CN105535100A - 一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，其特征是：包括复合酶提取和水浸提，所述复合酶为白黄小脆柄菇(Psathyrella？candolleana)BDF15发酵产生的粗酶液，所述白黄小脆柄菇(Psathyrella？candolleana)BDF15已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC？No.11415。本发明的提取方法可有效地促进丹参茎叶中酚酸类成分的释放，提高提取率，降低生产成本；并且本发明生产过程中不产生有害物质，无污染，产品质量好，功效强，同时还综合利用中药废弃物，变废为宝，是一种环境友好的绿色提取方法。

Description

一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，尤其涉及一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法。
背景技术
丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)系唇形科鼠尾草属植物，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦、治疗心血管疾病等功效。丹参主要活性物质为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类。由于丹参多以根入药，丹参根及其制剂广泛地应用于临床，山东道地产区年产量约一千万千克，但大量的地上部分却弃之不用，因此在丹参根部加工的过程中会造成大量浪费。研究表明，丹参地上茎叶部分含有丰富的丹酚酸B、丹参素和原儿茶醛等水溶性酚酸类成分。近年来药理研究发现，酚酸类化合物具有新的药用价值，如抗炎、抗氧化、抗糖尿型肾病、抗艾滋病、抗肝纤维化和抗肝癌等功效，因此，对丹参茎叶中有效成分的提取工艺进行深入研究，可为中药废弃物的再次利用提供一条新路。
随着中药现代化的深入，酶法提取已成为快速有效地从中药材中提取分离和纯化低含量成分并保持其高活性的有效手段。利用酶解技术可以破坏植物细胞壁，减少有效成分从胞内向胞外溶出的阻力，从而提高提取效率。另外，由于丹参茎叶被弃掉，会对环境造成较大的污染。
在目前采用的酶法提取中草药或其废弃物有效成分的研究中，大多采用单一酶处理。但由于植物细胞壁是由木质素、纤维素和半纤维素组成的木质纤维素复合大分子，单一酶的破壁效率往往不高，往往需要多种酶系复合作用，才能有效降解细胞壁。目前市场上销售的复合酶制剂主要是采用多菌株分别发酵产单一酶，再通过复配技术形成产品，这对许多酶制剂生产厂家来说，条件要求比较高，而且单一酶成本太高，因此不适合于大规模的工业应用。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，包括复合酶提取和水浸提，所述复合酶为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15发酵产生的粗酶液，所述白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.11415。
上述方法还包括：将上述提取得到的提取液减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液，将浓缩液再经冷冻干燥，即得到丹参茎叶中丹酚酸类成分提取物。
优选：所述丹参茎叶在进行复合酶提取前首先进行干燥处理，然后粉碎成30-50(优选40)目的粉末。
优选：所述复合酶提取时的复合酶粗酶液和丹参茎叶的质量体积比(g/ml)为15∶1-20：1。
优选：所述复合酶提取时的酶解温度为30-50℃。
优选：所述复合酶提取时的酶解时间为0.5-1小时。
优选：所述复合酶提取时的pH值为4.5-5.0。
优选：所述水浸提取时将复合酶提取后的混合液中加入粗酶液体积倍数为40-60倍(优选50倍)的水，40-60℃(优选50℃)提取80-100℃(优选90℃)收集滤液。
优选：减压浓缩的温度为40-50℃(优选：45℃)。
优选：冷冻干燥的条件：真空度135bar，温度-45℃。
本发明的有益效果：
本发明的提取方法可有效地促进丹参茎叶中酚酸类成分的释放，提高提取率，降低生产成本；并且本发明生产过程中不产生有害物质，无污染，产品质量好，功效强，同时还综合利用中药废弃物，变废为宝，是一种环境友好的绿色提取方法。
本发明提出采用丹参内生菌产生的木质素酶与纤维素酶复合酶法新工艺提取丹参茎叶废弃物中丹酚酸，考察了复合酶用量、酶解时间、酶解温度等因素对丹酚酸类成分提取率的影响，优化出了木质素酶与纤维素酶复合酶法提取丹参茎叶丹酚酸类成分最佳工艺条件。采用木质素酶与纤维素酶复合酶新工艺提取丹参茎叶丹酚酸类成分，比传统水提工艺提高了42.2％的提取率。
附图说明
图1是温度对丹参茎叶总丹酚酸含量提取率的影响；
图2是酶料比对丹参茎叶总丹酚酸提取率的影响，其中横坐标1-5对应的酶料比分别为5:1，10:1，15:1，20:1，25:1；
图3是本发明酶解时间对丹参茎叶总丹酚酸含量的影响；
