CN104611373A - 利用生物转化技术从丹参地上茎叶中高效制备丹参酚酸类成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法。本发明利用丹参地上茎叶，提取后经光合细菌包括沼泽红假单胞菌、绿硫红假单胞菌、球形红细菌、荚膜红细菌等进行生物转化，促使茎叶中丹酚酸类成分升高，尤其是活性成分丹酚酸B含量可为丹参根药材中含量的3~4倍，迷迭香酸则高于丹参药材数十倍；再经大孔吸附树脂柱分离纯化，可高效获得高含量的丹参酚酸B、丹参素、迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸类成分的提取物。本发明提供的丹酚酸类成分具有很好的抗氧化、保护血管内皮细胞以及活血化瘀功效，可用于制备防治心脑血管疾病药物或功能保健产品。

Description

利用生物转化技术从丹参地上茎叶中高效制备丹参酚酸类成分的方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，涉及一种丹参地上茎叶资源化利用方法，具体涉及一种从一定生长期的丹参地上茎叶经光合细菌转化后提取制备丹参酚酸类成分的方法及其制备得到丹参酚酸类成分和用途。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhizaBge.)为唇形科鼠尾草属植物。始载于《神农本草经》，列为上品。其根及根茎入药称为丹参，其味苦，性微寒，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效。现代临床多用于治疗心脑血管疾病、心绞痛等。

我国药用丹参资源丰富，包括野生丹参和栽培丹参，每年年产量达5000～7000t。但除根及根茎药用外，其地上茎叶、花等资源，并未得到产业化开发利用。目前虽有开展相关研究和开发的报道，但并未真正有效利用地上部分资源，因此丹参资源的综合高效利用逐渐引起广大科研工作者的关注和重视，

现代研究表明丹参中丹参酚酸类成分为其主要的活性成分，具有强心、抗血栓形成、改善微循环、促进组织的修复与再生、抑制过度增生、保肝、抗菌、降血脂等多种生物活性，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。

光合细菌(Photosynthetic bacteria，简称PSB)是一类以光作为能源进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的总称，其种类繁多，生长繁殖快速，酶系丰富。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris,Rps.Palustris)属于紫色非硫杆菌，它是一种适应能力很强的光合细菌，被应用于农业、渔业、环保、医药等领域。该属细菌一般为光能异养型，能利用有机酸、氨基酸及糖类作为光合作用的氢供体或合成细胞的碳源。PBS的生物转化反应条件温，处理法的流程工艺简单，处理成本低，能稳定运行，且不产生二次污染，因而有望成为生物法处理植物次生代谢产物的首选菌种之一。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题，是基于资源价值最大化原理，提供一种从一定生长期的丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法，其工艺新颖，流程简单，并可实现丹参地上茎叶的资源化利用，具有重要的应用价值和生态效益。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种丹参酚酸类成分，它由下列方法制备得到：

(1)取丹参地上茎叶作为原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液；

(2)取步骤(1)的提取液在无菌条件下，接种提取液1/10～1/20体积的光合细菌菌液，在400-3200LUX光照厌氧条件下培养3～20天，制成光合细菌转化丹参培养液，将光合细菌转化丹参培养液在1000-10000r/min离心；

(3)取步骤(2)离心上清液，上大孔吸附树脂柱进行吸附，先用水洗，然后采用不同浓度乙醇进行洗脱分离；

(4)收集步骤(3)体积浓度为20～70％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥，得到总丹参酚酸类成分。

作为优选方案，以上所述的丹参酚酸类成分，所述的光合细菌优选如下：红螺菌属Rhodospirillium为深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)；红假单胞菌属Rhodopseudomonas为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonasmarina)；红细菌属Rodobacter为球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。

本发明提供到从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其包括如下步骤：

(1)取丹参地上茎叶作为原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液；

(2)取步骤(1)的提取液在无菌条件下，接种提取液1/10～1/20体积的光合细菌菌液，在400-3200LUX光照厌氧条件下培养3～20天，制成光合细菌转化丹参培养液，将光合细菌转化丹参培养液在1000-10000r/min离心；

