CN108697630B - 使用粗硬春孔菌细胞培养物提取物增亮皮肤的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于增亮皮肤的组合物和方法，包括施用包含粗硬春孔菌(Earliella scabrosa)的细胞培养物提取物的护肤组合物。一种用于培养粗硬春孔菌的方法，包括使用诱导剂、选择碳水化合物和最佳加工条件以产生所述细胞培养物提取物的增加的亮肤特性。

Description

使用粗硬春孔菌细胞培养物提取物增亮皮肤的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本专利申请要求以下专利的权益：2015年9月29日提交的美国临时申请62/234,232、2015年9月29日提交的美国临时申请62/234,239和2015年9月29日提交的美国临时申请62/234,247。前述相关美国专利申请的全部公开内容据此以引用方式并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及用于改善皮肤外观的局部用组合物，所述改善皮肤外观包括使用有效量的粗硬春孔菌(Earliella scabrosa)的细胞培养物提取物增亮皮肤。

背景技术

改变皮肤表面黑色素很重要，因为超过50％的黑色素位于皮肤外层，特别是在暴露于紫外线后。由黑色素细胞产生的黑色素从黑色素细胞转移到角质细胞，并且促成在表面上感知到的皮肤颜色。通过改变皮肤表面黑色素的光学特性，可改变皮肤颜色的外观，提供更快的皮肤色调增亮和均匀的外在皮肤色调变化。

已知真菌和细菌可侵蚀和液化低阶煤(也称为褐炭或褐煤)。这些微生物在使用煤作为碳源时可将其作为生长基质，这会通过分泌酶如过氧化物酶、代谢物和天然螯合剂，从煤结构中去除形成络合物的金属离子，从而导致煤炭降解。部分煤成分是含有大量木质素的植物腐化残留物，木质素是一种复杂的聚合物，它构成植物的细胞壁，有助于木材的强度和硬度。

俄式孔菌(Earliella)是多孔菌科的一个木材降解大型真菌属。这是一个单型属，含有单一物种粗硬春孔菌。它在热带和亚热带地区相当常见，并且生长在各种被子植物的枯木上。该物种的特征是可变的，因此包括几个同义词(Sheng-Hua Wu,“Cultural Studiesof Four Polypores(Basidiomycotina)Collected in Taiwan”，Bulletine of NationalMuseum of Natural Science，第8卷，第65-72页，1996年)。

美国专利No.8,956,624公开了用来自变色栓菌(Trametes veriscolor)的提取物处理皮肤的组合物和方法。美国专利No.8,691,194公开了产生来源于黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的木质素过氧化物酶的方法及其在皮肤和毛发增亮中的用途。美国专利No.7,291,340公开了来源于曼式外瓶霉(Exophiala monsonii)的黑色素降解提取物。美国专利No.6,514,506教导了含有来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的酶的增白组合物。美国专利No.5,578,296公开了使用担子菌(Basidiomycetes)培养物分解黑色素。

有几种包含真菌或酵母提取物的商购可获得的美容产品已在美国销售，用于修复斑点。这些产品包括Lacome Blanc Expert Melanolyser III^TM全方位瞬白亮肌精华素、Clinique Derma肌本透白科研亮肌精华液和Estee Lauder Cyberwhite EX突破亮白高效精华液。

本发明涉及发现一类白腐真菌粗硬春孔菌可以分泌黑色素水解酶。这些酶可被添加到到用于皮肤增亮的护肤组合物中。另外，本发明涉及用于培养真菌以最大化培养物的亮肤特性的方法。

为了提供更简明的描述，本文给出的一些数量表述没有用术语“约”修饰。应当理解，无论是否明确地使用了术语“约”，本文所给出的每个量都意在指代实际的给定值，并且还意在指代由本领域的普通技术人员可合理推测出的这些给定值的近似值，包括这些给定值的由实验和/或测量条件所引起的近似值。

为了提供更简洁的描述，本文中一些定量表述被叙述为约X量至约Y量的范围。应当理解，当叙述范围时，所述范围并不限制于所叙述的上下界限，而应包括约X量至约Y量的整个范围或者其中的任何量或范围。

除非另行阐明，否则本文中列出的所有百分比为基于组合物的总重量的重量百分比。

发明内容

本发明涉及一种通过将组合物施用于需要增亮的人类皮肤来增亮皮肤的方法，所述组合物包含美容上可接受的载体和亮肤有效量的粗硬春孔菌的细胞培养物提取物。需要亮肤的人类皮肤可包括因UV而颜色变深的皮肤、具有不均匀皮肤色调的皮肤、具有一个或多个色素斑、黑色素斑、老年斑、日晒斑、老年性雀斑、雀斑、单纯性雀斑样痣、色素型日光性角化病、脂溢性角化病、黑斑病、痤疮斑痕、以及它们的组合的皮肤。在所述方法中使用的组合物可包含约0.0001重量％至约40重量％、或0.01重量％至约25重量％、或约0.1重量％至约10重量％的粗硬春孔菌的细胞培养物提取物。在所述方法中使用的组合物可为以下形式：溶液、悬浮液、洗剂、霜膏、精华素、凝胶、棒剂、喷剂、软膏剂、洗液、皂条、洗发剂、毛发调理剂、糊剂、泡沫、粉末、摩丝、剃须膏、水凝胶或成膜产品。

将组合物施用于皮肤的步骤可包括将组合物从基质转移到皮肤。基质可以是擦拭物或面膜。在所述方法中使用的组合物可包含另外的亮肤活性剂。将组合物施用于皮肤的方法可包括每日一次或两次施用具有粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的组合物。所用的组合物可以是包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的两种或更多种不同组合物。两种或更多种不同组合物可以独立地为洗剂、清洁剂、贴膜、精华液、擦拭物、霜膏、精华素和凝胶。

在本发明方法中使用的细胞培养物提取物可具有约500U/mL至约2000U/mL、或约600U/mL至约1800U/mL、或约1000U/mL至约1800U/mL的黑色素降解活性。

本发明的另一方面包括一种在水性液体培养基中培养粗硬春孔菌的方法，该方法包括以下步骤：用粗硬春孔菌接种液体培养基，并且将液体培养基与约10g/ml至约2000g/ml的量的诱导剂掺和。诱导剂可包括合成黑色素、乌贼墨黑色素、3,4-二甲氧基苄醇、木质素、苄醇、肉桂酸、愈疮木酚、水杨酸甲酯、苯二酚、苯醌、没食子酸、水杨酸、丁子香酚、咖啡酸、二甲苯酚以及它们的混合物。诱导剂可以约30mg/ml至约1000mg/ml、或约200mg/ml至约400mg/ml、或约245mg/ml至约350mg/ml的量使用。

培养方法还可包括将液体培养基的pH保持在约5至约6之间的步骤。另外，培养方法可包括向液体培养基中添加氮源。氮源可选自米糠、麦麸、硝酸铵、酵母提取物或它们的混合物。将氮源以约0.1g/L至约25g/L、或约0.2g/L至约20g/L、或约5g/L至约20g/L的量添加到培养基中。

培养方法还可包括用培养摇动器以约100rpm的速率搅拌液体培养基的步骤。该方法还可包括向液体培养基中添加到碳源。碳源可以是葡萄糖、右旋糖或它们的混合物。添加到液体培养基中的碳源的量为约2.0g/L至约20g/L、或约5.0g/L至约15g/L、或约5g/L至约10g/L。培养方法可包括用筛网过滤液体培养基的步骤。

本发明的另一方面是一种护肤组合物，其包含美容上可接受的载体以及能有效增亮人类皮肤的量的粗硬春孔菌的细胞培养物提取物。该组合物可包含约0.0001重量％至约40重量％、或约0.01重量％至约25重量％、或约0.1重量％至约10重量％的粗硬春孔菌的细胞培养物提取物。护肤组合物可包含第二亮肤剂。

附图说明

图1是一系列培养有粗硬春孔菌MY993菌株的黑色素琼脂平板的照片，其示出黑色素脱色的效果。

图2是培养有未使黑色素脱色的白腐真菌菌株的一系列黑色素琼脂平板的照片。

图3是Melanoderm 3D皮肤等效模型的照片，其示出粗硬春孔菌培养物提取物(MY993)减少了色素沉着。

具体实施方式

细胞培养物提取物

如本文所用，“细胞培养物提取物”是指在细胞培养过程之后由微生物的细胞培养物制备的材料。提取物可以由离心的液体培养基制成。然后过滤上清液。通过过滤器后的材料是细胞培养物提取物。这也被称为细胞培养物滤液。