图4是酶解温度和酶料比对总丹酚酸提取率的影响的响应面的等高线；
图5是酶解温度和酶料比对总丹酚酸提取率的影响的响应面的三维曲线；
图6是酶解温度和酶解时间对总丹酚酸提取率的影响的响应面的等高线；
图7是酶解温度和酶解时间对总丹酚酸提取率的影响的响应面的三维曲线；
图8是酶料比和酶解时间对总丹酚酸提取率的影响的响应面的等高线；
图9是酶料比和酶解时间对总丹酚酸提取率的影响的响应面的三维曲线；
图10为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在马铃薯综合培养基上的生长特征；
图11为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在PDA-愈创木酚平板上的产漆酶情况，其中，A.BDF15培养3d时产生的漆酶氧化圈(正面)；B.BDF15培养3d时产生的漆酶氧化圈(背面)；C.BDF15培养5d时产生的漆酶氧化圈(正面)；D.BDF15培养5d时产生的漆酶氧化圈(背面)；
图12为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在液体产酶培养中的生长状况。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，包括以下步骤：将丹参茎叶干燥，粉碎成40目的粉末，称取50g，按照酶料比15∶1加入复合酶粗酶液，摇匀后，控制酶解温度在40℃，pH值4.5-5.0，酶解时间0.5小时，处理丹参茎叶；酶解完毕后，再加入50倍量蒸馏水，置于50℃的水浴锅中，保温水浸提取90min后过滤。滤渣进行二次纯水抽提；合并两次提取液。45℃减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液；浓缩液再经冷冻干燥，其操作条件为:真空度135bar，温度-45℃，即得到丹参水溶性提取物干粉。
实施例2
一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，包括以下步骤：将丹参茎叶干燥，粉碎成40目的粉末，称取50g，按照酶料比20：1加入复合酶粗酶液，摇匀后，控制酶解温度在30℃，pH值4.5-5.0，酶解时间1小时，处理丹参茎叶；酶解完毕后，再加入50倍量蒸馏水，置于50℃的水浴锅中，保温水浸提取90min后过滤。滤渣进行二次纯水抽提；合并两次提取液。45℃减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液；浓缩液再经冷冻干燥，其操作条件为:真空度135bar，温度-45℃，即得到丹参水溶性提取物干粉。
实施例3
一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，包括以下步骤：将丹参茎叶干燥，粉碎成40目的粉末，称取50g，按照酶料比18：1加入复合酶粗酶液，摇匀后，控制酶解温度在50℃，pH值4.5-5.0，酶解时间45min，处理丹参茎叶；酶解完毕后，再加入50倍量蒸馏水，置于50℃的水浴锅中，保温水浸提取90min后过滤。滤渣进行二次纯水抽提；合并两次提取液。45℃减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液；浓缩液再经冷冻干燥，其操作条件为:真空度135bar，温度-45℃，即得到丹参水溶性提取物干粉。
实施例4
一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，包括以下步骤：将丹参茎叶干燥，粉碎成30目的粉末，称取50g，按照酶料比19：1加入复合酶粗酶液，摇匀后，控制酶解温度在30℃，pH值4.5-5.0，酶解时间1小时，处理丹参茎叶；酶解完毕后，再加入40倍量蒸馏水，置于40℃的水浴锅中，保温水浸提取80min后过滤。滤渣进行二次纯水抽提；合并两次提取液。45℃减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液；浓缩液再经冷冻干燥，其操作条件为:真空度135bar，温度-45℃，即得到丹参水溶性提取物干粉。
实施例5
一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，包括以下步骤：将丹参茎叶干燥，粉碎成50目的粉末，称取50g，按照酶料比20：1加入复合酶粗酶液，摇匀后，控制酶解温度在30℃，pH值4.5-5.0，酶解时间1小时，处理丹参茎叶；酶解完毕后，再加入60倍量蒸馏水，置于60℃的水浴锅中，保温水浸提取100min后过滤。滤渣进行二次纯水抽提；合并两次提取液。45℃减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液；浓缩液再经冷冻干燥，其操作条件为:真空度135bar，温度-45℃，即得到丹参水溶性提取物干粉。
复合酶提取时的所用的粗酶液的制备；
白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15分离
