CN107174598B - 一种丹参地上茎叶部分综合利用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参地上茎叶部分综合利用的方法，（1）丹参地上茎叶中总丹参酮、总酚酸和多糖的联合提取；（2）白黄小脆柄菇菌种活化、液体发酵种子液制备；（3）白黄小脆柄菇固态发酵药渣3产纤维素酶；（4）纤维素酶粗酶液的制备。本发明采用体积分数由高至低的单一乙醇溶液为溶剂，依次从丹参中联合提取总丹参酮、总酚酸和多糖，并将最终药渣提取纤维素酶，使得丹参中的有效成分得到了充分的利用。

Description

一种丹参地上茎叶部分综合利用的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及丹参地上茎叶部分中总丹参酮、总丹酚酸以及多糖的联合提取工艺以及利用提取有效成分剩下的丹参药渣发酵生产纤维素酶的方法。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)是双子叶唇形科植物，是最常用的活血化瘀中药之一，具有祛瘀止痛、养血安神的功效。传统药用部位为根，一般弃去地上茎叶部位，不仅浪费了大量资源，而且容易引起环境污染。研究表明，丹参茎叶中含有丰富的丹酚酸类、糖类等化学物质，以及少量的丹参酮类化合物，具有抗病毒、抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗氧化等生物活性。研究人员对丹参中的总丹参酮、总酚酸、多糖进行了提取、纯化和某些应用研究。徐艳等用采用回流提取及超声方法对丹参中的总丹参酮提取工艺进行研究研究；薛治浦等用乙醇溶液/超声辅助对丹参中的总酚酸提取工艺进行研究；包华音等用回流提取及超声方法研究了丹参多糖的提取工艺。但从丹参中联合提取总丹参酮、总酚酸和多糖工艺未见报道。
此外，药用植物丹参茎叶提取有效成分后其残渣通常被废弃，同样会造成极大的资源浪费及生态环境污染。实际上，丹参残渣中含有丰富的营养成分，如粗蛋白、纤维素等。
因此，目前亟需研究一种丹参地上茎叶综合利用的方法，为丹参的综合利用提供一条新途径。
发明内容
由于现有技术中的传统单一成分的提取工艺没有充分利用原料，本发明尝试采用体积分数由高至低的单一乙醇溶液为溶剂，依次从丹参中联合提取总丹参酮、总酚酸和多糖。由于超声波辅助提取法具有方便、快速、简单、安全、易于实现工业化等优点，本发明主要探讨超声波对丹参中总丹参酮、总丹酚酸和多糖联合提取的影响，并应用响应面法对超声波提取工艺进行优化，为进一步提高丹参有效成分的利用率提供科学依据。因此，本发明的目的是解决传统单一成分提取方法原料没有充分利用的问题，并解决中草药药渣污染环境的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种丹参地上茎叶部分综合利用的方法，包括以下步骤：
(1)丹参地上茎叶中总丹参酮、总酚酸和多糖的联合提取：
1)总丹参酮的提取：
将丹参地上茎叶进行粉碎，然后采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣1和含有总丹参酮的提取液；
其中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为85～89％，液料比为40～42：1，提取温度为48～52℃；
2)总酚酸的提取：
将药渣1采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣2和含有总酚酸的提取液；
其中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为40～45％，液料比为20～25：1，提取温度为40～45℃；
3)多糖的提取：
将药渣2采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣3和含有多糖的提取液；
(2)丹参内生白黄小脆柄菇菌株菌种活化、液体发酵种子液制备：
将白黄小脆柄菇接种于固体马铃薯综合培养基上进行活化，然后接种到液体培养基上，震荡培养后作为种子液；
(3)白黄小脆柄菇固态发酵药渣3产纤维素酶：
将药渣3过筛，加水，浸泡设定时间，灭菌冷却，制成固态发酵培养基；然后接种白黄小脆柄菇种子液后进行培养，用来提取纤维素酶；
(4)纤维素酶粗酶液的制备：
固态发酵培养结束后，将发酵培养物干燥、粉碎过筛，然后加入乙酸-乙酸钠缓冲液，在恒温35～40℃下提取1～1.5h，提取后的提取液经离心，得到上清液，即为粗酶液。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：
(1)本发明采用体积分数由高至低的单一乙醇溶液为溶剂，依次从丹参中联合提取总丹参酮、总酚酸和多糖，采用此顺序依次提取这三种有效成分，使得丹参中的有效成分得到了充分的利用，绿色环保，无污染，溶剂还可回收再用，节约成本。