本发明涉及一种通过培养真菌制备的细胞培养物提取物。更具体地讲，细胞培养物提取物由粗硬春孔菌的培养物制成。甚至更具体地讲，细胞培养物提取物由粗硬春孔菌MY993或MY261的培养物制成。真菌菌株MY993和MY261发现于泰国，并且2006年首次由泰国基因工程及生物技术国家中心(BIOTEC)的研究人员分离出来。因此，通过基于形态学的方法将这两种真菌鉴定为粗硬春孔菌，并且随后将其保藏在Thailand Science Park,Phaholyothin Road,Klong 1,Klongluang,Pathumthani 12120,Thailand的泰国生物资源研究中心(TBRC)，并分别命名为TBRC no.2014和2015。真菌菌株MY993(TRBC 2014)和MY261(TBRC 2015)由Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)Germany于2016年8月18日根据布达佩斯条约进行保藏，并且分别编号为DSM 32358和DSM 32359。

根据本发明的细胞培养物提取物具有约500U/ml至约2000U/ml、更具体地讲约600U/ml至约1800U/ml、并且甚至更具体地讲约1000U/ml至约1750U/ml的黑色素降解活性。U/ml是指如实施例3详述的黑色素降解测定中所述的每毫升提取物的黑色素降解酶单位数。

亮肤方法

本发明涉及一种通过将包含某种真菌的细胞培养物提取物的组合物施用于需要增亮的皮肤来增亮皮肤的方法。更具体地讲，本发明涉及一种通过将包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的组合物施用于需要增亮的皮肤来增亮皮肤的方法。

如本文所用，术语“增亮皮肤”通常指使皮肤色调、皮肤颜色和/或皮肤色度变淡、变亮、变白和/或均匀，和/或指祛黄，和/或指色素沉着斑痕和/或病损(包括但不限于色素斑、黑色素斑、老年斑、日晒斑、老年性雀斑、雀斑(freckles)、单纯性雀斑样痣、色素型日光性角化病、脂溢性角化病、黑斑病、痤疮斑痕、发炎后色素沉着过度、小痣、雀斑(ephelides)、它们中两种或更多种的组合等)的淡化和/或褪色。在某些实施方案中，“增亮皮肤”还指增加的皮肤光彩、光泽度、半透明度和/或发光和/或获得更多光彩、光泽、半透明的或发光的皮肤色调外观或较低的黄色或灰黄色皮肤色调。在某些优选的实施方案中，“增亮皮肤”指使皮肤色调增亮和均匀、增加皮肤光彩和/或淡化老年斑。

如本文所用，术语“需要亮肤处理的皮肤”一般指表现出一种或多种选自如下特性的皮肤：具有低于41的个体类型角(ITA)测量值(根据2007年公布的Colipa Guideline:Guideline For The Colorimetric Determination Of Skin Colour Typing AndPrediction Of The Minimal Erythemal Dose(Med)Without Uv Exposure(COLIPA指南：用于皮肤颜色分型的比色测定和无紫外线暴露的最小红斑量(MED)预测的指南)测定的，该文献以引用的方式并入本文，并还在下文描述)的皮肤，发暗和/或灰黄的皮肤，包括因UV而颜色变深的皮肤，具有不均匀皮肤色调的皮肤，或具有一处或多处色素沉着的斑痕和/或病损(包括但不限于色素斑、黑色素斑、老年斑、日晒斑、老年性雀斑、雀斑、单纯性雀斑样痣、色素型日光性角化病、脂溢性角化病、黑斑病、痤疮斑痕、发炎后色素沉着过度、小痣、雀斑、它们的两种或更多种的组合等)的皮肤。在COLIPA指导手册中，肤色被定义为ITA值的函数：非常浅色的皮肤>55；浅色皮肤41-55、中等色皮肤28-41和棕褐色皮肤<28。在某些优选的实施方案中，“需要亮肤的皮肤”指具有皮肤具有低于41的的ITA值诸如约40或更低、约35或更低、约30或更低、或更优选约28或更低的个体。在某些其他优选的实施方案中，本发明涉及用于选自灰黄和/或颜色变深皮肤的需要亮肤处理的皮肤上的组合物和方法。在某些其他优选的实施方案中，本发明涉及用在需要亮肤处理的皮肤上的组合物和方法，所述需要亮肤处理的皮肤选自老年斑、雀斑、痤疮后留下的斑痕以及它们中两种或更多种的组合。如本文所用，“需要改善老化迹象的皮肤”是指为(但不限于)松垂、松弛、松散、粗糙、有皱纹、变薄和不平的皮肤。改善老化迹象是指改善皮肤紧实度、改善皮肤肌理、改善皮肤上皱纹的出现、改善皮肤色调或治疗皮肤中的外部侵害。

如本文所用，“改善皮肤色调”是指增亮皮肤的外观(例如，增亮色素沉着的斑痕或病损、减少皮肤灰黄和/或均匀皮肤的颜色)。

如本文所用，“美容上/皮肤病学可接受的”是指适合与组织(例如，皮肤或毛发)接触使用，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变应性应答等等。

如本文所用，“安全且有效量”是指多至足以产生预期效果但少至足以避免严重副作用(包括毒性等)的提取物或组合物的量。化合物、提取物或组合物的安全且有效量将随着例如最终使用者的年龄、健康状态和环境暴露，治疗的持续时间和性质，所采用的具体提取物、成分或组合物，所利用的特定药学上可接受的载体和类似因素而变化。

化合物、提取物或组合物的安全且有效量将随着例如最终使用者的年龄、健康状态和环境暴露，治疗的持续时间和性质，所采用的具体提取物、成分或组合物，以及所利用的特定药学上可接受的载体和类似因素而变化。

对于包括所述组合物的亮肤用途的实施方案而言，“亮肤有效量”是指在作为亮肤测试(ΔL)的皮肤表皮等同物模型中有效达到高于零的ΔL值的提取物的量，如下文所述。在某些优选的实施方案中，亮肤有效量为有效达到约1或更高的ΔL的量。

在增亮皮肤的方法中使用的护肤组合物中的细胞培养物提取物的量将在护肤组合物的约0.001重量％至约40重量％之间变化。更具体地讲，该量将为护肤组合物的约0.01重量％至约25重量％。甚至更具体地讲，该量将为护肤组合物的约0.1重量％至约10重量％。

护肤组合物

本发明涉及一种护肤组合物，其含有粗硬春孔菌细胞培养物提取物和载体。粗硬春孔菌细胞培养物提取物以足以使皮肤增亮的量存在于护肤组合物中。任何合适的载体均可用于根据本发明的护肤组合物中。优选地，所述载体是美容上可接受的载体。如本领域的技术人员将认识到，美容上可接受的载体包括适于与身体，具体地皮肤接触使用的载体，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变应性应答等等。安全且有效量的载体是约50重量％至约99.999重量％、优选约80重量％至约99.9重量％、更优选约99.9重量％至约95重量％、最优选约98重量％至约99.8重量％的组合物。

载体可以广泛多样的形式存在。例如，为乳液形式的载体，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水和硅氧烷包水包油乳液可用于本文中。这些乳液可涵盖范围较宽的粘度，例如约100cps至约200,000cps。

合适的美容上可接受的载体的示例包括用于化妆品溶液、悬浮液、洗剂、霜膏、精华素、精华液、凝胶、调色剂、棒剂、喷剂、软膏剂、洗液和皂条、洗发剂、毛发调理剂、糊剂、泡沫、摩丝、粉末、剃须膏、擦拭物、贴片、带、强力贴片、微针贴片、绷带、水凝胶、成膜产品、面膜和皮肤贴膜、化妆品、液滴、美容膜等的美容上可接受的溶剂和材料。这些产品类型可含有若干类型的美容上可接受的载体，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液诸如微乳液和纳米乳液、凝胶、固体、脂质体、其他包封技术等。

下面是所述载体的非限制性示例。其它载体可由本领域的普通技术人员进行配制。在一个实施方案中，载体含有水。在另一个实施方案中，载体还可含有一种或多种水性溶剂或有机溶剂。有机溶剂的示例包括但不限于：二甲基异山梨醇；肉豆蔻酸异丙酯；阳离子、阴离子和非离子性质的表面活性剂；植物油；矿物油；蜡；树胶；合成和天然的胶凝剂；链烷醇；二醇；和多元醇。二醇的示例包括但不限于甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二乙二醇、三乙二醇、辛二醇、甘油、丁二醇和己三醇以及它们的共聚物或混合物。链烷醇的例子包括但不限于具有约2个碳原子至约12个碳原子(例如，约2个碳原子至约4个碳原子)的那些，诸如异丙醇和乙醇。多元醇的例子包括但不限于那些具有约2个碳原子至约15个碳原子(例如，约2个碳原子至约10个碳原子)的那些，诸如丙二醇。基于载体的总重量计，有机溶剂可以约1％至约99.99％(例如，约20％至约50％)的量存在于载体中。基于载体的总重量计，水可以约5％至约95％(例如，约50％至约90％)的量存在于载体中(使用前)。溶液可含有任何合适量的溶剂，包括约40％至约99.99％。某些优选的溶液含有约50％至约99.9％、约60％至约99％、约70％至约99％、约80％至约99％、或约90％至99％的溶剂。

