CN103820406A - 一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法，以中药为固态基质，加入适量液体培养基，调节含水量后，接入产漆酶白腐真菌种子液，发酵后提取漆酶，发酵残渣加入萃取剂提取中药活性成分。该发明实现了漆酶无外源铜离子诱导产漆酶，发酵残渣综合利用。该发明具有如下优点：以中药作为固态基质发酵具有成本低，漆酶产量高等优势；以中药作为固态基质，中药中的活性成分能够促进白腐真菌产漆酶；固态发酵过程中微生物生长代谢产生的酶系能够破坏中药表面致密的物理化学结构，使得发酵残渣易于提取活性成分。

Description

一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法
技术领域
本发明属于漆酶固态发酵领域，特别涉及一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，漆酶能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使之生成相应的苯醌和水，属蓝色多铜氧化酶(blue multi–copper oxidase)家族(Leonowicz et al.,2001)。漆酶最早由Yoshida(1983)在日本紫胶漆树(Rhus verniciflua)上发现，是一种可催化漆固化过程的蛋白质，1984年，Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶(Laccase)。随着研究的深入，在真菌和其他植物中都有发现，同时在细菌和昆虫中也有报道。但植物漆酶和真菌漆酶催化过程并不相同，植物漆酶参与木质素合成，通过自由基聚合反应，使香豆醇、松柏醇和芥子醇等聚合成木质素；真菌漆酶参与木质素降解，氧化酚羟基，同时生成水。真菌漆酶底物特异性较低，能够催化降解多种芳香族化合物，应用范围广泛。在食品工业方面，漆酶经固定化，可用于除去啤酒、果汁中的酚类物质，改变产品色泽和提高质量，在油类和含油制品中，添加漆酶可以防止产品氧化；造纸方面，利用漆酶选择性地降解木质素生产纸浆，同时也可用于纸浆漂白，或对造纸废水进行脱氯处理；染料脱色降解方面，包括氮类染料，蒽醌染料，金属染料等；在农药降解方面，如五氯苯酚等。可以说漆酶应用范围越来越广，涉及漆酶生产菌株也越来越多。
目前漆酶的生产主要包含固态发酵和液态发酵两种方式。其中工业上应用较多的仍是液态发酵，而液态发酵能耗高，操作复杂，产生大量发酵废水。与液态发酵相比固体发酵由于其成本低、单位基质产酶量高，发酵过程具有节能，节水等优势，而成为漆酶发酵的重要方向。目前漆酶固态发酵的固态基质主要为玉米秸秆，稻草秸秆，麸皮等。但漆酶固态发酵过程中往往需要添加铜离子作为诱导剂，这在一定程度上限制了漆酶的应用，因此如何实现低铜离子浓度或者无铜离子条件下实现漆酶发酵是当前研究的重要方向。硬毛粗盖孔菌属于非褶菌目多孔菌科粗毛盖孔菌属，主要生长于杨树，柳树腐木、倒木、贮木等上，在中国广泛分布，是自然界常见白腐真菌。硬毛粗盖孔菌生长速度快，生物量大，产酶活力高，能够同时降解纤维素和木质素，但对木质素降解选择性更强。但目前对于其漆酶生产方式，特别是规模化生产还有待进一步加强，本发明建立了一种新型的硬毛粗盖孔菌固态发酵生产高活性漆酶的方法。