(3)取步骤(2)的上清液，上大孔吸附树脂柱进行吸附，先用水洗，然后采用不同浓度乙醇进行洗脱分离；

(4)收集体积浓度为20～70％乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥，得到总丹参酚酸类成分。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，所述的光合细菌优选如下：红螺菌属Rhodospirillium为深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)；红假单胞菌属Rhodopseudomonas为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)；红细菌属Rodobacter为球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，所采用的丹参地上茎叶为6月下旬～7月下旬生长期内的地上茎叶部分。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，步骤(2)所述的光合细菌菌液制备方法为：在经过灭菌的光合细菌培养基中接入1/10份数光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下，培养3-5天，作为光合细菌培养液。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，取丹参地上茎叶烘干后，打粉，过40目筛，取50～150g丹参茎叶的干燥粉末，分别置于1500ml的锥形瓶中，精密加入500～1000ml的纯水，精密称定，浸泡10～16h后在30～50℃、100～200KHz下超声30～60min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，得提取液，将溶液浓缩至干燥粉末。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，取一定的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定的含量，加入不同体积的水，无菌条件下，接种1/20体积的球形红细菌或荚膜红细菌菌液后培养3～5d，得球形红细菌或荚膜红细菌转化丹参培养液。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，所述的大孔吸附树脂型号为D101或AB-8。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，步骤(3)所述乙醇洗脱的体积浓度为10～95％。

作为优选方案，以上所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，步骤(4)中收集体积浓度为20％～70％到乙醇洗脱液。

本发明所述的从丹参地上茎叶提取制备丹参酚酸类成分的方法，步骤(1)所使用的丹参地上茎叶原料为一定生长期的丹参地上部分，也可以是采挖丹参前割取的废弃丹参地上植株。

本发明制备得到的丹参酚酸类成分，高效液相质量分析结果表明，总丹参酚酸纯度为80％以上，可用于制备治疗心脑血管疾病药物或功能保健产品。

本发明提供的从丹参地上茎叶中制备丹参酮类成分的方法，通过大量实验筛选，采用优选的光合细菌生物处理丹参地上茎叶，可以使所含丹参酚酸类有效成分大幅提高，再进行提取，提取液经大孔吸附树脂柱，分离纯化，乙醇洗脱，可以高效获得丹参酚酸类成分，取得了非常好的技术效果。

上述的从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，所述大孔吸附树脂洗脱溶剂为10％～95％乙醇溶液，收集20％～70％乙醇洗脱液。本发明根据有机溶剂萃取物的成分性质，采用大量实验筛选得到丹参酚酸类成分的最佳洗脱溶液，先采用浓度水洗脱除杂质，然后再收集20％～70％乙醇洗脱液，可以得到高纯度的丹参酚酸类成分。

上述的从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，所述喷雾干燥条件为：进风温度为40～80℃，出风温度为80～90℃，物料温度为30～50℃，雾化压力为0.05～0.2兆帕，喷雾速度为5～15ml/s。

上述的从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，制得的总丹参酚酸提取物纯度为80～95％。

有益效果:本发明与现有技术相比具有如下优点:

本发明利用丹参植物一定生长期或采挖丹参药材时割取的地上部分的丹参茎叶为原料(现有技术中一般作为废料丢弃)，采用优选的光合细菌生物转化技术和色谱技术相结合工艺，高效制备一种高纯度的总丹参酚酸提取物，该技术可促使茎叶中丹酚酸类成分升高，尤其是活性成分丹酚酸B含量可为丹参根药材中含量的3～4倍，迷迭香酸则高于丹参药材数10倍；再经大孔吸附树脂柱分离纯化，可高效获得高含量的丹参酚酸B、丹参素、迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸类成分，本发明可实现丹参地上部分的资源化利用，提升中药资源生产过程的资源利用效率，增加产业经济效益，减少环境污染，产生良好的生态效益。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，它包括以下步骤：

(1)取50g丹参地上茎叶的干燥粉末，置于1000ml的锥形瓶中，精密加入500ml的纯水，精密称定，浸泡16h后在30℃、100KHz下超声30min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，将溶液浓缩至干燥粉末。取适量的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定体积，无菌条件下，接种1/20体积的球形红细菌菌液后培养3～5d，得球形红细菌转化丹参培养液。

