐为由权利要求1中所述任意阳离子和任意阴离子组成的一种、两种或三种，但钙离子和硫酸根离子不能同时存在。
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