可由此类溶液制成洗剂。除了溶剂之外，洗剂通常含有至少一种润肤剂。洗剂可包含约1％至约20％(例如，约5％至约10％)的润肤剂和约50％至约90％(例如，约60％至约80％)的水。

可由溶液配制的另一类产品是霜膏。霜膏通常含有约5％至约50％(例如，约10％至约20％)的润肤剂和约45％至约85％(例如，约50％至约75％)的水。

还可由溶液配制的另一类产品是软膏剂。软膏剂可含有动物油、植物油或合成油或半固态10烃类的简单基料。软膏剂可含有约2％至约10％的一种或多种润肤剂加上约0.1％至约2％的一种或多种增稠剂。

可用于本发明的组合物还可作为乳液配制。如果载体是乳液，则约1％至约10％(例如，约2％至约5％)的载体含有乳化剂。乳化剂可为非离子、阴离子或阳离子的。

洗剂和霜膏可被配制为乳液。通常此类洗剂含有0.5％至约5％的乳化剂，而此类霜膏通常将含有约1％至约20％(例如，约5％至约10％)的润肤剂；约20％至约80％(例如30％至约70％)的水；以及约1％至约10％(例如，约2％至约5％)的乳化剂。

水包油型和油包水型单相乳液护肤制剂(诸如洗剂和霜膏)是本领域所熟知的，并且可用于本主题发明。多相乳液组合物，诸如水包油包水型或油包水包油型，也可用于本主题发明。通常，此类单乳液或多相乳液含有水、润肤剂和乳化剂作为主要成分。

本发明的组合物还可作为凝胶(例如，使用合适的胶凝剂的水性凝胶、醇凝胶、醇/水型凝胶或油凝胶)配制。用于水性凝胶和/或醇凝胶的合适胶凝剂包括但不限于天然树胶、丙烯酸和丙烯酸酯聚合物和共聚物以及纤维素衍生物(例如，羟甲基纤维素和羟丙基纤维素)。适用于油(诸如矿物油)的胶凝剂包括但不限于氢化丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物和氢化乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物。此类凝胶通常含有约0.1重量％和5重量％的此类胶凝剂。

本发明的组合物还可配制成固体制剂(例如，基于蜡的棒剂、皂条组合物、粉末或擦拭物)。本发明的组合物还可与固体、半固体或可溶解的基材(例如，擦拭物、贴膜、垫、手套或带)组合。

本发明的组合物还可包含多种另外的美容活性剂中的任一种。合适的另外的活性剂的示例包括：亮肤剂、颜色加深剂、另外的抗衰老剂、原弹性蛋白促进剂、胶原促进剂、抗痤疮剂、控油光剂、抗微生物剂诸如抗酵母剂、抗真菌剂和抗细菌剂、抗炎剂、抗寄生虫剂、外用止痛剂、防晒剂、光照保护剂、抗氧化剂、角质层分离剂、洗涤剂/表面活性剂、保湿剂、营养物质、维生素、能量增强剂、止汗剂、收敛剂、除臭剂、脱毛剂、毛发生长增强剂、毛发生长延缓剂、固化剂、补水剂、增效剂、抗硬结剂、皮肤调理剂、抗蜂窝炎剂、气味控制剂诸如气味遮盖剂或pH改变剂等等。

各种合适的另外的美容上可接受的活性物质的示例包括羟基酸；过氧化苯甲酰；D-泛醇；UV过滤剂，诸如包括但不限于阿伏苯宗(Parsol1789)、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠(Neo Heliopan AP)、二乙氨基羟基苯甲酰基苯甲酸己酯(Uvinul A Plus)、依莰舒(Mexoryl SX)、氨茴酸甲酯、4-氨基苯甲酸(PABA)、西诺沙酯、乙基己基三嗪酮(Uvinul T150)、胡莫柳酯、4-甲基亚苄基樟脑(Parsol 5000)、甲氧基肉桂酸辛酯(Octinoxate)、水杨酸辛酯(Octisalate)、二甲氨苯酸辛酯(Escalol 507)、苯基苯并咪唑磺酸(Ensulizole)、聚硅氧烷-15(Parsol SLX)、三乙醇胺水杨酸、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪(TinosorbS)、二苯酮1–12、二羟苯宗、甲酚曲唑三烷氧烷(Mexoryl XL)、二乙基己基丁酰胺基三嗪酮(Uvasorb HEB)、奥克立林、氧苯酮(Eusolex 4360)、舒利苯酮、亚甲基双苯并三唑基四甲基丁基酚(Tinosorb M)、二氧化钛、氧化锌；类胡萝卜素；自由基清除剂；自旋捕捉剂；类视色素和类视色素前体，诸如30视黄醇、视黄酸和视黄醇棕榈酸酯；神经酰胺；多不饱和脂肪酸；必需脂肪酸；酶；酶抑制剂；酶介质，诸如2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和香草醛；矿物质；激素，诸如雌激素；类固醇，例如氢化可的松；2-二甲基氨乙醇；铜盐，诸如氯化铜；含铜的肽，诸如Cu:Gly-His-Lys、辅酶Q10；氨基酸，诸如脯氨酸；维生素；乳糖酸；乙酰辅酶A；烟酸；核黄素；硫胺；核糖；电子传递体，诸如NADH和FADH2；以及其他植物提取物，诸如燕麦、芦荟、小白菊、大豆、香菇提取物以及它们的衍生物和混合物。

在某些优选的实施方案中，护肤组合物包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物和至少一种另外的皮肤保湿活性剂。另外的皮肤保湿剂的示例包括甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二乙二醇、三乙二醇、辛二醇、甘油、丁二醇和己三醇以及它们的混合物。

在某些优选的实施方案中，本发明的组合物为包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物和至少一种另外的改善老化迹象的药剂的护肤组合物。合适的另外的改善老化迹象的药剂的示例包括但不限于弹性蛋白原促进剂、胶原促进剂、类视色素、透明质酸、二甲基氨乙醇、N,N,N',N'-四(2-羟基丙基)乙二胺、α-羟基酸、多羟基酸，以及它们中两种或更多种的组合。

如本文所用，“弹性蛋白原促进剂”是指具有增强弹性蛋白原产生的生物活性的一类化合物。根据本发明，弹性蛋白原促进剂包括所有能够增强人体中弹性蛋白原的产生的天然或合成化合物。

合适的原弹性蛋白促进剂的例子包括但不限于黑莓提取物、黄栌提取物、小白菊提取物、珠子草提取物以及具有铜和/或锌组分的双金属络合物。具有铜和/或锌组分的双金属络合物可为，例如，柠檬酸铜-锌、草酸铜-锌、酒石酸铜-锌、苹果酸铜-锌、琥珀酸铜-锌、丙二酸铜-锌、马来酸铜-锌、天冬氨酸铜-锌、谷氨酸铜-锌、戊二酸铜-锌、富马酸铜-锌、葡糖二酸铜-锌、聚丙烯酸铜-锌、已二酸铜-锌、庚二酸铜-锌、辛二酸铜-锌、壬二酸铜-锌、癸二酸铜-锌、十二酸铜-锌或它们的组合。在一个优选的实施方案中，弹性蛋白原促进剂选自黑莓提取物、黄栌提取物、小白菊提取物以及它们的组合。在一个特别优选的实施方案中，弹性蛋白原促进剂选自黑莓提取物、小白菊提取物以及它们的组合。

所谓“黄栌提取物”是指“黄栌(Cotinus coggygria)”叶的提取物，诸如其水提取物，购自Bilkokoop of Sofia(Bulgaria)。

所谓“黑莓提取物”是指从悬钩子(Rubus)属植物且优选地越南悬钩子(Rubusfruticosus)分离的化合物的共混物。在一个实施方案中，化合物分离自该植物的花。在另一个实施方案中，化合物分离自该植物的干燥花。此类化合物可分离自植物的一个或多个部分(例如，整株植物、植物的花、种子、根、根茎、茎、果实和/或叶)。在一个优选的实施方案中，黑莓提取物是黑莓叶提取物。一种特别合适的黑莓提取物通过用配混成约5％至约10％的活度的水和乙醇的混合物提取黑莓叶，用可从Symrise Inc.(Teterboro,NJ)商购获得并且以名称“SymMatrix”销售的麦芽糖糊精基体来制备。

可采集“珠子草”的提取物并可作为整株植物使用，或任选地可使用植物的一个或多个部分(例如，植物的花、种子、根、根茎、茎、果实和/或叶)。可将珠子草植株或其部分细分成粉末，诸如通过碾磨或研磨。珠子草的合适研磨形式可从Raintree Nutrition,Inc.(Carson City,Nevada)商购获得。优选地，使用珠子草的低分子量级分，例如基本上不含分子量大于约100,000道尔顿的分子种类的珠子草级分。优选地，此类低分子量级分可水提取自珠子草植株。