(2)将球形红细菌转化丹参培养液3000r/min离心，上清液过D101大孔吸附树脂柱，采用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇进行洗脱，收集30％～70％乙醇洗脱液，经减压浓缩，喷雾干燥即得总丹参酚酸提取物粉末，高效液相检测结果表明总丹参酚酸纯度为90.5％，其中丹酚酸B重量百分含量为20.35％，丹参素重量百分含量为4.93％，迷迭香酸重量百分含量为45.75％，阿魏酸重量百分含量为达5.11％，咖啡酸重量百分含量为达12.56％。

实施例2

从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，它包括以下步骤：

(1)取100g丹参地上茎叶的干燥粉末，置于1000ml的锥形瓶中，精密加入500ml的纯水，精密称定，浸泡10h后在30℃、100KHz下超声30min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，将溶液浓缩至干燥粉末。取适量的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定体积，无菌条件下，接种1/10体积的球形红细菌菌液后培养3～5d，得球形红细菌转化丹参培养液。

(2)将球形红细菌转化丹参培养液2000r/min离心，上清液过D101大孔吸附树脂柱，采用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇进行洗脱，收集50％～70％乙醇洗脱液，经减压浓缩，喷雾干燥即得总丹参酚酸提取物粉末，高效液相检测结果表明总丹参酚酸纯度为91.23％，其中丹酚酸B重量百分含量为21.35％，丹参素重量百分含量为4.56％，迷迭香酸重量百分含量为44.68％，阿魏酸重量百分含量为达6.24％，咖啡酸重量百分含量为达13.21％。

实施例3

从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，它包括以下步骤：

(1)取50g丹参地上茎叶的干燥粉末，置于1000ml的锥形瓶中，精密加入500ml的纯水，精密称定，浸泡15h后在30℃、100KHz下超声30min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，将溶液浓缩至干燥粉末。取适量的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定体积，无菌条件下，接种1/20体积的沼泽红假单胞菌菌液后培养3～5d，得沼泽红假单胞菌转化丹参培养液。

(2)将沼泽红假单胞菌转化丹参培养液2000r/min离心，上清液过D101大孔吸附树脂柱，采用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇进行洗脱，收集50％～70％乙醇洗脱液，经减压浓缩，喷雾干燥即得总丹参酚酸提取物粉末，高效液相检测结果表明总丹参酚酸纯度为95.78％，其中丹酚酸B重量百分含量为23.98％，丹参素重量百分含量为6.16％，迷迭香酸重量百分含量为47.45％，阿魏酸重量百分含量为达5.34％，咖啡酸重量百分含量为达13.17％。

实施例4

从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，它包括以下步骤：

(1)取100g丹参地上茎叶的干燥粉末，置于1000ml的锥形瓶中，精密加入500ml的纯水，精密称定，浸泡10h后在30℃、100KHz下超声30min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，将溶液浓缩至干燥粉末。取适量的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定体积，无菌条件下，接种1/15体积的绿硫红假单胞菌菌液后培养3～5d，得绿硫红假单胞菌转化丹参培养液。

(2)将绿硫红假单胞菌转化丹参培养液2000r/min离心，上清液过D101大孔吸附树脂柱，采用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇进行洗脱，收集30％～70％乙醇洗脱液，经减压浓缩，喷雾干燥即得总丹参酚酸提取物粉末，高效液相检测结果表明总丹参酚酸纯度为90.67％，其中丹酚酸B重量百分含量为20.12％，丹参素重量百分含量为5.32％，迷迭香酸重量百分含量为43.09％，阿魏酸重量百分含量为达6.08％，咖啡酸重量百分含量为达12.19％。

实施例5

从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，它包括以下步骤：

(1)取50g丹参地上茎叶的干燥粉末，置于1000ml的锥形瓶中，精密加入500ml的纯水，精密称定，浸泡10h后在30℃、100KHz下超声30min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，将溶液浓缩至干燥粉末。取适量的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定体积，无菌条件下，接种1/15体积的沼泽红假单胞菌菌液后培养3～5d，得沼泽红假单胞菌转化丹参培养液。

