CN111771621A - 一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法 - Google Patents
一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111771621A CN111771621A CN202010733738.4A CN202010733738A CN111771621A CN 111771621 A CN111771621 A CN 111771621A CN 202010733738 A CN202010733738 A CN 202010733738A CN 111771621 A CN111771621 A CN 111771621A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- culture
- bioreactor
- fermentation
- precipitate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 48
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 240000001462 Pleurotus ostreatus Species 0.000 title claims abstract description 29
- 235000001603 Pleurotus ostreatus Nutrition 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 241000246044 Sophora flavescens Species 0.000 title claims abstract description 14
- 239000013049 sediment Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 50
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 50
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000002926 oxygen Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000007685 Pleurotus columbinus Nutrition 0.000 claims description 7
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 8
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 abstract description 7
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 10
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- ZSBXGIUJOOQZMP-UHFFFAOYSA-N Isomatrine Natural products C1CCC2CN3C(=O)CCCC3C3C2N1CCC3 ZSBXGIUJOOQZMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZSBXGIUJOOQZMP-JLNYLFASSA-N Matrine Chemical compound C1CC[C@H]2CN3C(=O)CCC[C@@H]3[C@@H]3[C@H]2N1CCC3 ZSBXGIUJOOQZMP-JLNYLFASSA-N 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 229930014456 matrine Natural products 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- WFLQENPHTVNLGT-YJNKXOJESA-N matrinol Chemical compound C1CC[C@@H]2[C@@H](CCCCO)NC[C@H]3[C@@H]2N1CCC3 WFLQENPHTVNLGT-YJNKXOJESA-N 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 206010058019 Cancer Pain Diseases 0.000 description 1