(2)本发明采用体积分数由高至低的单一乙醇溶液为溶剂，研究摸索得到对提取率有重要影响的因素，筛选优化得到一组使得各个有效成分提取率均较高的工艺参数，包括乙醇的体积分数、液料比和温度。
(3)本发明采用了体积分数由高至低的单一乙醇溶液为溶剂联合超声波提取的方法，高效提取得到三种有效成分，相比于现有技术的提取工艺，该工艺简单、成本较低、提取率较高；与单一提取工艺相比，原料得到了充分利用，可大大提高原料利用率，可为丹参的工业化生产鉴定理论基础。
(4)本发明将丹参地上茎叶部分提取完总丹参酮、总丹酚酸以及多糖后剩下的残渣为底物，采用内生白黄小脆柄菇BDF15固态发酵生产纤维素酶，由于利用了合理的发酵工艺，使得粗酶液的活力较高，这不但具有一定的经济效益，还可以避免丹参残渣带来的环境污染，另外还可使丹参残渣成为纤维素酶生产的新来源，为丹参的综合利用提供一条新途径。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是丹参酮ⅡA对照品标准曲线。
图2a～图2d是因素间交互作用对总丹参酮提取率的影响图。其中，图2a.乙醇体积分数和温度的3D交互图；图2b.乙醇体积分数和温度的等高线图；图2c.液料比和温度的3D交互图；图2d.液料比和温度的等高线图。
图3是丹酚酸B对照品标准曲线。
图4a～图4b是乙醇体积分数和温度交互作用对总酚酸提取率的影响图。其中，图4a.乙醇体积分数和温度的3D交互图；图4b.乙醇体积分数和温度的等高线图。
图5是多糖样品测定中葡萄糖标准品标准曲线。
图6a～图6b是乙醇体积分数和温度交互作用对多糖提取率的影响图。其中，图6a.乙醇体积分数和温度的3D交互图；图6b.乙醇体积分数和温度的等高线图。
图7是纤维素酶测定中葡萄糖标准品标准曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中丹参茎叶有效成分的提取方法存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种丹参地上茎叶部分的综合利用方法，包括以下步骤：
一种丹参地上茎叶部分综合利用的方法，包括以下步骤：
(1)丹参地上茎叶中总丹参酮、总酚酸和多糖的联合提取：
1)总丹参酮的提取：
将丹参地上茎叶进行粉碎，然后采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣1和含有总丹参酮的提取液；
其中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为85～89％，液料比为40～42：1，提取温度为48～52℃；
2)总酚酸的提取：
将药渣1采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣2和含有总酚酸的提取液；
其中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为40～45％，液料比为20～25：1，提取温度为40～45℃；
3)多糖的提取：
将药渣2采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣3和含有多糖的提取液；
(2)白黄小脆柄菇菌种活化、液体发酵种子液制备：
将白黄小脆柄菇接种于固体马铃薯综合培养基上进行活化，然后接种到液体培养基上，震荡培养后作为种子液；
(3)白黄小脆柄菇固态发酵药渣3产纤维素酶：
将药渣3过筛，加水，浸泡设定时间，灭菌冷却，制成固态发酵培养基；然后接种白黄小脆柄菇种子液后进行培养，用来提取纤维素酶；
(4)纤维素酶粗酶液的制备：
固态发酵培养结束后，将发酵培养物干燥、粉碎过筛，然后加入乙酸-乙酸钠缓冲液，在恒温35～40℃下提取1～1.5h，提取后的提取液经离心，得到上清液，即为粗酶液。
步骤(1)中，三种物质的超声波提取的功率为220～250W，提取时间为30～40min。最优选的，所述超声波提取的功率为250W，提取时间为40min。
对于总丹参酮的提取：在本发明优选的技术方案中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为88％，液料比为40.8：1(液料比为乙醇溶液的体积/mL:物料的质量/g)，提取温度为50℃，采用此工艺参数提取的总丹参酮提取率最大，为0.72％。
对于总酚酸的提取：在本发明优选的技术方案中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为41.2％，液料比为20.2：1，提取温度为40.6℃，采用此工艺参数提取的总酚酸提取率最大，为3.8％。