(2)将沼泽红假单胞菌转化丹参培养液3000r/min离心，上清液过AB-8大孔吸附树脂柱，采用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇进行洗脱，收集30％～70％乙醇洗脱液，经减压浓缩，喷雾干燥即得总丹参酚酸提取物粉末，高效液相检测结果表明总丹参酚酸纯度为86.78％，其中丹酚酸B重量百分含量为20.21％，丹参素重量百分含量为3.21％，迷迭香酸重量百分含量为42.40％，阿魏酸重量百分含量为达5.37％，咖啡酸重量百分含量为达12.78％。实施例6

从丹参地上茎叶中制备丹参酚酸类成分的方法中，它包括以下步骤：

(1)取50g丹参地上茎叶的干燥粉末，置于1000ml的锥形瓶中，精密加入500ml的纯水，精密称定，浸泡12h后在35℃、200KHz下超声60min，称量补足失重，过滤，重复提取三次，合并滤液，将溶液浓缩至干燥粉末。取适量的干燥粉末，用水溶解至一定的体积，过0.22μm膜，定容至一定体积，无菌条件下，接种1/10体积的荚膜红细菌菌液后培养5d，得荚膜红细菌转化丹参培养液。

(2)将荚膜红细菌转化丹参培养液3000r/min离心，上清液过AB-8大孔吸附树脂柱，采用水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇进行洗脱，收集30％～70％乙醇洗脱液，经减压浓缩，喷雾干燥即得总丹参酚酸提取物粉末，高效液相检测结果表明总丹参酚酸纯度为90.21％，其中丹酚酸B重量百分含量为21.11％，丹参素重量百分含量为3.35％，迷迭香酸重量百分含量为43.26％，阿魏酸重量百分含量为达5.65％，咖啡酸重量百分含量为达12.78％。

实施例7抗氧化效应研究

1实验试剂

FeSO4·7H2O、水杨酸、H₂O₂购买于无锡市亚盛化工有限公司；DPPH(1,1-di-phenyl-2-picryhydrazyl)购自于ALDRICH Chemistry，ABTS(2,2’-azinobis-3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid)，三吡啶三嗪(2,4,6-tripyridyl-s-triaz-ine，TPTZ)购自于sigma公司。

2实验方法

2.1DPPH清除率的测定

在96孔板中加入实施例1至6制备得到的的总丹参酚酸样品，稀释终浓度分别为50μg·ml-1、100μg·ml-1、200μg·ml-1、400μg·ml-1。加入溶于无水乙醇终浓度为0.05mg·ml-1DPPH溶液，避光反应30min后在517nm波长下测定其吸光度为A0。同时作空白对照，在517nm波长下测定其吸光度为A1。为扣除药物本底颜色对实验的影响，在加入终浓度分别为50μg·ml^-1、100μg·ml^-1、200μg·ml^-1、400μg·ml^-1的总丹参酚酸样品后加入无水乙醇在517nm波长下测定其吸光度A2。按照下列公式进行计算各样品对DPPH清除率(％)：A1-(A0-A2)/A1×100，计算IC50。

2.2ABTS清除率的测定

用去离子水将ABTS和K₂S₂O₈(过二硫酸钾)分别溶解并混合，使其终浓度分别为7mmol·L^-1和2mmol·L^-1，在室温、避光条件下静置12～16h，得到ABTS储液。测定时用PBS(pH7.4)稀释到734nm处吸光度为0.7±0.02，-20℃保存备用。反应在96孔板中进行，200μL反应液中含有100μL不同浓度的实施例1至5制备得到的的总丹参酚酸样品(12.5、25、50和100μg·ml-1)或参比溶液、100μL的ABTS反应溶液。振荡摇匀，于室温下避光静置6min，测定溶液在734nm处的吸光值。A0为溶剂与ABTS反应溶液作用后的吸光度；A1为受试样品与ABTS反应液作用后的吸光度；A2为受试样品中未加ABTS反应溶液时的吸光度。计算ABTS自由基清除率(％)：A1-(A0-A2)/A1×100，计算IC50。