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G18/00—Cultivation of mushrooms
- A01G18/40—Cultivation of spawn
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G18/00—Cultivation of mushrooms
- A01G18/20—Culture media, e.g. compost
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Mushroom Cultivation (AREA)
Abstract
本发明涉及一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，将复方苦参醇沉物水解液放入生物反应器中，进行实罐灭菌，将摇瓶种子培养物接种到生物反应器中，将生物反应器中的培养温度控制在28℃，保持pH为5.5，向生物反应器中供应过滤后的无菌空气，培养液中的溶解氧浓度保持在饱和氧浓度的30％，发酵进行72h，将补料培养基恒速注入生物反应器中，补料量为发酵培养基的1/5，补料时长为40h，空气流速随反应器体积的增加而增加，以维持0.4vvm，补料结束后继续培养8h，发酵结束；该方法以复方苦参醇沉物为材料，对其进行酸热预处理后，作为发酵碳源用于平菇菌丝体的液体培养；在发酵过程中，通过补料分批培养以提高菌丝体生物量。
Description
技术领域
本发明涉及生产食用菌菌种的技术领域，具体为利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法。
背景技术
复方苦参注射液又名岩舒注射液，由苦参、白土苓经渗漉、醇沉和活性炭脱色等工艺提取精制而成，具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛之功效，临床主要用于抗癌、缓解癌痛及出血、提高人体免疫功能等。复方苦参醇沉物(KP)是在生产复方苦参注射液过程中的醇沉环节产生的泥状沉淀物，目前基本作为废料被弃掉，造成了资源浪费和环境污染，中药的水提醇沉物含有大量的多糖及蛋白质等微生物可以利用的营养成分，可用于食用菌菌丝体的液体培养，从而实现中药渣的资源化与无害化利用。目前蘑菇菌种的制备过程大多是通过固态发酵生产谷物菌种，然后在蘑菇栽培中使用谷物菌种，然而制备谷物菌种需要较长的生长期并且具有较高的污染风险，液体发酵产生菌丝体是制备蘑菇菌种的另一种方法。液体菌种发酵时间短，可以比固体菌种更均匀地分散在基质中，并可以在相对更严格的无菌条件下实现工业规模生产的自动化接种。然而，在蘑菇液体菌种的生产过程中，基本采用分批发酵的方式进行，菌丝体产量较低，在对基质接种时则接种量较大。
补料分批发酵在微生物高密度液体培养中应用较多，特别是应用在重组大肠杆菌的高密度培养中技术已相当成熟。由于可以保持培养液中的底物浓度在培养过程中处于低水平，避免了前期高浓度底物抑制或后期低浓度底物抑制，从而使微生物培养获得高密度。然而，到目前为止，还没有通过补料分批方法对平菇菌丝体进行高密度培养的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法。以复方苦参醇沉物为材料，对其进行酸热预处理后，作为发酵碳源用于平菇菌丝体的液体培养；在发酵过程中，通过补料分批培养以提高菌丝体生物量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，包括以下步骤：
S1：将发酵培养基入生物反应器中，进行实罐灭菌，而后冷却至28℃；
所述发酵培养基包括以下成分：复方苦参醇沉物水解液200mL/L、米糠4g/L，酵母提取物4g/L、麦芽提取物4g/L；
S2：以按体积的10％的接种量将摇瓶种子培养物接种到生物反应器中；
S3：将生物反应器中的培养温度控制在28℃，初始pH为5.5，当pH偏离预设值5.5时，添加NaOH或H2SO4；
S4：向生物反应器中供应过滤后的无菌空气，通气比为0.4vvm，培养液中的溶解氧浓度保持在饱和氧浓度的30％；
S5：发酵进行72h，将补料培养基恒速注入生物反应器中，补料量为发酵培养基的1/5，补料时长为40h，，所述补料培养基为复方苦参醇沉物水解液，空气流速随反应器体积的增加而增加，以维持0.4vvm；
S6：补料结束后继续培养8h，发酵结束。
步骤S1中所述复方苦参醇沉物水解液的制备，采用的是酸热处理方式，包括以下步骤：
1)用蒸馏水将复方苦参醇沉物按重量比稀释5倍，获得复方苦参醇沉物溶液；
2)用4mol/L的H2SO4将复方苦参醇沉物溶液的pH调节至3.0；
3)在高温高压反应釜中于120℃下加热20min；
4)在室温下保持过夜；