本发明的组合物可包含美容有效量的一种或多种弹性蛋白原促进剂，诸如上文所述的那些。基于活性物质计，组合物优选包含约0.1％至约10％的弹性蛋白原促进剂，更优选地约0.5％至约5％的弹性蛋白原促进剂，并且最优选地约0.5％至约2％的弹性蛋白原促进剂。

如本文所用，“胶原促进剂”是指具有增强胶原产生的生物活性的化合物。根据本发明，“非类视色素胶原促进剂”包括不是类视色素或来源于类视色素，并且能够增强人体中胶原产生的所有天然或合成化合物。

合适的胶原促进剂的示例包括但不限于下述：类视色素(包括视黄醇、视黄醛和视黄酸)、小白菊(野甘菊(Tanacetum parthenium))提取物、积雪草(Centella asiatica)提取物和豨莶(Siegesbeckia orientalis)提取物；大豆的提取物；胶原促进肽；乌索酸；和积雪草苷。

积雪草，在留尼汪岛上也称为紫箩(Violette marronne)，在印度称为购土可乐(Gotu Kola)或印度天胡葵(Indian pennywort)，在北美称为积雪草R.(Centellarepanda)，而在马达加斯加称为他乐婆(Talapetraka)，是多形态草药，属于伞形科(Umbelliferae，Apiaceae)，具体地属于天胡荽(Hydrocotyle)亚科。其在整个热带野生生长，并且喜好海拔高度约600米至1200米的潮湿阴暗区域。积雪草具有三个品种：迪比卡型、阿比西尼亚型和佛罗里达型。该草药是已知的并因其愈合、镇静、止痛、抗抑郁、抗病毒和抗微生物特性而被使用。该草药的生物活性看起来是由于该草药中存在三萜烯分子。合适的积雪草提取物以TECA购自Bayer Consumer HealthCare(Basel,Switzerland)。

所谓“豨莶草提取物”是指植物豨莶草的各种提取物中的任一种，包括购自Sederma公司(Croda International Group,Edison,NJ)的豨莶苷。

合适的胶原促进肽包括下述马曲金汰肽(即，来源于细胞外基质蛋白-胶原、弹性蛋白或蛋白聚糖的降解的肽)，包括棕榈酰五肽，具体地讲以MATRIXYL购自Sederma(CrodaInternational Group of Edison,NJ)的Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH；以PROCYTE购自Photomedex of Montgomeryville(PA)的GHK铜肽；以Biopoeptide CL购自Sederma(CrodaInternational Group of Edison,NJ)的棕榈酰GHK肽；仿生四肽，诸如以Chronoline TriPeptide购自Unipex of Québec,Canada的那些；以及以Syn-Coll购自DSM of Basel,Switzerland的棕榈酰三肽。

乌索酸也称为五环三萜酸、乌苏酸、熊果酸、乌索酸(Urson)、β-乌索酸和3-β-羟基-乌索-12-烯-28-酸。其可例如从Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich of St.Louis,MO)商购获得。

积雪草苷，在化学上也称为：[6-[[3,4-二羟基-6-(羟甲基)-5-(3,4,5-三羟基-6-甲基四氢吡喃-2-基)氧基四氢吡喃-2-基]氧基甲基]-3,4,5-三羟基四氢吡喃-2-基]10,11-二羟基-9-(羟甲基)-1,2,6a,6b,9,12a-六甲基-2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-十四氢-1H-苉-4a-甲酸酯)，可例如从Bayer SantéFamiliale Division Serdex,69,Boulevard Victor Hugo 93400 SAINT-OUEN France商购获得。

本发明的组合物可包含美容有效量的一种或多种胶原促进剂。基于活性物质计，组合物优选包含约0.1％至约10％的胶原促进剂，更优选地约0.5％至约5％的胶原促进剂，并且最优选地约0.5％至约2％的胶原促进剂。

本发明的组合物还可包含至少一种另外的亮肤活性剂。合适的亮肤活性剂的示例包括但不限于酪氨酸酶抑制剂、黑色素降解剂、包括PAR-2拮抗剂的黑色素体转移抑制剂、剥脱剂、防晒剂、类视色素、抗氧化剂、氨甲环酸、氨甲环酸十六烷基酯盐酸盐、皮肤漂白剂、亚油酸、腺苷单磷酸二钠盐、母菊提取物、尿囊素、遮光剂、滑石和二氧化硅、锌盐等，以及如在Solano等人在色素细胞研究(Pigment Cell Res.)第19期(第550-571页)和Ando等人，国际分子科学杂志(Int J Mol Sci)第11期(第2566-2575页)中所述的其它试剂。

合适的酪氨酸酶抑制剂的示例包括但不限于维生素C及其衍生物、维生素E及其衍生物、曲酸、熊果苷、间苯二酚、对苯二酚、黄酮例如甘草类黄酮、甘草根提取物、桑树根提取物、菊叶薯蓣根提取物、虎耳草提取物等、鞣花酸、水杨酸盐及衍生物、葡糖胺及衍生物、富勒烯、扁柏酚、双酸、乙酰葡糖胺、5,5'-二丙基-联苯-2,2'-二醇(厚朴木酚素)、4-(4-羟基苯基)-2-丁醇(4-HPB)以及它们中的两种或更多种的组合等。维生素C衍生物的例子包括但不限于抗坏血酸和盐、抗坏血酸-2-葡糖苷、抗坏血酸磷酸钠、抗坏血酸磷酸镁以及富含维生素C的天然提取物。维生素E衍生物的示例包括但不限于α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚以及它们的混合物、生育酚乙酸酯、生育酚磷酸酯以及富含维生素E衍生物的天然提取物。间苯二酚衍生物的示例包括但不限于间苯二酚、4-取代的间苯二酚，如4-烷基间苯二酚，诸如4-丁基间苯二酚(噜忻喏)、4-己基间苯二酚(Synovea HR，Sytheon公司)、苯乙基间苯二酚(Symwhite，Symrise公司)、1-(2,4-二羟苯基)-3-(2,4-二甲氧基-3-甲基苯基)-丙烷(nivitol，Unigen公司)等，以及富含间苯二酚的天然提取物。水杨酸盐的示例包括但不限于4-甲氧基水杨酸钾、水杨酸、乙酰水杨酸、4-甲氧基水杨酸以及它们的盐。在某些优选的实施方案中，酪氨酸酶抑制剂包括4-取代的间苯二酚、维生素C衍生物或维生素E衍生物。在更优选的实施方案中，酪氨酸酶抑制剂包含苯乙基间苯二酚、4-己基间苯二酚或抗坏血酸-2-葡糖苷。

合适的黑色素降解剂的示例包括但不限于过氧化物和酶，诸如过氧化物酶和木质素酶。在某些优选的实施方案中，黑色素抑制剂包括过氧化物或木质素酶。

合适的黑色素体转移抑制剂的示例包括PAR-2拮抗剂诸如大豆胰蛋白酶抑制剂或Bowman-Birk抑制剂、维生素B3及衍生物诸如烟酰胺、大豆精华、全大豆、大豆提取物。在某些优选的实施方案中，黑素体转移抑制剂包括大豆提取物或烟酰胺。

剥脱剂的示例包括但不限于α-羟基酸诸如乳酸、乙醇酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或任何前述物质的任何组合、β-羟基酸诸如水杨酸、多羟基酸诸如乳糖酸和葡糖酸，以及机械剥落诸如微晶换肤术。在某些优选的实施方案中，剥脱剂包括乙醇酸或水杨酸。

防晒剂的例子包括但不限于阿伏苯宗(Parsol 1789)、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠(Neo Heliopan AP)、二乙氨基羟基苯甲酰基苯甲酸己酯(Uvinul A Plus)、依莰舒(Mexoryl SX)、氨茴酸甲酯、4-氨基苯甲酸(PABA)、西诺沙酯、乙基己基三嗪酮(Uvinul T150)、胡莫柳酯、4-甲基亚苄基樟脑(Parsol 5000)、甲氧基肉桂酸辛酯(Octinoxate)、水杨酸辛酯(Octisalate)、二甲氨苯酸辛酯(Escalol 507)、苯基苯并咪唑磺酸(Ensulizole)、聚硅氧烷-15(Parsol SLX)、水杨酸三乙醇胺、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪(TinosorbS)、二苯酮1–12、二羟苯宗、甲酚曲唑三烷氧烷(Mexoryl XL)、二乙基己基丁酰胺基三嗪酮(Uvasorb HEB)、奥克立林、氧苯酮(Eusolex 4360)、舒利苯酮、亚甲基二苯并三唑四甲基丁酚(Tinosorb M)、二氧化钛、氧化锌等等。