2.3FRAP法测定

用去离子水分别配置2mM的FeCl3和TPTZ(三吡啶三哑嗪)溶液，于实验前将两者按1:1体积比混合，混合液加入96孔板中，每孔100μL，然后加入不同浓度实施例1至5制备得到的的总丹参酚酸样品(25、50、100和200μg·ml^-1)，每孔100μL，设6个复孔，振荡均匀，在室温下静置30min，于593nm处测吸光度，OD值越高，表明还原Fe³⁺的能力越强。样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO₄的物质的量(mmol)表示，其标准方程为y＝14.65x-0.0081，R2＝0.992。

2.4OH·清除率的测定

在96孔板中加入终浓度为2.25mol·L^-1的FeSO4·7H2O的溶液和终浓度为2.25mol·L-1的水杨酸各50μl，加入终始浓度分别为50μg·ml^-1、100μg·ml^-1、200μg·ml^-1、400μg·ml^-1实施例1至5制备得到的的总丹参酚酸样品50μL后，加入终浓度为2.2mmol·L^-1H₂O₂，37℃水浴锅加热30min在536nm波长下测定其吸光度为A0。同时作空白对照，在536nm波长下测定其吸光度为A1。为扣除药物本底颜色对实验的影响，在同法加入FeSO₄·7H₂O、水杨酸和各样品各50μL后，加入50μL蒸馏水，37℃水浴锅加热30min后在536nm波长下测定其吸光度为A2。按照下列公式进行计算各样品对OH·清除率(％)：A1-(A0-A2)/A1×100，计算IC50。

3实验结果

3.1DPPH清除率的测定结果

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在无水乙醇中形成一种稳定的自由基，呈紫红色，且具有典型的特征吸收峰。当反应体系中存在抗氧化剂时，抗氧化剂提供氢原子和电子给DPPH自由基，生成无色产物，导致溶液的特征吸收峰下降，吸光值变小。在此反应中，体系颜色变得越浅表明所检测物质的抗氧化能力越强。结果表明，本发明实施例1至6制备得到的总丹参酚酸样品1-6(IC₅₀<0.2mg·ml^-1)具有强的清除DPPH的作用，结果见1。

表1 样品对DPPH自由基清除率实验结果

3.1.2ABTS清除率的测定结果

ABTS自由基清除法目前已被广泛应用于生物样品的总抗氧化能力的测定。在此反应体系中，ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS水溶性自由基。抗氧化剂与ABTS自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光值降低。溶液退色越明显则表明所检测物质的总抗氧化能力越强。结果表明，各样品(IC₅₀<30μg·ml^-1)具有较强的清除ABTS的作用，结果见表2。

表2 样品对ABTS自由基清除率实验结果

3.1.3FRAP法测定结果

Fe³⁺-三吡啶三嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出明显的蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱。结果表明，各样品的FRAP值较高，结果见表3。

表3 各样品的FRAP值结果

3.1.4OH·清除率的测定结果

结果表明，各样品对OH·均有一定的清除能力，但浓度剂量依赖不明显，其具体结果见表4。

表4 各样品对OH·自由基清除率实验结果

实施例7对H₂O₂诱导HUVEC损伤的保护作用

1实验试剂

过氧化氢(H₂O₂)购买于无锡市亚盛化工有限公司；人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)(南京中医药大学张旭教授馈赠)；RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)；胰蛋白酶(GIBCO，USA)；噻唑蓝(MTT)(GIBCO，USA)；小牛血清(杭州四季青公司)。