从山东省泰安市泰山(海拔800m)采集健康无病症的白花丹参(SalviamiltiorrhizaBunge.f.albaC.Y.WuetH.W.Li)，去腐叶，用清水洗去泥沙及其它杂质，冲洗干净，置于滤纸上自然风干。将白花丹参的根切成约0.5cm的小段，置于干净的培养皿中。在超净工作台中，用75％乙醇处理2min，无菌水冲洗5次，0.1％升汞处理5min，再用无菌水冲洗5次，最后再用75％酒精漂洗30S，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分。用无菌的刀片将材料外皮剥去后，切成0.2cm×0.2cm的小片，置于添加青霉素的PDA培养基中，25℃恒温培养14天。同时将上述经表面灭菌的材料不做任何处理直接种植于PDA培养基中，同条件培养，作为对照观察，目的检查表面消毒是否彻底。培养3～7d后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取材料切口处长出的菌丝，转接到新鲜PDA培养基上进一步培养，纯化3～4次以保证所得菌落为纯培养，将此菌株命名为BDF15。斜面保存备用。
白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15鉴定
将上述菌株BDF15进行如下生理生化、菌形态的鉴定：
(1)菌落形态特征：菌株BDF15的菌落形态如图10所示，其菌丝白色，毡状，较厚；不易挑取；菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密，为不产孢真菌。
(2)分子鉴定：
采用改良SDS法提取的DNA条带清晰、整齐，无弥散和拖尾现象，无杂质污染；利用ITS通用引物ITS1和ITS4，进行ITS扩增分析，得到长度为1054bp的单一DNA条带，其ITSrDNA序列如SEQIDNo.1所示。
综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》，本发明菌株BDF15为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)，归属于伞菌目、鬼伞科、脆柄菇属。该菌株于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo11415。
白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15的固体平板培养
将菌株BDF15在马铃薯综合培养基和马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)中，28士1℃培养，其菌丝生长状况不尽相同。如图10所示，在马铃薯综合培养基上内生真菌菌丝生长菌丝亮白，丝绒状，粗壮致密，长势旺，28士1℃培养3～4天，菌落直径32-36mm，7～9天长满整个培养皿；PDA培养基上菌丝较白，长势一般。
四、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15在固体产酶培养基上产酶情况
用无菌打孔器将平板菌种制成直径5mm的菌饼，取菌饼1片接种到刚果红纤维素选择培养基中，28℃培养5～7天，每天定时观察菌落生长和菌落周围颜色的变化情况，到第6天，纤维素酶活性达到最高。将菌株转接PDA-愈创木酚平板，28℃条件下继续培养5～7天，每天测量菌丝圈、紫色氧化圈直径，记录氧化圈颜色深浅，到第5天，其生长量和产酶量达到最大，BDF15的菌丝直径和漆酶氧化带直径分别为4.1和3.3cm(图11)。
五、白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15液体发酵及粗酶液制备
将直径为5.0mm的菌饼2块，接入100mL产酶发酵培养基(250mL三角瓶)，120r/min，28℃振荡培养5～6d后(图12)，发酵液经8层纱布滤过后于5000r/min离心5min，取上清液，即为复合酶粗酶液。复合酶中漆酶活性最高，为452.84U/ml；其次是纤维素降解酶，其中FPA53.26U/ml，CMCase73.35U/ml，C1酶52.22U/ml，β-葡萄糖苷酶68.28U/ml；其他辅助酶中，果胶酶13.43U/ml、木聚糖酶27.21U/ml、蛋白酶45.52U/ml、淀粉酶12.54U/ml。
5.1漆酶活性测定：利用ABTS法测定酶活。反应总体积3mL中，含0.1mL酶液，1.9mL0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.5)，加入1.0mL0.5mmol/LABTS以启动反应，30℃水浴保温4min，后沸水浴灭酶1min，测420nm吸光值。1个酶活力单位(U)是指在上述条件下，反应体系中每分钟催化1umolABTS氧化所需酶量。(420nm处ABTS的摩尔吸光系数ε420＝3.6*104cm-1·L·mol-1)
5.2滤纸酶活力(FPA)的测定:取0.5mL酶液和1.5mL0.05mol/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5),加入滤纸条50mg(新华定量滤纸,约1cm×6cm),50℃水浴1h。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。反应后采用DNS法测定酶解产生的还原糖量。