中药主要包含纤维素，木质素半纤维素等成分，同时还含有淀粉、胶质、还原糖和有机酸等。以甘草为例，甘草中发现和确定化学结构的化学成分主要有三萜皂甙(主要是甘草酸)、黄酮、香豆素、生物碱、挥发油、有机酸、糖类等，其中三萜皂甙和黄酮类是其主要活性成分。上述木质纤维素可以作为白腐菌生长代谢时的碳源，而甘草中所含的酚类化合物也可以作为诱导物促进真菌漆酶产量的提高。另一方面，甘草的致密结构，木质纤维素的包裹作用也限制了甘草活性成分（如黄酮）的提取。而产漆酶真菌生长过程中会分泌木质素降解酶系，纤维素酶系等，上述酶系可以降解甘草木质纤维素，破坏甘草致密结构，利于黄酮提取。最终实现“1+1>2”的效果。‘
本发明利用中药做为固态发酵基质，节省了发酵成本，中药中的微量元素可以促进硬毛粗盖孔菌在无外源铜离子诱导的情况下生产漆酶，而白腐真菌固态发酵过程中分泌酶系破坏中药致密结构，利于中药有效成分的提取。本发明实现了中药同时作为固态基质发酵产漆酶，发酵残渣提取有效成分，具有良好的经济效益。
发明内容
本发明的目的是实现以中药为基质，在无外源铜离子诱导的前提下，固态发酵生产漆酶，及其发酵残渣综合利用的方法。
一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法的技术方案如下：
（1）将中药粉碎后作为固态基质，加入液体培养基搅拌均匀后灭菌；
（2）接入硬毛粗盖孔菌种子液固态发酵产漆酶；
（3）发酵结束后向发酵基质加水提取漆酶，过滤后得到漆酶溶液和发酵残渣；
（4）发酵残渣中加入萃取剂，提取活性成分。
步骤（1）的中药为甘草，葛根，黄芪，山楂，决明子，麻黄中的一种。
步骤（1）的液体培养基包括氮源和硫酸铜，其中氮源为尿素，酵母粉，蛋白胨，硫酸铵，硝酸钠之一或任意组合，其浓度为1～15g/L；液体培养基含有硫酸铜浓度为0.5～10g/L；液体培养基的pH值为4～7。
步骤（2）的种子液为硬毛粗盖孔菌在马铃薯培养基中液态发酵4～5天所得的发酵液液；种子液接种量为固态基质总质量的5%～10%，固态发酵条件为25℃～35℃，好氧发酵7～21天；
步骤（3）加水提取漆酶为水与发酵基质的质量比为1:10～1:50，130rpm～200rpm震荡提取2～4h。
步骤（4）的发酵残渣中加入的萃取剂为甲醇，乙醇，丁醇，乙酸乙酯和5%NaOH溶液之一，发酵残渣与萃取剂的质量固液比为1:2～1:10，提取温度50℃～80℃，提取时间2～4h。
一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法具有如下有优点：
（1）以中药作为硬毛粗盖孔菌固态基质发酵具有成本低，漆酶产量高等优势。
（2）以中药作为固态基质，中药中的活性成分能够促进白腐真菌产漆酶。
（3）硬毛粗盖孔菌破坏中药表面致密结构，有利于中药提取活性成分。
具体实施方式
实施例1：取甘草100克，粉碎后过20目筛作为固态基质，加入300ml，pH=4的1g/L硫酸铵液体培养基，调节固态基质含水量为75%；灭菌后接入5%产漆酶真菌硬毛粗盖孔菌种子液；28℃好氧培养14天；以1:4的固液比加入蒸馏水，130rpm震荡提取酶液2h，将酶提取液和发酵残渣滤纸过滤，收集滤液和发酵残渣；向发酵残渣中加入以1:4的固液比加入80%(v/v)乙醇，80℃加热提取2h，从萃取液中分离得到黄酮，漆酶产量为200U/g，甘草酸提取率为3.96mg/g。
实施例2：取葛根200克，粉碎后过20目筛作为固态基质，加入400ml，pH=4的5g/L尿素液体培养基，调节固态基质含水量为66%；灭菌后接入8%产漆酶真菌硬毛粗盖孔菌种子液；28℃好氧培养21天；以1:4的固液比加入蒸馏水，130rpm震荡提取酶液2h，将酶提取液和发酵残渣滤纸过滤，收集滤液和发酵残渣；向发酵残渣中加入以1:4的固液比加入80%(v/v)乙醇，70℃加热提取2h，从萃取液中分离得到黄酮，漆酶产量为310U/g，黄酮提取率为2.85mg/g。