类视色素的示例包括但不限于视黄醇(维生素A醇)、视黄醛(维生素A醛)、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇亚油酸酯、视黄酸、视黄醇棕榈酸酯、异维甲酸、他佐罗汀、蓓萨罗丁、阿达帕林、它们中的两种或更多种的组合等。在某些优选的实施方案中，类视色素选自：视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇亚油酸酯、以及它们中的两种或更多种的组合。在某些更优选的实施方案中，类视色素为视黄醇。

抗氧化剂的例子包括但不限于水溶性抗氧化剂诸如巯基化合物及它们的衍生物(例如，焦亚硫酸钠和N-乙酰基半胱氨酸、谷胱甘肽)、硫辛酸和二氢硫辛酸、茋类化合物诸如白藜芦醇和衍生物、乳铁蛋白、铁和铜螯合剂以及抗坏血酸和抗坏血酸衍生物(例如，抗坏血酸-2-葡糖苷、抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸多肽)。适用于本发明组合物的油溶性抗氧化剂包括但不限于丁基化羟基甲苯、类视色素(例如，视黄醇和视黄醇棕榈酸酯)、生育酚(例如，生育酚乙酸酯)、生育三烯酚和泛醌。含有适用于本发明的组合物的抗氧化剂的天然提取物包括但不限于：含有类黄酮和异黄酮以及它们的衍生物(例如，染料木黄酮和木质素异黄酮(diadzein))的提取物、含有白藜芦醇的提取物等等。此类天然提取物的示例包括葡萄籽、绿茶、红茶、白茶、松树树皮、小白菊、不含小白菊内酯的小白菊、燕麦提取物、黑莓提取物、黄栌提取物、大豆提取物、柚提取物、麦芽精提取物、橙皮素、葡萄提取物、马齿苋提取物、甘草查耳酮、查耳酮、2,2'-二羟查耳酮、报春花提取物、蜂胶等。

另外的美容活性剂可以任何合适的量存在于组合物中，例如以约0.0001重量％至约20重量％，例如约0.001重量％至约10重量％诸如约0.01重量％至约5重量％的量存在于组合物中。在某些优选的实施方案中，该量为0.1％至5％，而在其它优选的实施方案中，该量为1％至2％。

本发明的组合物可包含美容有效量的一种或多种抗炎剂化合物。合适的抗炎剂的示例包括取代的间苯二酚、(E)-3-(4-甲基苯基磺酰基)-2-丙烯腈(诸如从美国密苏里州圣路易的西格玛奥德里奇公司商购获得的“Bay 11-7082”)、四氢姜黄素(诸如四氢姜黄素CG，得自新泽西州皮斯卡特维的萨宾莎公司(Sabinsa Corporation of Piscataway,NJ))，来源于下述的提取物和材料：黄檗(Phellodendron amurense)树皮提取物(PCE)、非变性大豆(黄豆(Glycine max))、小白菊(野甘菊(Tanacetum parthenium))、姜(生姜(Zingiberofficinale))、银杏(银杏(Ginkgo biloba))、羟基积雪草苷(积雪草提取物成分)、黄栌(黄栌(Cotinus coggygria))、蜂斗菜提取物(紫蜂斗菜(Petasites hybridus))、枸杞(宁夏枸杞(Lycium barbarum))、奶蓟提取物(水飞蓟(Silybum marianum))、忍冬(金银花(Lonicera japonica))、秘鲁香脂(秘鲁香树(Myroxylon pereirae))、鼠尾草(药用鼠尾草(Salvia officinalis))、酸果蔓提取物(红莓苔子(Vaccinium oxycoccos))、苋菜油(籽粒苋(Amaranthus cruentus))、石榴(石榴(Punica granatum))、马黛茶(巴拉圭茶(Ilexparaguariensis)叶提取物)、白百合花提取物(圣母百合(Lilium candidum))、橄榄叶提取物(橄榄(Olea europaea))、根皮素(苹果提取物)、燕麦粉(燕麦(Aveena sativa))、Lifenol(蛇麻草：啤酒花(Humulus lupulus)提取物)、芒柄花P(红芒柄花(Ononisspinosa))、甘草查耳酮(甘草：胀果甘草(Glycyrrhiza inflate)提取物成分)、馨敏舒(红没药醇和姜提取物)、它们中两种或更多种的组合等。

在一个实施方案中，抗炎剂是间苯二酚。特别合适的取代的间苯二酚包括4-己基间苯二酚和4-辛基间苯二酚，特别是4-己基间苯二酚。4-己基间苯二酚可以“SYNOVEA HR”从Sytheon(Lincoln Park,NJ)商购获得。4-辛基间苯二酚可从City Chemical LLC(WestHaven,Connecticut)商购获得。

所谓“小白菊的提取物”，其是指植物“小白菊”植株的提取物，诸如可根据标题为“PARTHENOLIDE FREE BIOACTIVE INGREDIENTS FROM FEVERFEW(TANACETUM PARTHENIUM)AND PROCESSES FOR THEIR PRODUCTION”的美国专利申请公布No.2007/0196523列出的详细内容制备(全文以引用方式并入本文)。一种特别合适的小白菊提取物可以约20％活性小白菊从Integrated Botanical Technologies公司(Ossining,NY)商购获得。

本发明的组合物还可包含来自泡桐(Paulownia)属的某些物种的植物提取物。这些提取物及其在皮肤组合物(包括用于增亮人类皮肤的组合物)中的用途公开于美国专利申请20120045490、20120045491和20120045530(全文以引用方式并入本文)中。

许多其他物质也可存在于本发明的组合物中。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种选自以下的局部用成分：表面活性剂、螯合剂、润肤剂、湿润剂、调理剂、防腐剂、遮光剂、芳香剂等。

润肤剂是指帮助维持皮肤的柔软、光滑和柔韧外观的化合物(例如，通过保留在皮肤表面上或角质层中以充当润滑剂)。合适的润肤剂的示例包括在Handbook of CosmeticScience and Technology(由A.Barel,M.Paye和H.Maibach编辑，由Marcel Dekker,Inc(New York,NY)于2001年出版)中的第35章，第399-415页(由G Zocchi的Skin Feel Agent)中所见的润肤剂，并且包括但不限于凡士林、己基癸醇硬脂酸酯以及植物、坚果和植物油，诸如澳洲坚果油、米糠油、葡萄籽油、棕榈油、月见草油、氢化花生油和鳄梨油。

湿润剂是指旨在增加皮肤顶层的水含量的化合物(例如，吸湿化合物)。合适的湿润剂的示例包括在Handbook of Cosmetic Science and Technology(由A.Barel、M.Paye和H.Maibach编辑，由Marcel Dekker,Inc New York,NY于2001年出版)中的第35章，第399-415页(G Zocchi的Skin Feel Agent)中所见的那些，并且包括但不限于甘油、山梨糖醇或海藻糖(例如，α,α-海藻糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖)或它们的盐或酯(例如，海藻糖6-磷酸酯)。

表面活性剂是指旨在进行清洗或乳化的表面活性剂。合适的表面活性剂的例子包括存在于Handbook of Cosmetic Science and Technology(由A.Barel、M.Paye和H.Maibach编辑，2001年由Marcel Dekker,Inc.(New York,NY)出版)中第37章，第431-450页(L.Oldenhove de Guertechin编辑的Classification of surfactants)中的那些，并且包括但不限于阴离子表面活性剂诸如硫酸酯、阳离子表面活性剂诸如甜菜碱、两性表面活性剂诸如椰油酰甘氨酸钠、非离子表面活性剂诸如烷基多苷。

合适的螯合剂的示例包括能够保护和保留本发明组合物的那些。优选地，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(“EDTA”)，还更优选地是乙二胺四乙酸四钠，其可以商品名“Versene100XL”从Dow Chemical Company(Midland,Michigan)商购获得。

合适的防腐剂包括例如，对羟基苯甲酸酯、季铵类物质、苯氧基乙醇、苯甲酸盐、DMDM乙内酰脲、有机酸，并且基于组合物的总重量，以约0％至约1％，或约0.05％至约0.5％的量存在于组合物中。

多种可商购获得的珠光剂或遮光剂中的任一种适用于组合物。适用的珠光剂或遮光剂的例子包括但不限于(a)具有约16至约22个碳原子的脂肪酸和(b)乙烯或丙二醇的单酯或二酯；(a)具有约16至约22个碳原子的脂肪酸和(b)式HO-(JO)_a-H的聚亚烷基二醇的单酯或二酯，其中J为具有约2至约3个碳原子的亚烷基基团；并且a为2或3；脂肪醇含有约16至约22个碳原子；式KCOOCH₂L的脂肪酯，其中K和L独立地含有约15至约21个碳原子；不溶于洗发剂组合物的无机固体、以及它们的混合物。