对于多糖的提取：在本发明优选的技术方案中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为11.44％，液料比为43.2：1，提取温度为42.3℃，采用此工艺参数提取的多糖提取率最大，为3.06％。
总丹参酮的提取采用响应面法设定提取的变量参数，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次回归方程模型：Y＝0.71-0.014A+0.00625B-0.0025C+0.000AB-0.0075AC+0.013BC-0.039A2-0.039B2-0.047C2；
总酚酸的提取采用响应面法设定提取的变量参数，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次回归方程模型：
Y＝3.62+0.10A+0.018B+0.064C-0.053AB-0.090AC+0.042BC-0.41A2-0.38B2-0.42C2；
多糖的提取采用响应面法设定提取的变量参数，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次回归方程模型：
Y＝2.98+0.046A+0.14B+0.079C-0.025AB+0.14AC+0.000BC-0.24A2-0.21B2-0.21C2；
其中，Y为相应物质的提取率，A为乙醇溶液的体积分数，B为液料比，C为温度。
步骤(1)中得到含有相应有效成分的提取液后，再采用常规的纯化工艺即可得到该有效成分。
步骤(2)中，从提高粗酶液中纤维素酶的活性来讲，优选的，所述白黄小脆柄菇为白黄小脆柄菇(Psathyrella candolleana)BDF15，是从山东省泰安市泰山(海拔800m)采集健康无病症的白花丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba C.Y.Wu et H.W.Li)根中分离得到的，归属于伞菌目、鬼伞科、脆柄菇属。该菌株在专利105543106A中公开，于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No11415。
所述固体马铃薯综合培养基的组成为：马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，MgSO41.0g，蛋白陈5.0g，琼脂20g，水加至1000ml，自然pH。
优选的，活化时间为6～7天。
优选的，震荡培养的时间为3～5天。
步骤(3)中，优选的，过筛的目数为60目。
优选的，所述药渣3与水的添加量比例为1g：(1.5～2.5)mL；浸泡时间为6～12h。
优选的，接种白黄小脆柄菇种子液25～30℃培养2周。
步骤(4)中，优选的，粉碎过60目筛。
优选的，所述发酵培养物与乙酸-乙酸钠缓冲液的添加量比例为1g：(20～25)mL，所述乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为4.5～5。
优选的，在40℃恒温水浴中提取1h。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1:丹参地上茎叶中总丹参酮的提取工艺优化
1.1丹参酮ⅡA标准曲线
精密称取丹参酮ⅡA 10mg，置于50ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.2mg/ml的对照品溶液。精密量取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，以甲醇为空白，于269nm波长处分别测其吸光度。以对照品浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。
1.2响应面优化总丹参酮提取工艺
精密称量经粉碎、过60目筛的丹参茎叶4或5份，每份各0.5g，采用超声法进行提取总丹参酮；超声波提取的功率为250W，提取时间为40min。提取液经过滤、离心后用甲醇溶解定容至25ml，各取3ml，以甲醇为空白，在波长269nm处测定其吸光度，代入回归方程，计算每份样品中中总丹参酮的含量。采用由Box-Behnken试验设计，在单因素试验基础上选取乙醇体积分数、液料比、温度3个因素进行响应面分析，以丹参总酮提取率为响应值，试验结果见表1。提取总丹参酮剩下的滤渣(计作药渣1)。
表1 Box-Behnken试验方案设计与总酮提取率
Figure BDA0001325204210000061
Figure BDA0001325204210000071
对表1试验结果进行多元回归拟合，得丹参总酮提取率对乙醇体积分数(A)、液料比(B)和温度(C)的二次多项式回归模型：Y＝0.71-0.014A+0.00625B-0.0025C+0.000AB-0.0075AC+0.013BC-0.039A2-0.039B2-0.047C2，对回归模型进行方差分析和系数显著性检验，结果如表2所示。