5)以6,000rpm离心10min，离心后所得上清液为复方苦参醇沉物水解液。
步骤S2中所述摇瓶种子培养物的制备，包括以下步骤：
1)将摇瓶培养基分装于250mL三角瓶中，每瓶装量100mL；
2)八层纱布对三角瓶进行封口；
3)121℃高压灭菌20min后冷却；
4)通过从活化培养基平板上冲出直径为1cm的平菇菌丝体琼脂块5块接种到摇瓶培养基中；
5)在恒温振荡器中25±1℃的条件下以150rpm的转速孵育5d。
优选的，步骤1中所述摇瓶培养基的成分包括：葡萄糖20g/L、米糠4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物4g/L；
优选的，步骤4中所述活化培养基的成分包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、复方苦参醇沉物含有大量的多糖及蛋白质等成分，是微生物可以利用的营养物质，可用于食用菌菌丝体的液体培养，本发明以复方苦参醇沉物为材料，对其进行酸热预处理后，复方苦参醇沉物水解液中的还原糖含量达到105.6g/L，可作为发酵碳源用于食用菌菌丝体的发酵生产。
2、本发明采用的是酸热预处理方式得到复方苦参醇沉物水解液，便于微生物后期的营养利用
3、本发明将食用菌菌丝体的液体培养技术应用到蘑菇液体菌种的制备，采用的是补料分批的高密度培养方式，会显著增加菌丝体的生物量。
4、相较于传统的液体发酵采用的培养基原料大多是农副产品，本专利采用制药工业的副产品复方苦参醇沉物作为基础培养基，变废为宝，促进了制药工业的绿色可持续发展。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，包括以下步骤：
S1：对发酵培养基进行实罐灭菌，本实施例的生物反应器采用的是10L机械搅拌式发酵罐，放入初始体积为5L的发酵培养基，灭菌后冷却至28℃，其中发酵培养基包括以下成分：复方苦参醇沉物水解液200mL/L、米糠4g/L，酵母提取物4g/L、麦芽提取物4g/L。
上述复方苦参醇沉物水解液的制备，采用的是酸热处理方式，包括以下步骤：
1)用蒸馏水将复方苦参醇沉物按重量比稀释5倍，获得复方苦参醇沉物溶液；
2)用4mol/L的H2SO4将复方苦参醇沉物溶液的pH调节至3.0；
3)在高温高压反应釜中于120℃下加热20min；
4)在室温下保持过夜；
5)以6,000rpm离心10min，离心后所得上清液为复方苦参醇沉物水解液。
S2：以按体积的10％的接种量将摇瓶种子培养物接种到生物反应器中，本实施例中所用菌株为一株平菇菌株，该菌株在活化培养基平板上进行菌种的活化。
其中，摇瓶种子培养物的制备，包括以下步骤：
1)将摇瓶培养基分装于250mL三角瓶中，每瓶装量100mL，其中，摇瓶培养基的成分包括：葡萄糖20g/L、米糠4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物4g/L
2)八层纱布对三角瓶进行封口：
3)121℃高压灭菌20min后冷却；
4)通过从活化培养基平板上冲出直径为1cm的菌丝体琼脂块5块接种到摇瓶培养基中，其中，活化培养基的成分包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L；
5)在恒温振荡器中25℃的条件下以150rpm的转速孵育5d。
S3：将生物反应器中的培养温度控制在28℃，初始pH为5.5，利用冷水循环通过生物反应器周围的夹套来保持温度，变速电动机为搅拌器提供动力，使用自动pH控制来控制发酵培养基的pH，从而当pH偏离预设值5.5时，添加0.5mol/L NaOH或0.5mol/L H2SO4；
S4：向生物反应器中供应过滤后的无菌空气，空气流速为2L/min(0.4vvm)，使用复膜氧电极监测溶解氧，该电极连接到计算机系统以进行数据采集，通过自动控制搅拌速度，将培养液中的溶解氧(DO)浓度保持在饱和氧浓度的30％处；
S5：发酵进行72h后，用蠕动泵以25mL/h的流速将补料液储罐中新鲜的补料培养基注入生物反应器中，维持40h，发酵液的最终体积为6L，其中补料培养基为复方苦参醇沉物水解液，空气流速随反应器体积的增加而增加，以维持0.4vvm；
S6：将补料后的培养液继续培养8h后发酵结束。
下面对复方苦参醇沉物(KP)的成分进行分析：
KP是在复方苦参注射液生产过程中在醇沉环节产生的泥状沉淀物，其中含有大量的多糖及蛋白质等成分。
表1 KP中的主要成分(g/100g)
表1中，粗蛋白含量通过凯氏定氮法测定，并使用6.25的转换因子进行计算；总糖含量通过硫酸-苯酚法测定；还原糖含量通过二硝基水杨酸(DNS)方法测定；不溶性成分由100减去总糖和粗蛋白含量得到。