适于在皮肤上使用的任何芳香剂组合物均可用于根据本发明的组合物中。

在某些优选的实施方案中，本发明为包含本发明组合物的基材的形式。可使用任何合适的基材。合适的基材和基材材料的示例公开于例如在US7452547和US2009/0241242中，所述专利全文以引用方式并入本文。

在某些优选的实施方案中，基材为擦拭物、手套或面膜。优选地，此类实施方案包含水不溶性基材，此类基材如上文引用的文献中所定义。对于某些实施方案，水不溶性基材可具有一定的尺寸和形状，使得它覆盖人类使用者的面部，从而有利于将水不溶性基材作为贴膜基材围绕使用者的面部放置。例如，水不溶性贴膜基材可具有针对使用者的嘴部、鼻部和/或眼睛的开口。另选地，水不溶性基材可不具此类开口。这种无开口的构造可用于本发明的实施方案，其中水不溶性基材旨在覆盖在皮肤的非面部的大片区域或如果水不溶性基材旨在用作擦拭物。水不溶性基材可具有各种形状，诸如有角形状(例如矩形)或弧形形状诸如圆形或椭圆形。对于某些实施方案，基材是手套，诸如描述于美国已公布的专利申请号2006/0141014的手套，其全文以引用的方式并入本文中。在本发明的一个实施方案中，产品包括多个具有不同形状的水不溶性基材。

可使用将组合物施用于有需要的皮肤的任何合适方法。例如，可通过用手将组合物从包装直接施用于有需要的皮肤而施用于有需要的皮肤，或可从基材诸如擦拭物或贴膜处转移，或它们中的两种或更多种的组合。在其它的实施方案中，组合物可经由点滴器、管、滚筒、喷雾器和贴片来施用，或添加到浴缸中或者以其它方式添加到水中以施用于皮肤等。组合物可以多种方式或形式施用，包括但不限于作为免洗型霜膏、贴膜和/或精华素。

在其它另外的优选的实施方案中，本发明的方法包括将包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的至少两种不同的组合物或产品施用于皮肤。例如，该方法可包括将包含粗硬春孔菌提取物的第一组合物施用于需要改善皮肤屏障功能并改善皮肤水合和保湿的皮肤，随后将不同于第一组合物的包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的第二组合物施用于需要处理的皮肤。在某些优选实施方案中，第一组合物和第二组合物可独立地选自洗剂、清洁剂、贴膜、擦拭物、霜膏、精华素、凝胶等。在某些优选的实施方案中，第一组合物和第二组合物中的至少一者为清洁剂、洗剂、霜膏、美容膜、精华液或精华素，而另一种为面膜或擦拭物。在某些其他优选的实施方案中，第一组合物和第二组合物中的至少一者为清洁剂，而另一种为洗剂或霜膏。

培养方法

本发明的另一方面是一种优化真菌的培养的方法。申请人进行了一系列实验来改变培养基、pH值和搅拌，以制备具有出乎意料地改善的亮肤特性的细胞培养物提取物。

如本文所用，“改变培养基”是指改变培养物中使用的成分的类型和量。例如，细胞培养中使用的氨的来源可以是硝酸铵、米糠、麦麸、酵母提取物或它们的混合物。有机氮源诸如牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、大豆、麦秆和无机氮源诸如酒石酸铵、硫酸铵、氯化铵或它们的混合物也可用作细胞培养过程中的氨源。培养基中氮源的量可为约0.1g/L至约25g/L、或约0.2g/L至约20g/L、或约5g/L至约20g/L。培养基中碳源的量也可以改变。碳的量可在约2g/L至约20g/L、或约5g/L至约15g/L、或约5g/L至约10g/L的范围内。碳的来源可以选自葡萄糖或右旋糖或它们的混合物。

培养基的pH值可通过添加缓冲体系来改变。一个系统是氢氧化钠和盐酸的组合。可使用本领域已知的其他缓冲体系来改变pH值。

培养培养基的方法可通过改变搅拌来改变。本领域技术人员已知的培养摇动器可用于在培养期间搅拌培养基。振动器可以设定为约100rpm至约200rpm的范围。

改变培养基的另一种方式是添加诱导剂。诱导剂是增强所培养的真菌的黑色素降解酶制备的物质。诱导剂的示例包括合成黑色素、乌贼墨黑色素、藜芦醇、木质素、含有一个或多个苯或等价杂环的有机化合物、苄醇、肉桂酸、愈疮木酚、水杨酸甲酯、苯二酚、苯醌、没食子酸、水杨酸、丁子香酚、咖啡酸、二甲苯酚或它们的混合物。添加培养基组合物中的诱导剂的量可以在约10mg/L至约2000mg/L、或约30mg/L至约1000mg/L、或约200mg/L至约400mg/L、或约245mg/L到约350mg/L的范围内。

虽然前述说明书和附图表示本发明的示例性实施方案，但应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，可对本发明做各种添加、修改和替换。具体地，本领域的技术人员应该清楚的是，不脱离本发明的实质或本质特征，本发明可以以其他具体形式、结构、布置、比例，以及用其他要素、材料和部件来实施。本领域的技术人员应当理解，本发明可与在本发明的实践中使用的结构、布置、比例、材料和部件等的许多修改使用，这些修改尤其能够适用于具体环境和操作要求，而不脱离本发明的原理。因此，当前公开的实施方案在各方面被认为是例示性的而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书指出，且不受前述描述的限制。应当理解在权利要求中，术语“包括/包括的”不排除其他要素或步骤。此外，单数形式的引用不排除复数。术语“一个”、“一种”“第一”、“第二”等不排除复数。

实施例：

使粗硬春孔菌储备培养物生长并保持在pH 6.0的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上。从储备培养物中，使用直径为0.7cm的木塞穿孔器切割含有真菌菌丝体的小块琼脂，然后将其在固体琼脂上继代培养用于随后的研究。将所有培养平板在30℃下温育3天至5天，直至观察到真菌生长。为了在液体培养基肉汤中进行继代培养，首先将含有真菌菌丝体的储备培养琼脂切成1.5cm×3.0cm，再进一步切成更小的片，然后接种到50ml液体培养基肉汤中并在30℃下温育7天至9天。从培养基肉汤中获得粗硬春孔菌培养物滤液，用于以下实施例描述的后续研究。

实施例1：黑色素琼脂筛查

在黑色素琼脂平板上培养粗硬春孔菌MY993并温育9天。所用的黑色素琼脂组合物列于表1中。

表1

黑色素琼脂培养基由表1中列出的组合物制备。将所有成分添加到1L水中，并在121℃下高压灭菌15分钟。高压灭菌后，将琼脂培养基分配到培养皿(每个平板20ml)中并使其凝固。

从真菌储存培养物中，使用直径为0.7cm的木塞穿孔器切割含有真菌菌丝体的小块琼脂，然后通过将真菌块置于新鲜琼脂平板的中心进行继代培养，并在30℃下温育9天。

观察到菌株编号MY993(粗硬春孔菌)使琼脂中的黑色素在9天内脱色，其中在5天时显示一些脱色并且在7天和9天时脱色增加。第3天、第5天、第7天和第9天的琼脂平板的照片示于图1中。

相比之下，其他白腐真菌菌株诸如灵芝属(Ganoderma sp.，TDR 0003)、香菇属(Lentinus sp.，TDR 0008)和假芝属(Amauroderma sp.，TRD 0023)在相同的培养基上培养，并且在9天内没有显示任何黑色素脱色迹象。第3天、第5天、第7天和第9天的对照的琼脂平板示于图2中。

实施例2：经调理的肉汤培养基中的粗硬春孔菌的活性

在使用1升水和表2中列出的组合物配制的液体培养基肉汤中培养粗硬春孔菌。

表2

组合物	重量	供应商	目录编号
				葡萄糖	10g/L	Carlo Erba	346971
酵母提取物	0.2g/L	Difco	212750
				酒石酸二铵	3g/L	Fluka	09985
吐温80	1g/L	Merck	8221870500
				磷酸二氢钾	0.2g/L	Carlo Erba	471687
氯化钙二水合物	0.146g/L	BDH	100704Y
				硫酸镁七水合物	0.05g/L	Carlo Erba	10034.99.8
硫酸锌七水合物	42.5mg/L	Carlo Erba	494907
				硫酸锰一水合物	3.38mg/L	Carlo Erba	10034.96.5
氯化钴II六水合物	7mg/L	Carlo Erba	439355
				硫酸铜七水合物	7mg/L	BDH	100915R
氯化铁III	0.54mg/L	Merck	8.03945.0500
				氯化钠	0.9mg/L	Carlo Erba	479687
合成黑色素	200mg/L	Sigma Aldrich	M8631