表2回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验
Figure BDA0001325204210000072
由回归模型方差分析的结果可以看出，模型极显著，失拟项不显著，表明模型不失拟；同时该模型的相关系数R2＝0.9962，表明该模型实际试验拟合较好，所建立的回归二次模型成立，可用此模型来分析和预测超声波提取丹参总酮的工艺条件。从回归模型系数显著性检验结果可得知：乙醇体积分数、液料比一次项，乙醇体积分数、液料比和温度的二次项的P值均小于0.01，说明对提取丹参总酮得率的影响极显著，而乙醇体积分数和温度、液料比和温度的交互项P值小于0.01，说明对提取丹参总酮得率的影响极显著。响应面优化得到总酮的最佳提取工艺为乙醇体积分数88.23％、液料比40.8:1、温度49.98℃。为检验响应面法的可靠性，采用上述最佳条件进行验证性试验，结合实际操作条件，将最佳工艺条件修正为:乙醇溶液的体积分数为88％，液料比为40.8：1，提取温度为50℃，在此条件下进行3平行试验，总丹参酮提取率为0.72％，与理论预测值基本相符，说明回归方程能真实反映各因素对总丹参酮提取率的影响，优化结果可靠。
因素间交互影响见图2a，图2b，图2c，图2d。当乙醇体积分数固定时，随着温度的升高，丹参总酮提取率呈现先增加后减少的趋势。这是由于超声波对于丹参细胞壁的破碎需达到一定的温度，随着温度的升高，细胞壁破碎到一定程度，组织释放到反应体系中的总酮量随之增加。但超声温度的升高同时会使丹参有效成分受到破坏，故丹参总酮提取率呈现先升高后降低的趋势；同理当温度一定时，随着乙醇体积分数的增大，总酚酸提取率升高，但乙醇体积分数过高会使总酚酸提取率降低。同理液料比和温度也表现出相同的交互作用。
实施例2：丹参药渣1中总丹酚酸的提取工艺优化
2.1丹酚酸B标准曲线
分别精密量取0.2mg/ml丹酚酸B标准品品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置比色管中，精密加水至2.0mL，分别精密加入10％的亚硝酸钠0.5mL，摇匀，再分别精密加入10％硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，室温下暗处放5min，加入2mol/L氢氧化钠溶液6.0mL,摇匀,室温下暗处放置10min后，在500nm波长处测定OD值。以OD值(A)为纵坐标，丹酚酸B含量(X)为横坐标，绘制标准曲线(图3)。
2.2样品溶液测定
药渣1(0.5g)在不同乙醇体积分数、液料比、温度、时间下超声提取一定时间，超声波提取的功率为250W，提取时间为40min，提取液经过滤、离心后用水定容至25ml。各取2ml，按丹酚酸B标准曲线的方法显色，在波长500nm处测定其吸光度，代入回归方程，计算每份中总酚酸的含量。由Box-Behnken试验设计，在单因素试验基础上选取乙醇体积分数、液料比、温度3个因素进行响应面分析，以丹参总酚酸提取率为响应值，试验结果见表3。提取总酚酸剩下的滤渣(计作药渣2)。
表3 Box-Behnken试验方案设计与总酚酸提取率
Figure BDA0001325204210000091
对表3试验结果进行多元回归拟合，得丹参总酚酸提取率二次多项式回归模型：Y＝3.62+0.10A+0.018B+0.064C-0.053AB-0.090AC+0.042BC-0.41A2-0.38B2-0.42C2对回归模型进行方差分析和系数显著性检验，结果如表4所示。
表4回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验
Figure BDA0001325204210000092
Figure BDA0001325204210000101
由回归模型方差分析的结果可以看出，模型极显著，失拟项不显著，表明模型不失拟；同时该模型的相关系数R2＝0.9862，表明该模型实际试验拟合较好，所建立的回归二次模型成立，可用此模型来分析和预测超声波提取丹参总酚酸的工艺条件。从回归模型系数显著性检验结果可得知：乙醇体积分数一次项，乙醇体积分数、液料比、温度的二次项的P值均小于0.01，说明对提取丹参总酚酸得率的影响极显著，而温度一次项、乙醇体积分数和温度的交互项P值小于0.05，说明对提取丹参总酚酸得率的影响显著。响应面优化得到总酚酸的最佳提取工艺为乙醇体积分数41.17％、液料比20.19:1、温度40.64℃。为检验响应面法的可靠性，采用上述最佳条件进行验证性试验，结合实际操作条件，将最佳工艺条件修正为:乙醇溶液的体积分数为41.2％，液料比为20.2：1，提取温度为40.6℃，在此条件下进行3平行试验，总丹酚酸提取率为3.8％，与理论预测值基本相符，说明回归方程能真实反映各因素对总丹酚酸提取率的影响，优化结果可靠。