通过对KP中总糖、还原糖的测定，可知总糖含量约占58.4％，但还原糖含量仅占18.2％。从数据可看出，KP作为发酵碳源具有很大的潜力。多糖是食用菌生长的长效碳源，不能被食用菌直接吸收利用，而必须先将多糖分解为单糖、双糖方可被吸收利用，因此作为发酵碳源前需要对KP进行水解，使其中的总糖转化为更多的食用菌可利用的还原糖。
对KP进行酸热处理后，测定KP水解液中的还原糖含量高达105.6g/L，可作为发酵碳源用于食用菌菌丝体的发酵生产。
下面对自动化生物反应器中平菇菌丝体的生长参数进行测定：
在一定的时间间隔(24h)对生物反应器中的发酵液进行采样(10mL)。样品在6300rpm下离心10min，从发酵液中分离菌丝体。用蒸馏水反复洗涤后，将菌丝沉淀物在70℃下干燥至恒重，即为菌丝体干重。通过二硝基水杨酸(DNS)方法测定上清液中还原糖浓度，并表示为葡萄糖当量。将发酵液中的新鲜沉淀样品置于载玻片上，测量50个菌丝球的直径大小并计算平均值。
表2补料分批发酵过程中的菌丝体生物量、还原糖浓度和菌丝球直径
表2中指出，平菇菌丝体的补料分批发酵过程中，每隔24h进行一次取样分析，分析样品的生物量产生，糖浓度降低和菌丝球直径。分批发酵阶段(0-72h阶段)，在72h时获得11.64g/L的菌丝体干重，菌丝球直径达到1.98mm；发酵液中的还原糖含量从最初的22.86g/L降至4.63g/L。
为了延长菌丝体的对数生长期并满足微生物对营养物质的需求，于72h时向发酵液中连续流加KP水解液，流加40h。在补料发酵阶段(72h～112h阶段)，96h测得还原糖含量回升至8.57g/L，至120h发酵结束时还原糖含量仅为3.28g/L。
相比分批发酵方式，采用补料分批发酵方式生产平菇液体菌种，不仅可以避免分批发酵中一次性投料过多而引起的底物抑制效应，而且可以防止发酵后期营养物质的不足对菌体生长的限制，因此补料分批发酵常应用于微生物的高密度培养。本发明中，通过对平菇菌丝体120h的补料分批培养，菌丝球达到2.64mm的最大颗粒直径，并相应获得了最大的生物量15.75g/L。如继续延长培养时间，生物量和菌丝球直径都出现下降。
下面对平菇液体菌种在玉米芯栽培料上的定殖率和子实体产量进行分析：
栽培基质由90％的玉米芯，10％的麦麸和1％的CaCO3组成，将基材的水分含量调节至65％左右。将约2.5kg湿底物(相当于1kg干底物)放入可高温高压灭菌的聚丙烯袋(24cm×48cm)中，并在121℃下灭菌2h。然后将生物反应器中收获的液体菌种50mL从袋子两端接种到基质中。
为了比较谷物菌种与液体菌种在接种后菌丝体生长和子实体产量等方面的差异，将谷物菌种50g接种到无菌袋装基质中，作为对照。
谷物菌种的制备，采用高压蒸煮聚丙烯袋，加入煮熟的小麦粒、0.5％碳酸钙和1％米糠(以干重计，w/w)制备谷物菌种。袋子在121℃灭菌80min，然后接种活化的菌丝体琼脂块(直径1cm)。在25℃和70％的相对湿度下培养，直到基质完全定植。
菌丝体对底物的定殖是在发菌室中于25±2℃和相对湿度70％的黑暗环境中进行的。完全定殖后，将袋子运送到种植室。为了刺激原基形成，温度和相对湿度分别控制在18℃和80％-85％，每天光照8h。原基出现后，将袋子的顶部打开。对于子实体的发育，温度20-22℃和相对湿度85％-90％得以维持，同时每天提供12h的光照。当观察到蘑菇帽的卷入边缘变平时，分三次收获子实体。子实体的产量表示为生物学效率，以蘑菇鲜重相对于相应基质干重的百分比计算。
表3菌丝体定植速度和平菇子实体的产量
将50mL液体菌种接种于玉米芯基质中，将平菇的菌丝定殖速度与作为接种物的谷物菌种(50g)进行了比较，如表3所示。与谷物菌种(6.1mm/d)相比，在玉米芯基质中，采用液体种子接种加快了菌丝体的生长(7.6mm/d)。因此，相比于传统的谷物菌种(菌丝定植期为33d)，液体菌种完成菌丝定植所需的时间更短，仅需28d。
原基形成是在发菌完成后蘑菇培养的第二阶段，可以观察到小的针头状结构，一般在发菌结束后的6至7天之间形成。子实体的形成是蘑菇栽培的第三阶段。在本发明中，采用液体菌种接种的菌包采收的子实体鲜重显著高于谷物菌种接种的菌包，其产量为1085g/kg。与使用谷物菌种相比，使用液体菌种获得的生物学效率更高。
通过对复方苦参醇沉物进行酸热处理，所得水解液作为发酵碳源对平菇菌丝体进行120h的补料分批液态发酵，菌丝球达到2.64mm的最大颗粒直径，并相应获得了最大的生物量(15.75g干菌丝体/L)。
采用该液体菌种接种玉米芯袋装基质，采收的平菇子实体鲜重显著高于谷物菌种，其产量达到1085g/kg。因此，在平菇栽培中使用液体菌种获得了更高生物学效率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：将发酵培养基加入生物反应器进行实罐灭菌，而后冷却至28℃；
所述发酵培养基包括以下成分：复方苦参醇沉物水解液200mL/L、米糠4g/L，酵母提取物4g/L、麦芽提取物4g/L；
S2：以按体积的10％的接种量将摇瓶种子培养物接种到生物反应器中；