从粗硬春孔菌储备培养物中，首先将含有真菌菌丝体的小块琼脂切成1.5cm×3.0cm节段，然后进一步切成较小的片，然后接种到50ml培养基肉汤中，并且在100rpm的搅拌速度下，使用培养摇动器在30℃下温育9天。离心后，再通过0.22μm过滤器过滤上清液，然后通过黑色素降解活性测定进行测试。通过以12,396g离心5分钟，在第3天、第5天、第7天和第9天收获粗硬春孔菌培养物滤液。

实施例3：黑色素降解测定

在96孔板中进行黑色素降解测定，其中每种反应混合物(总体积250μL)包含90μL合成黑色素(250mg/L，pH 6.0)、110μL蒸馏水和50μL粗硬春孔菌培养物滤液。然后将反应混合物在37℃下温育1小时，并用分光光度计在540nm的吸光度下测量。一个单位的黑色素(U/ml)降解酶活性定义为在1小时内在37℃下使540nm处的吸光度降低0.001的酶量。

所选粗硬春孔菌菌株在第3天、第5天、第7天和第9天的培养物滤液中显示出高黑色素降解活性，并且在第7天达到活性峰值，如表3所示。

表3

实施例4：与漆酶的黑色素降解活性比较

已知白腐真菌分泌漆酶。测定所选粗硬春孔菌菌株的漆酶活性。使用2,2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)测定法测量漆酶活性，并使用以下等式计算：

活性＝(ΔE×DF×Vt)/(Δt×Vs×d×ε420)

使用150μL 80mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)将50μL粗硬春孔菌培养物滤液(Vs)的pH调节至5.5。将所有样品稀释至适当的稀释度(稀释因子＝DF)。添加50μL 5mM ABTS溶液后，在37℃下420nm处测量吸光度的变化(ΔE)5分钟(Δt)。使用消光系数ε₄₂₀＝0.04321Lμmol^{- 1}cm^-1、层高度d＝0.63cm和总液体体积Vt＝250μL计算漆酶活性。该测定在分光光度计中完成。漆酶活性(U)被定义为在37℃和pH 5.5下每分钟催化1μmol ABTS的氧化的酶量。

如表4所示，发现漆酶活性与黑色素降解活性不相关。这表明漆酶不是粗硬春孔菌的黑色素降解活性的主要驱动因素。

表4

实施例5和5A：生长条件的优化

比较两种大小的细胞培养物以检查改变培养物的几种组分的效果。在优化前后，两个1升液体肉汤培养基的成分示于表5中。然后进行两个单独的前后实验，以测试前后肉汤组合物的黑色素降解活性。实施例5是50ml细胞培养物并且实施例5A是5升细胞培养物。在优化之前和之后，实施例5和5A都使用相同比例的相同成分。优化配方包括酵母提取物的去除、麦麸和藜芦醇的添加并且将pH值升高至6，以及将发酵通气速率从0.6vvm设置为1.0vvm。使用每种培养物培养粗硬春孔菌MY993。离心后，再通过0.22μm过滤器过滤上清液，然后通过实施例3中使用的黑色素降解活性测定进行测试。

在优化50mL实验室规模的生长条件之后，粗硬春孔菌提取物的黑色素降解活性显示出增加23％，并且在5L优化培养基批次后增加778％，如表6所示。

表5

表6

实施例6：生长条件的优化—诱导剂

液体肉汤培养基通过包含诱导剂来改变。将诱导剂添加到高滴度促进剂的肉汤培养基中，以增强对粗硬春孔菌进行的黑色素降解酶制备。

液体培养基中使用的成分列于表7中。

表7

使用表7中的配方，用1升水制备单独肉汤，并且如表8所示添加以下诱导剂。

表8

使粗硬春孔菌MY993在补充有表8所示不同浓度的不同诱导剂的培养基中生长，并使用培养摇动器在30℃以100rpm的搅拌速度温育。

从粗硬春孔菌MY993储备培养物中，首先将含有真菌菌丝体的小块琼脂切成1.5cm×3.0cm，然后进一步切成较小的片，然后接种到50ml补充有表中所示不同浓度的不同诱导剂的培养基肉汤中，并在30℃下以100rpm的搅拌速度温育，并且使用培养摇动器以100rpm的搅拌速度在30℃下温育9天。通过以12,396g离心5分钟，在第1天、第3天、第5天和第7天收获粗硬春孔菌培养物滤液。离心后，然后通过0.22μm过滤器过滤上清液，然后通过实施例3中使用的黑色素降解活性测定进行测试。

结果汇总在表9中。在第7天的培养物滤液中，245mg/L的藜芦醇显示是在粗硬春孔菌MY993提取物中增强黑色素降解酶制备的最佳诱导剂。

表9：粗硬春孔菌MY993第1天、第3天、第5天和第7天培养物滤液的黑色素降解活性。

表9

实施例7：氮源和pH的优化

制备1升液体肉汤培养物以测试氮源和pH对细胞培养物提取物的黑色素降解活性的影响。所用的肉汤列于表10中。

表10

组合物	重量	供应商	目录编号
				葡萄糖	10g/L	Carlo Erba	346971
酒石酸二铵	3g/L	Fluka	09985
				吐温80	1g/L	Merck	8221870500
磷酸二氢钾	0.2g/L	Carlo Erba	471687
				氯化钙二水合物	0.146g/L	BDH	100704Y
硫酸镁七水合物	0.05g/L	Carlo Erba	10034.99.8
				硫酸锌七水合物	42.5mg/L	Carlo Erba	494907
硫酸锰一水合物	3.38mg/L	Carlo Erba	10034.96.5
				氯化钴II六水合物	7mg/L	Carlo Erba	439355
硫酸铜七水合物	7mg/L	BDH	100915R
				氯化铁III	0.54mg/L	Merck	8.03945.0500
氯化钠	0.9mg/L	Carlo Erba	479687

氮源列于表11中。

表11

使粗硬春孔菌MY993在补充有氮源的单独培养基中并且在4至7的不同pH条件下生长，并且在30℃下使用培养摇动器以100rpm的搅拌速度温育。在第1天、3天、5天和7天收获来自不同条件的粗硬春孔菌MY993培养物滤液。然后通过0.22μm过滤器过滤培养物滤液，然后通过实施例3中所述的黑色素降解活性测定进行测试。

米糠和麦麸显示是比硝酸铵更好的增强剂。用麦麸作为替代用于增强黑色素降解酶制备的酵母提取物(表12)的最佳候选物。使用米糠和麦麸的培养物在4、5、5.5、6和7的pH下制备。通过使用氢氧化钠和盐酸进行pH调节。结果示于表13中。在第7天，在pH 5-6下制备的米糠和麦麸提高了黑色素降解活性。

表12：由补充有(pH 5.5)不同氮源的培养基收获的第1天、3天、5天和7天粗硬春孔菌MY993培养物滤液的黑色素降解活性

表12

表13：由不同pH下补充有米糠和麦麸的培养基收获的第1天、3天、5天和7天粗硬春孔菌MY993培养物滤液的黑色素降解活性。

表13

实施例8：培养物的搅拌速度的优化

使粗硬春孔菌MY993在pH 6.0下补充有麦麸的培养基中生长，并在30℃下使用培养摇动器以100rpm、200rpm的搅拌速度以及在静态条件下进行温育。

在第1天、3天、5天和7天收获来自不同条件的粗硬春孔菌MY993培养物滤液。通过0.22m过滤器过滤培养的滤液，然后通过上面实施例2中所述的测定法进行黑色素降解活性测定。

观察到100rpm的搅拌速度是用于增强粗硬春孔菌的黑色素降解酶制备的最佳条件(表14)。

表14：由不同搅拌条件收获的粗硬春孔菌第1天、第3天、第5天和第7天培养物滤液的黑色素降解活性。

表14

实施例9：葡萄糖和麦麸浓度的优化

使粗硬春孔菌MY993在补充有0.2g/L、1g/L、2g/L、5g/L、10g/L和20g/L的不同麦麸浓度以及2.5g/L、5g/L和10g/L的不同葡萄糖浓度的培养基中生长。在30℃下使用培养摇动器以100rpm的搅拌速度温育培养物。在第1天、3天、5天和7天收获来自不同条件的粗硬春孔菌培养物滤液。通过0.22m过滤器过滤培养物滤液，然后如上所述通过黑色素降解活性测定进行测试。

10g/L葡萄糖显示是用于增强粗硬春孔菌MY993的黑色素降解酶制备的最佳条件(表15)。

20g/L麦麸显示是用于增强粗硬春孔菌MY993的黑色素降解酶制备的最佳条件(表15)。在20g/L浓度下，培养物趋于过度生长，因此不适合用于大规模发酵，而是选择10g/L麦麸作为大规模(5L)制备的最终浓度。