5.3CMCase酶活力的测定:取1.5mL1％CMC2Na柠檬酸缓冲液(pH5.0),加入酶液0.5mL,50℃水浴30min。在上述条件下,每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。反应后采用DNS法测定酶解产生的还原糖量。
5.4β-葡萄糖苷酶活力的测定:取0.5mL酶液和1.5mL水杨酸苷柠檬酸缓冲液(pH4.5),50℃水浴1h。在上述条件下,每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。反应后采用DNS法测定酶解产生的还原糖量。
5.5果胶酶活力的测定:取0.25％果胶溶液0.5mL，蒸馏水1mL，酶液0.5mL，摇匀。50℃水浴1h。加入1.5mLDNS，煮沸5min，定容至20mL，在540nm下测吸光值。在上述条件下，每小时催化生成1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。
5.6木聚糖酶活力的测定:取pH6.5PBS缓冲液2.2mL和1％的木聚糖溶液0.6mL，再加入0.2mL经适当稀释后的酶液，50℃水浴10min，加入2mLDNS终止反应，沸水浴10min，定容至20mL，540nm处测吸光值。在上述条件下,每分钟水解生成1μmol还原糖(以木糖/葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
5.7蛋白酶活力的测定:取1％酪蛋白0.5mL和酶液1mL,40℃水浴10min。加入0.4mol/L三氯乙酸3mL终止反应。3000r/min离心3min。吸取上清1mL。加入5mL0.4mol/LNa2CO3和0.5mL福林-酚试剂，40℃水浴20min，在650nm下测吸光值。在上述条件下,每小时由底物产生1μmol酪氨酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。
5.8淀粉酶活力的测定:取2mL酶液及pH5.5的柠檬酸缓冲溶液2mL，1％淀粉溶液2mL，摇匀，在40℃水浴5min，加入0.4mol/LNaOH4mL终止反映，吸取反应2mL，加入2mLDNS，沸水浴5min,定容至20mL，540nm下测吸光值。在上述条件下以每分钟催化生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。
上述方法中所用到的培养基：
本发明所述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15的固体培养为马铃薯综合培养基：马铃薯200g，麦麸50g，葡萄糖20g，MgSO41.0g，蛋白陈5.0g，琼脂20g，水加至1000ml，自然pH。培养条件：28士1℃培养3～4天，菌落直径32～36mm，7-9天长满整个培养皿；菌丝白色，毡状，不易挑取；菌落干燥，不透明，与培养基结合紧密。
本发明所述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15，其产酶筛选培养基(即产纤维素酶培养基)组成为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20g，蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl5g，KH2PO41.0g，MgSO4.7H2O0.2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH。产漆酶培养基：PDA-愈创木酚(0.04％)培养基。
本发明所述的白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15的产酶发酵培养基组成为：葡萄糖20g，麸皮20g，牛肉膏5.0g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O1.5g，硫酸铜0.2g，加水至1000mL；摇瓶培养5～6天，培养温度28士1℃；发酵培养特征：培养第1天，未见明显生长现象，培养第2天，有菌丝球出现，4天后培养液中白色菌球数量增多，直径变大；培养第5-6天，菌丝球数量达到最大量，到了7～9天，菌丝球集结，发酵液颜色变黄。
菌株BDF15在产酶培养基中，28士1℃振荡培养5～6d后，产生丰富的木质纤维素复合降解酶，该复合酶包括纤维素降解酶(FPA，CMCase，C1酶，β-葡萄糖苷酶)、木质素降解酶漆酶以及果胶酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等辅助酶。酶活力分别为：FPA53.26U/ml，CMCase73.35U/ml，C1酶52.22U/ml，β-葡萄糖苷酶68.28U/ml，漆酶452.84U/ml，果胶酶13.43U/ml、木聚糖酶27.21U/ml、蛋白酶45.52U/ml、淀粉酶12.54U/ml，发酵液经8层纱布过滤后，5000r·min-1离心5min，取上清液即为复合酶粗制剂。