乙醇体积分数和温度的交互作用见图4a，图4b。在当乙醇体积分数固定时，随着温度的升高，丹参总酚酸提取率呈现先增加后减少的趋势。这可能是由于超声波对于丹参细胞壁的破碎需达到一定的温度，随着温度的升高，细胞壁破碎到一定程度，组织释放到反应体系中的总酚酸量随之增加。但超声温度的升高同时会使丹参有效成分受到破坏，故丹参酚酸提取率呈现先升高后降低的趋势；同理当温度一定时，随着乙醇体积分数的增大，总酚酸提取率升高，但乙醇体积分数过高会使总酚酸提取率降低。
实施例3：丹参药渣2中多糖的提取工艺优化
3.1葡萄糖标准曲线
精确称取105℃干至质量恒定的葡萄糖标准品10mg，用蒸馏水定容至50ml容量瓶，摇匀，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于干燥试管，分别加水至1.0ml，再分别加入1.0ml的5％苯酚溶液，再加5.0ml浓硫酸混合均匀后40℃水浴30min，取出后室温冷却15min，在485nm波长处测定吸光度，以蒸馏水按照同样显色操作为空白，绘制标准曲线(图5)。
3.2响应面优化多糖提取工艺
药渣2(0.5g)在不同乙醇体积分数、液料比、温度、时间下超声提取一定时间提取液过滤后离心，超声波提取的功率为250W，提取时间为40min，用水溶解定容至25ml，摇匀，即为供试品溶液。各取1ml，按葡萄糖标准曲线的方法显色，在波长485nm处测定其吸光度，代入回归方程，计算每份中多糖的含量。由Box-Behnken试验设计，在单因素试验基础上选取乙醇体积分数、液料比、温度3个因素进行响应面分析，以丹参多糖提取率为响应值，试验结果见表5。提取多糖剩下的滤渣(计作药渣3)。
表5 Box-Behnken试验方案设计与丹参多糖提取率
Figure BDA0001325204210000111
Figure BDA0001325204210000121
对表5结果进行回归分析，得丹参多糖提取率的二次多项式回归模型：Y＝2.98+0.046A+0.14B+0.079C-0.025AB+0.14AC+0.000BC-0.24A2-0.21B2-0.21C2.对回归模型进行方差分析和系数显著性检验，结果如表6所示。
表6回归模型的方差分析及回归系数的显著性检验
Figure BDA0001325204210000122
由回归模型方差分析的结果可以看出，模型极显著，失拟项不显著，表明模型不失拟；同时该模型的相关系数R2＝0.9390，表明该模型实际试验拟合较好，所建立的回归二次模型成立，可用此模型来分析和预测超声波提取丹参多糖的工艺条件。从回归模型系数显著性检验结果可得知：液料比一次项，乙醇体积分数、液料比、温度的二次项的P值均小于0.01，说明对提取丹参多糖得率的影响极显著，而乙醇体积分数和温度的交互项P值小于0.05，说明对提取丹参多糖得率的影响显著。响应面优化得到多糖的最佳提取工艺为乙醇体积分数11.44％、液料比43.19:1、温度42.31℃。为检验响应面法的可靠性，采用上述最佳条件进行验证性试验，结合实际操作条件，将最佳工艺条件修正为:乙醇溶液的体积分数为11.4％，液料比为43.2：1，提取温度为42.3℃，在此条件下进行3平行试验，多糖提取率为3.06％，与理论预测值基本相符，说明回归方程能真实反映各因素对多糖提取率的影响，优化结果可靠。
由图6可知，在当乙醇体积分数固定时，随着温度的升高，丹参多糖提取率呈现先增加后减少的趋势。这可能是由于超声波对于丹参细胞壁的破碎需达到一定的温度，随着温度的升高，细胞壁破碎到一定程度，组织释放到反应体系中的多糖量随之增加。但超声温度的升高同时会使丹参有效成分受到破坏，故丹参多糖提取率呈现先升高后降低的趋势；同理当温度一定时，随着乙醇体积分数的增大，多糖提取率升高，但乙醇体积分数过高会使多糖提取率降低。
实施例4：丹参内生白黄小脆柄菇BDF15固态发酵药渣3产纤维素酶
4.1白黄小脆柄菇BDF15固态发酵粗酶液的制备
将BDF15接种于马铃薯综合培养基(马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，M gSO41.0g，蛋白陈5.0g，琼脂20g，水加至1000ml，自然pH)上活化7天后。接种到液体培养基，摇床震荡培养3d，做为种子液。
取4.0g经过60目筛的丹参残渣，加入8毫升水，pH值自然，浸泡过夜，经121℃灭菌30min后冷却，制成固态发酵培养基。接种白黄小脆柄菇BDF15种子液后，28℃培养2周左右。将发酵培养物烘干、粉碎过60目筛，准确称取发酵培养物1.000g，分别加25ml pH4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，并于40℃恒温水浴中提取1h，提取液经8 000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