表15：由补充有不同葡萄糖浓度的培养基收获的第1天、3天、5天和7天粗硬春孔菌MY993培养物滤液的黑色素降解活性。

表15

表16：由补充有不同麦麸浓度的培养基收获的第1天、3天、5天和7天粗硬春孔菌MY993培养物滤液的黑色素降解活性。

表16

实施例10：Melanoderm测试

使用可商购获得的着色表皮等效组织或来自MatTek Corp.的MelanoDerm^TM模型进行以下测试。MelanoDerm^TM模型由正常的人源性表皮角质细胞(NHEK)和黑色素细胞(NHM)组成，这些细胞已经过培养形成了多层、高度分化的人类表皮模型。具体地讲，在以下测试中采用了MEL-300-B组织，每个的直径均为9mm。每日将粗硬春孔菌培养物滤液局部施用于MelanoDerm^TM模型，并且实验持续8天。在第9天进行测量。通过用数码相机拍照，测出宏观和微观视觉组织颜色变深终点。使用分光光度计(Konica Minolta CM-2600d)测量各组织的明亮度(L值)。按照以下公式计算每个测试样品的ΔL(相比于对照的明亮度)：ΔL＝处理样品的L值-对照样品的L值。

测试四个样品—未经处理(未添加任何物质的皮肤模型)、空白培养基(不含真菌的细胞培养基)、MY993(1x—未稀释)和MY993(0.5x—用细胞培养基稀释一半的强度)。结果示于表17中，并且培养基琼脂平板和Meloderm模型的照片示于图3中。ΔL和Meloderm模型均显示根据本发明的提取物减少了色素沉着。因此，当施用于皮肤时，预期粗硬春孔菌的细胞培养物提取物将提供亮肤有益效果。

表17

样品	L	ΔL
			空白培养基	32.81
未经处理	35.7	-
			MY993(1x)	37.25	4.44
MY993(0.5x)	36.49	3.68

实施例11：

使用表18中所示的成分制备根据本发明的护肤组合物。

表18

表18中所示的组合物如下制备：将水添加到加工容器中。开始混合并添加羟乙基纤维素，并且继续混合直至羟乙基纤维素溶解。施加热并继续混合，直至温度达到85℃。添加甘油，同时继续混合并将温度保持在85℃。添加GENAMIN BTLF和Tego Amid S18，Brij721和Lanette C18 98-100MY、Savonol 82和Dow Corning AP 8087也是如此。在85℃下混合组合物持续另外的10-15分钟。随后从加热器中取出组合物，并且继续混合并冷却至40℃。

Claims (49)

1.一种增亮皮肤的方法，包括将组合物施用于需要增亮的人类皮肤，所述组合物包含美容上可接受的载体和亮肤有效量的粗硬春孔菌(Earliella scabrosa)细胞培养物提取物，所述方法是非治疗目的的。

2.根据权利要求1所述的增亮所述皮肤的方法，其中需要亮肤的所述人类皮肤选自因UV而颜色变深的皮肤、具有不均匀皮肤色调的皮肤、具有一个或多个色素斑、老年斑、日晒斑、雀斑、单纯性雀斑样痣、色素型日光性角化病、脂溢性角化病、黑斑病、痤疮斑痕以及它们中两个或更多个的组合的皮肤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中需要亮肤处理的所述人类皮肤选自具有一个或多个色素斑、老年斑、日晒斑、雀斑、痤疮斑痕以及它们中两个或更多个的组合的皮肤。

4.根据权利要求2所述的方法，其中需要亮肤处理的所述人类皮肤选自具有一个或多个黑色素斑、老年性雀斑、及其组合的皮肤。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含0.0001重量％至40重量％的粗硬春孔菌的所述细胞培养物提取物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组合物包含0.01重量％至25重量％的粗硬春孔菌的所述细胞培养物提取物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组合物包含0.1重量％至10重量％的粗硬春孔菌的所述细胞培养物提取物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物为以下形式：溶液、悬浮液、洗剂、霜膏、精华素、凝胶、棒剂、喷剂、软膏剂、洗液、皂条、洗发剂、毛发调理剂、糊剂、泡沫、粉末、摩丝、剃须膏、水凝胶或成膜产品。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用步骤包括将所述组合物从基质转移到所述皮肤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述基质包括擦拭物或面膜。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用步骤包括将包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物和另外的亮肤活性剂的组合物施用于所述皮肤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述施用步骤还包括将所述组合物从基质转移到所述皮肤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述基质包括擦拭物或面膜。

14.根据权利要求1所述的方法，还包括每日一次或两次将包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的组合物施用于需要亮肤的皮肤的步骤。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括将包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的两种或更多种不同组合物施用于需要亮肤的所述皮肤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中包含粗硬春孔菌的细胞培养物提取物的所述两种或更多种不同组合物独立地选自洗剂、清洁剂、贴膜、精华液、擦拭物、霜膏、精华素和凝胶。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述两种或更多种不同组合物中的一种是清洁剂，并且所述两种或更多种不同组合物中的另一种是洗剂或霜膏。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物提取物具有500U/ml至2000U/ml的黑色素降解活性。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞培养物提取物具有600U/ml至1800U/ml的黑色素降解活性。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞培养物提取物具有1000U/ml至1800U/ml的黑色素降解活性。

21.一种护肤组合物，包含美容上可接受的载体以及能有效增亮人类皮肤的量的粗硬春孔菌的细胞培养物提取物。

22.根据权利要求21所述的护肤组合物，其中所述组合物包含0.0001重量％至40重量％的粗硬春孔菌的所述细胞培养物提取物。

23.根据权利要求22所述的护肤组合物，其中所述组合物包含0.01重量％至25重量％的粗硬春孔菌的所述细胞培养物提取物。

24.根据权利要求23所述的护肤组合物，其中所述组合物包含0.1重量％至10重量％的粗硬春孔菌的所述细胞培养物提取物。

25.根据权利要求21所述的护肤组合物，还包含第二亮肤剂。

26.根据权利要求21所述的护肤组合物，其中所述护肤组合物为选自以下的形式：溶液、悬浮液、洗剂、霜膏、精华素、精华液、凝胶、调色剂、棒剂、喷剂、软膏剂、洗液、糊剂、泡沫、摩丝、粉末、剃须膏、擦拭物、贴片、带、水凝胶、成膜产品、面膜和皮肤贴膜。

27.根据权利要求21所述的护肤组合物，其中所述细胞培养物提取物具有500U/ml至2000U/ml的黑色素降解活性。

28.根据权利要求27所述的护肤组合物，其中所述细胞培养物提取物具有600U/ml至1800U/ml的黑色素降解活性。

29.根据权利要求28所述的护肤组合物，本文所述细胞培养物提取物具有1000U/ml至1800U/ml的黑色素降解活性。

30.根据权利要求25所述的护肤组合物，其中所述第二亮肤剂选自酪氨酸酶抑制剂、黑色素降解剂、PAR-2拮抗剂、剥脱剂、防晒剂、类视色素、抗氧化剂、氨甲环酸、氨甲环酸十六烷基酯盐酸盐、皮肤漂白剂、亚油酸、腺苷单磷酸二钠盐、母菊提取物、尿囊素、遮光剂、滑石、二氧化硅、锌盐以及它们的混合物。

31.一种在水性液体培养基中培养粗硬春孔菌的方法，包括以下步骤：(a)用粗硬春孔菌接种液体培养基，并且(b)将所述液体培养基与10g/ml至2000g/ml的量的诱导剂掺和。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述诱导剂选自合成黑色素、乌贼墨黑色素、3,4-二甲氧基苄醇、木质素、苄醇、肉桂酸、愈疮木酚、水杨酸甲酯、苯二酚、苯醌、没食子酸、水杨酸、丁子香酚、咖啡酸、二甲苯酚以及它们的混合物。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述诱导剂为3,4-二甲氧基苄醇。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述诱导剂为30mg/ml至1000mg/ml的量。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述诱导剂为200mg/ml至400mg/ml的量。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述诱导剂为245mg/ml至350mg/ml的量。

37.根据权利要求31所述的方法，还包括将所述液体培养基的pH保持在5至6之间。

38.根据权利要求31所述的方法，还包括向所述液体培养基中添加氮源。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述氮源选自米糠、麦麸、硝酸铵、酵母提取物或它们的混合物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述氮源以0.1g/L至25g/L的量添加到所述培养基中。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述氮源以0.2g/l至20g/L的量添加到所述培养基中。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述氮源以5g/L至20g/L的量添加到所述培养基中。

43.根据权利要求31所述的方法，还包括用培养摇动器以100rpm至200rpm的速率搅拌所述液体培养基。

44.根据权利要求31所述的方法，还包括向所述液体培养基中添加碳源。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述碳源选自葡萄糖、右旋糖或它们的混合物。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述碳源以2.0g/L至20g/L的量添加到所述液体培养基中。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述碳源以5.0g/l至15g/L的量添加到所述液体培养基中。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述碳源以5g/L至10g/L的量添加到所述培养基中。

49.根据权利要求31所述的方法，还包括用筛网过滤所述液体培养基。

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