下面结合实验说明本发明的有益效果：
1.复合酶提取时的反应条件对提取丹酚酸类成分的影响
(1)温度
由图1可知，白花丹参茎叶中总丹酚酸含量在20℃～40℃范围内随温度的升高而增大，但温度在50℃～60℃之间时，总丹酚酸含量有所下降，考虑到温度太高会导致酶失活，影响提取效果这一因素，因此选定30℃、40℃、50℃进行响应面法优化提取实验。
(2)酶料比(发酵液量∶投料量)
随着酶料比的增加，酶法提取的总丹酚酸也随之增加，尤其酶料比在5：1～20：1时增加得较快，在20：1～25：1范围内，总丹酚酸含量的增加趋于平缓(图2)，因此选择酶料比为10：1、15:1、20:1进行响应曲面法优化提取实验。
(3)酶解时间
随着酶解时间的延长，所得总丹酚酸含量也随之升高，酶法提取的总丹酚酸在15min～30min范围内变化度较大，在30min～60min范围内总丹酚酸含量显著下降(图3)。因此选择酶解时间15min、30min、45min进行响应曲面法优化提取。
2、响应曲面法优化总丹酚酸含量的提取
根据上述单因素实验结果，响应曲面因子及水平见表1。响应面法操作过程共设计三因素三水平共17次独立实验(表2)，应用Design-Expert8.0.5软件对表3中的数据进行多元回归拟合，得到温度、酶料比、酶解时间与总丹酚酸含量之间的高次多项回归方程：总丹酚酸的提取率Y＝10.81-0.057A-0.080B+0.067C+0.092AB+0.062AC-0.13BC-1.78A2-1.86B2-1.16C2。
表1响应曲面因素水平表
表2响应面设计及结果
表3响应面法对总丹酚酸含量的ANOVA分析结果
经表3响应面法对总丹酚酸含量的ANOVA分析结果，得X1、X2、X3及各因素之间的交互作用对白花丹参中总丹酚酸含量的影响效应。本研究设计范围内回归方程显著性检测P＜0.0001，表明该模型具有统计学意义；失拟项LackofFit的P﹥0.05，该模型没有失拟因素存在；A2、B2对总丹酚酸含量的曲面效应非常显著(P＜0.01)，因素AB、AC、BC间相互作用均不显著(P﹥0.05)，由此得出各因素之间的交互作用对白花丹参中总丹酚酸提取有重要影响。
从图4至图9中可以看出，极值条件在圆心处，由Design-Expert软件得到优化条件的处理，确定最优提取工艺为：温度40℃，酶料比15:1，酶解时间30min。
3、复合酶提取法与传统水提法对比实验
为检验响应曲面法所得结果的准确性和可靠性，又考虑到实际操作的便利，根据响应面优化得到的最佳条件，再提取总丹酚酸3份进行平行验证试验(表4)，并与传统水提法进行对比，结果发现，响应曲面法优化的提取条件实测的总丹酚酸提取率为11.03％，预测值为11.25％，利用水提法丹酚酸的提取率为6.38％，提取率提高了42.2％。
表4复合酶法提取丹参茎叶总丹酚酸验证试验结果
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种丹参茎叶中丹酚酸类成分的提取方法，其特征是：包括复合酶提取和水浸提，所述复合酶为白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15发酵产生的粗酶液，所述白黄小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)BDF15已于2015年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11415。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：还包括：将上述提取得到的提取液减压浓缩，得丹参茎叶酚酸类成分浓缩液，将浓缩液再经冷冻干燥，即得到丹参茎叶中丹酚酸类成分提取物。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述丹参茎叶在进行复合酶提取前首先进行干燥处理，然后粉碎成30-50目的粉末。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述复合酶提取时的复合酶粗酶液和丹参茎叶的质量体积比(g/ml)为15∶1-20：1。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述复合酶提取时的酶解温度为30-50℃。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述复合酶提取时的酶解时间为0.5-1小时。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述复合酶提取时的pH值为4.5-5.0。
8.如权利要求1所述的提取方法，其特征是：所述水浸提取时将复合酶提取后的混合液中加入粗酶液体积倍数为40-60倍的水，40-60℃提取80-100℃收集滤液。
9.如权利要求2所述的提取方法，其特征是：所述减压浓缩的温度为40-50℃。
10.如权利要求2所述的提取方法，其特征是：所述冷冻干燥的条件：真空度135bar，温度-45℃。
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