本发明所采用的真菌菌株，除了采用白黄小脆柄菇BDF15，也可以采用其他能产纤维素酶的真菌。
4.2 CMC酶活的测定
将菌种按照固态发酵14天后，向比色管中加入2.0ml 0.2mol/L pH＝4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液和2.0ml 5％CMC，然后加0.5mL粗酶液，50℃处理30min之后，加入2.5ml DNS试剂进行显色，沸水浴5min，经流水冷却后定容至25ml，摇匀，以不加酶液为空白对照，在波长540nm处测定吸光度，带入标准曲线(图7)计算CMC酶活性为132.6IU/g。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种对丹参地上茎叶部分进行有效成分提取制备的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)丹参地上茎叶中总丹参酮、总酚酸和多糖的联合提取：
1)总丹参酮的提取：
将丹参地上茎叶进行粉碎，然后采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣1和含有总丹参酮的提取液；
其中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为85～89％，液料比为40～42：1，提取温度为48～52℃；
2)总酚酸的提取：
将药渣1采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣2和含有总酚酸的提取液；
其中，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为40～45％，液料比为20～25：1，提取温度为40～45℃；
3)多糖的提取：
将药渣2采用乙醇溶液进行超声波提取，提取后固液分离，得到药渣3和含有多糖的提取液；
(2)白黄小脆柄菇菌种活化、液体发酵种子液制备：
将白黄小脆柄菇接种于固体马铃薯综合培养基上进行活化，然后接种到液体培养基上，震荡培养后作为种子液；
(3)白黄小脆柄菇固态发酵药渣3产纤维素酶：
将药渣3过筛，加水，浸泡设定时间，灭菌冷却，制成固态发酵培养基；然后接种白黄小脆柄菇种子液后进行培养，用来提取纤维素酶；
(4)纤维素酶粗酶液的制备：
固态发酵培养结束后，将发酵培养物干燥、粉碎过筛，然后加入乙酸-乙酸钠缓冲液，在恒温35～40℃下提取1～1.5h，提取后的提取液经离心，得到上清液，即为粗酶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，三种物质的超声波提取的功率为220～250W，提取时间为30～40min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，所述超声波提取的功率为250W，提取时间为40min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，对于总丹参酮的提取，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为88％，液料比为40.8：1，提取温度为50℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，对于总酚酸的提取，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为41.2％，液料比为20.2：1，提取温度为40.6℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，对于多糖的提取，提取的工艺参数为：乙醇溶液的体积分数为11.44％，液料比为43.2：1，提取温度为42.3℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中，总丹参酮的提取采用响应面法设定提取的变量参数，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次回归方程模型：Y＝0.71-0.014A+0.00625B-0.0025C+0.000AB-0.0075AC+0.013BC-0.039A2-0.039B2-0.047C2；
总酚酸的提取采用响应面法设定提取的变量参数，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次回归方程模型：
Y＝3.62+0.10A+0.018B+0.064C-0.053AB-0.090AC+0.042BC-0.41A2-0.38B2-0.42C2；