S3：将生物反应器中的培养温度控制在28℃，初始pH为5.5，当pH偏离预设值5.5时，添加NaOH或H2SO4；
S4：向生物反应器中供应过滤后的无菌空气，通气比为0.4vvm，培养液中的溶解氧浓度保持在饱和氧浓度的30％；
S5：发酵进行72h后，将补料培养基恒速注入生物反应器中，补料量为发酵培养基的1/5，补料时长为40h，所述补料培养基为复方苦参醇沉物水解液，空气流速随反应器体积的增加而增加，以维持0.4vvm；
S6：补料结束后继续培养8h，发酵结束。
2.根据权利要求1所述的一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，其特征在于：步骤S1中所述复方苦参醇沉物水解液的制备，采用的是酸热处理方式，包括以下步骤：
1)用蒸馏水将复方苦参醇沉物按重量比稀释5倍，获得复方苦参醇沉物溶液；
2)用4mol/L的H2SO4将复方苦参醇沉物溶液的pH调节至3.0；
3)在高温高压反应釜中于120℃下加热20min；
4)在室温下保持过夜；
5)以6,000rpm离心10min，离心后所得上清液为复方苦参醇沉物水解液。
3.根据权利要求1所述的一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，其特征在于：步骤S2中所述摇瓶种子培养物的制备，包括以下步骤：
1)将摇瓶培养基分装于250mL三角瓶中，每瓶装量100mL；
2)八层纱布对三角瓶进行封口；
3)121℃高压灭菌20min后冷却；
4)通过从活化培养基平板上冲出直径为1cm的平菇菌丝体琼脂块5块接种到摇瓶培养基中；
5)在恒温振荡器中25±1℃的条件下以150rpm的转速孵育5天。
4.根据权利要求3所述的一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，其特征在于：步骤1中所述摇瓶培养基的成分包括：葡萄糖20g/L、米糠4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物4g/L。
5.根据权利要求3所述的一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法，其特征在于：步骤4中所述活化培养基的成分包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010733738.4A CN111771621A (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010733738.4A CN111771621A (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111771621A true CN111771621A (zh) | 2020-10-16 |
Family
ID=72765133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010733738.4A Pending CN111771621A (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111771621A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102010316A (zh) * | 2009-09-04 | 2011-04-13 | 中国药科大学 | 一种从虎杖中提取高纯度大黄素的方法 |
| KR20140064514A (ko) * | 2012-11-20 | 2014-05-28 | (주)큐젠바이오텍 | 베타-글루칸 고함량 꽃송이버섯 균사체의 유가식 배양을 통한 대량생산 방법 |
| CN104920069A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-23 | 天津中天精科科技有限公司 | 一种高密度液体菌种及其发酵方法 |
| CN107047066A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-08-18 | 大悟鸿源农业科技有限公司 | 一种低成本灵芝培育方法 |
| CN107213173A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-09-29 | 独山县军鹏农产品有限责任公司 | 一种多糖含量高的灵芝的加工方法 |
| CN108697630A (zh) * | 2015-09-29 | 2018-10-23 | 强生消费者公司 | 使用粗硬春孔菌细胞培养物提取物增亮皮肤的方法和组合物 |