实施例3：取黄芪200克，粉碎后过40目筛作为固态基质，加入900ml，pH=4的1g/L蛋白胨液体培养基，调节固态基质含水量为75%；灭菌后接入8%产漆酶真菌硬毛粗盖孔菌种子液；28℃好氧培养21天；以1:4的固液比加入蒸馏水，130rpm震荡提取酶液2h，将酶提取液和发酵残渣滤纸过滤，收集滤液和发酵残渣；向发酵残渣中加入以1:2的固液比加入80%(v/v)甲醇，80℃加热提取2h，从萃取液中分离得到黄酮，漆酶产量为298U/g，黄酮提取率为3.62mg/g。
实施例4：取山楂200克，粉碎后过40目筛作为固态基质，加入200ml，pH=4的2g/L硝酸钠液体培养基，调节固态基质含水量为75%；灭菌后接入8%产漆酶真菌硬毛粗盖孔菌种子液；28℃好氧培养21天；以1:4的固液比加入蒸馏水，130rpm震荡提取酶液2h，将酶提取液和发酵残渣滤纸过滤，收集滤液和发酵残渣；向发酵残渣中加入以1:3的固液比加入水，40℃加热提取2h，从萃取液中分离得到山楂活性成分，漆酶产量为176U/g，山楂活性成分提取率为1.62mg/g。
实施例5：取决明子200克，粉碎后过40目筛作为固态基质，加入200ml，pH=4的2g/L硝酸钠液体培养基，调节固态基质含水量为75%；灭菌后接入8%产漆酶真菌硬毛粗盖孔菌种子液；28℃好氧培养18天；以1:4的固液比加入蒸馏水，130rpm震荡提取酶液3h，将酶提取液和发酵残渣滤纸过滤，收集滤液和发酵残渣；向发酵残渣中加入以1:3的固液比加入水，60℃加热提取2h，得到决明子活性成分，漆酶产量为216U/g，决明子活性成分提取率为1.96mg/g。
实施例6：取麻黄300克，粉碎后过30目筛作为固态基质，加入200ml，pH=4的2g/L硝酸钠液体培养基，调节固态基质含水量为75%；灭菌后接入5%产漆酶真菌硬毛粗盖孔菌种子液；28℃好氧培养18天；以1:4的固液比加入蒸馏水，130rpm震荡提取酶液3h，将酶提取液和发酵残渣滤纸过滤，收集滤液和发酵残渣；向发酵残渣中加入以1:3的固液比加入甲醇，60℃加热提取2h，得到决明子活性成分，漆酶产量为96U/g，麻黄碱提取率为1.34mg/g。

Claims (6)

1.一种以中药为基质硬毛粗盖孔菌固态发酵生产漆酶及发酵残渣综合利用的方法，其特征在于以下步骤： 
（1）将中药粉碎后作为固态基质，加入液体培养基搅拌均匀后灭菌； 
（2）接入硬毛粗盖孔菌种子液固态发酵产漆酶； 
（3）发酵结束后向发酵基质加水提取漆酶，过滤后得到漆酶溶液和发酵残渣； 
（4）发酵残渣中加入萃取剂，提取活性成分。 
2.根据权利要求1所述的方法，特征在于所述步骤（1）的中药为甘草，葛根，黄芪，山楂，决明子和麻黄中的一种。 
3.根据权利要求1所述的方法，特征在于所述步骤（1）的液体培养基包括氮源和硫酸铜，其中氮源为尿素，酵母粉，蛋白胨，硫酸铵和硝酸钠之一或任意组合，其浓度为1～15g/L；液体培养基含有硫酸铜浓度为0.5～10g/L；液体培养基的pH值为4～7。 
4.根据权利要求1所述的方法，特征在于所述步骤（2）的种子液为硬毛粗盖孔菌在马铃薯培养基中液态发酵4～5天所得的发酵液液；种子液接种量为固态基质总质量的5%～10%，固态发酵条件为25℃～35℃，好氧发酵7～21天。 
5.根据权利要求1所述的方法，特征在于所述的步骤（3）加水提取漆酶为水与发酵基质的质量比为1:10～1:50，130rpm～200rpm震荡提取2～4h。 
6.根据权利要求1所述的方法，特征在于所述步骤（4）的发酵残渣中加入的萃取剂为甲醇，乙醇，丁醇，水和5%NaOH溶液之一，发酵残渣与萃取剂的质量固液比为1:2～1:10，提取温度50℃～80℃，提取时间2～4h。 
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