2实验方法

HUVEC细胞用含10％小牛血清DMEM培养液接种于75cm²的细胞培养瓶中，置CO₂培养箱培养，隔3天传代1次，取约覆盖瓶底80％即对数生长期细胞进行实验。用0.25％胰蛋白酶消化单层培养的HUVEC，用含10％小牛血清DMEM培养基制成单细胞悬液后，以5×10³个/孔的密度接种于96孔培养板，每组重复6孔，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养24h，加入终浓度分别为100μg·ml^-1，200μg·ml^-1，400μg·ml^-1的本发明实施例1至5制备得到的总丹参酚酸样品100μl和终浓度为200μmol·L^-1H₂O₂100μL，继续放置培养箱中培养4h，然后加入20μL的MTT，继续孵育4h后终止培养，弃去上清液，加入二甲基亚砜150μL振荡，置于37℃温箱中10min，待蓝色结晶完全溶解后，用酶标仪在490nm波长处测定吸光度(A值)，以A值代表细胞活性，同法重复3块培养板，取A值均值。

3实验结果

在100μg·ml^-1浓度下，本发明制备得到的总丹参酚酸样品对H₂O₂诱导HUVEC损伤具有明显的保护作用；在200μg·ml^-1浓度下，本发明制备得到的总丹参酚酸样品对H₂O₂诱导HUVEC损伤具有保护作用(与空白组相比*P<0.01)；在400μg·ml^-1浓度下，本发明制备得到的总丹参酚酸样品对H₂O₂诱导HUVEC损伤具有非常显著性的保护作用(与空白组相比*P<0.0001)，具有一定的剂量依赖关系。

通过以上实验结果表明，本发明通过优选方法制备得到的丹参酚酸类成分，纯度高，有效成分含量高，具有确切的抗氧化作用、抑制血小板聚集及抑制血栓形成等多种生物活性。

因此，由本发明制备得到的总丹参酚酸提取物具有良好抗氧化、保护血管内皮细胞以及活血化瘀效应，可作为制备治疗心脑血管疾病药物、保健食品。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种丹参酚酸类成分，其特征在于，它由下列方法制备得到：

（1）取丹参地上茎叶作为原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液；

（2）取步骤（1）的提取液在无菌条件下，接种提取液 1/10~1/20 体积的光合细菌菌液，在400-3200LUX光照厌氧条件下培养3～20天，制成光合细菌转化丹参培养液，将光合细菌转化丹参培养液在1000-10000r/min离心；

（3）取步骤（2）离心上清液，上大孔吸附树脂柱进行吸附，先用水洗，然后采用不同浓度乙醇进行洗脱分离；

（4）收集步骤（3）体积浓度为20~70%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥，得到总丹参酚酸类成分。

2.一种从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）取丹参地上茎叶作为原料，采用水或醇溶液提取，得到水或醇提取液；

（2）取步骤（1）的提取液在无菌条件下，接种提取液 1/10~1/20 体积的光合细菌菌液，在400-3200LUX光照厌氧条件下培养3～20天，制成光合细菌转化丹参培养液，将光合细菌转化丹参培养液在1000-10000r/min离心；

（3）取步骤（2）的上清液，上大孔吸附树脂柱进行吸附，先用水洗，然后采用不同浓度乙醇进行洗脱分离；

（4）收集体积浓度为20~70%乙醇洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥，得到总丹参酚酸类成分。

3.根据权利要求2所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，所采用的丹参地上茎叶为6月下旬~7月下旬生长期内的地上茎叶部分。

4.根据权利要求2所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，步骤（2）所述的光合细菌菌液制备方法为：在经过灭菌的光合细菌培养基中接入1/10份数光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下，培养3-5天，作为光合细菌种子培养液。

5.根据权利要求2至4任一项所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，步骤（2）采用光合细菌为红螺菌属、红假单胞菌属、红细菌属中的任意一株菌或它们的任意组合。

6.根据权利要求5所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，所述的红螺菌属为深红红螺菌；红假单胞菌属为沼泽红假单胞菌、绿色红假单胞菌、绿硫红假单胞菌、海洋红假单胞菌；红细菌属为球形红细菌、荚膜红细菌。

7.根据权利要求2所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂型号为D101或AB-8。

8.根据权利要求2所述的从丹参地上茎叶中提取制备丹参酚酸类成分的方法，其特征在于，步骤（3）所述乙醇洗脱的体积浓度为10~95%。

9.权利要求1所述的丹参酚酸类成分在制备治疗心脑血管疾病药物或功能保健产品中的应用。