多糖的提取采用响应面法设定提取的变量参数，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次回归方程模型：
Y＝2.98+0.046A+0.14B+0.079C-0.025AB+0.14AC+0.000BC-0.24A2-0.21B2-0.21C2；
其中，Y为相应物质的提取率，A为乙醇溶液的体积分数，B为液料比，C为温度。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(2)中，活化时间为6～7天；震荡培养的时间为3～5天。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中，所述药渣3与水的添加量比例为1g：1.5～2.5mL；浸泡时间为6～12h；
接种白黄小脆柄菇种子液25～30℃培养2周。
10.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(4)中，所述发酵培养物与乙酸-乙酸钠缓冲液的添加量比例为1g：20～25mL，所述乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为4.5～5。
11.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(4)中，在40℃恒温水浴中提取1h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110024696B (zh) * 2019-03-08 2021-02-02 浙江工业大学 黄盖小脆柄菇及在制备天然抑菌剂中的应用
CN110352659A (zh) * 2019-07-22 2019-10-22 贵州大学 一种假鬼伞属真菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用
TWI763189B (zh) * 2020-12-16 2022-05-01 興藝峰生技農業股份有限公司 丹參萃取物於製備治療或減輕乾眼症的食品之用途及其製備方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100827938B1 (ko) * 2006-05-25 2008-05-08 원광대학교산학협력단 단삼 정제 추출물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및치료용 조성물
CN104003866A (zh) * 2013-12-20 2014-08-27 湖北文理学院 超微细化联合固态发酵提取丹参素的生产方法
CN104611373A (zh) * 2015-02-10 2015-05-13 南京中医药大学 利用生物转化技术从丹参地上茎叶中高效制备丹参酚酸类成分的方法
CN105535100A (zh) * 2016-01-11 2016-05-04 泰山医学院 一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7384657B2 (en) * 2004-10-14 2008-06-10 Jeffrey Young Composition of natural herb extract for treating cardiovascular disease and its method of preparation thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100827938B1 (ko) * 2006-05-25 2008-05-08 원광대학교산학협력단 단삼 정제 추출물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및치료용 조성물
CN104003866A (zh) * 2013-12-20 2014-08-27 湖北文理学院 超微细化联合固态发酵提取丹参素的生产方法
CN104611373A (zh) * 2015-02-10 2015-05-13 南京中医药大学 利用生物转化技术从丹参地上茎叶中高效制备丹参酚酸类成分的方法
CN105535100A (zh) * 2016-01-11 2016-05-04 泰山医学院 一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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"响应面法优化丹参药渣多糖提取工艺及其抗氧化活性研究";刘佳妮等;《时珍国医国药》;20170228(第2期);全文 *

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