| CN109479622A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-03-19 | 江苏强农农业技术服务有限公司 | 一种茶树菇菌种工厂化生产方法 |
-
2020
- 2020-07-20 CN CN202010733738.4A patent/CN111771621A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102010316A (zh) * | 2009-09-04 | 2011-04-13 | 中国药科大学 | 一种从虎杖中提取高纯度大黄素的方法 |
| KR20140064514A (ko) * | 2012-11-20 | 2014-05-28 | (주)큐젠바이오텍 | 베타-글루칸 고함량 꽃송이버섯 균사체의 유가식 배양을 통한 대량생산 방법 |
| CN104920069A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-23 | 天津中天精科科技有限公司 | 一种高密度液体菌种及其发酵方法 |
| CN108697630A (zh) * | 2015-09-29 | 2018-10-23 | 强生消费者公司 | 使用粗硬春孔菌细胞培养物提取物增亮皮肤的方法和组合物 |
| CN107213173A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-09-29 | 独山县军鹏农产品有限责任公司 | 一种多糖含量高的灵芝的加工方法 |
| CN107047066A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-08-18 | 大悟鸿源农业科技有限公司 | 一种低成本灵芝培育方法 |
| CN109479622A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-03-19 | 江苏强农农业技术服务有限公司 | 一种茶树菇菌种工厂化生产方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102050673B (zh) | 食用菌木株母种培养基的制备方法及其产品 | |
| CN104478515B (zh) | 用于培养杏鲍菇基质的发酵液、杏鲍菇培养基及其制备方法 | |
| CN106434373A (zh) | 一种绣球菌的高密度发酵培养基配方及其医药级葡聚糖制备方法 | |
| CN107488598B (zh) | 一种牛蒡基蛹虫草菌丝体及其制备方法 | |
| CN104845896B (zh) | 生产威兰胶的菌株及方法 | |
| CN112021073A (zh) | 一种羊肚菌外援营养袋配料、营养袋及其制备方法 | |
| CN113455286B (zh) | 高底物浓度发酵玉米浆产物在食用菌栽培生产中的应用 | |
| CN105724055B (zh) | 一种利用金针菇菌渣提高双孢蘑菇产量的方法 | |
| CN104789492A (zh) | 巨大芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN104541967A (zh) | 一种用于提取香菇多糖的香菇菌丝体的生产方法 | |
| CN103992977A (zh) | 一种高密度发酵培养枯草芽孢杆菌的方法 | |
| CN111394257B (zh) | 一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备哈茨木霉菌种的方法 | |
| CN103005437B (zh) | 一种固体培养制备富硒麦麸食用菌营养粉的方法 | |
| CN114015579B (zh) | 一种高产β-葡聚糖的出芽短梗霉及其应用 | |
| CN113079951B (zh) | 一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法 | |
| CN111771621A (zh) | 一种利用复方苦参醇沉物生产平菇液体菌种的方法 | |
| CN1264969C (zh) | 用于农业废弃物处理的发酵菌剂及其制备方法 | |
| CN112779295B (zh) | 一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基 | |
| CN112616556B (zh) | 一种实验室智能化栽培管理提高桑黄栽培效率的方法 | |
| CN112522114B (zh) | 蛹虫草菌糠提取液和灵芝发酵产物及其制备方法和应用 | |
| CN107926482A (zh) | 一种利用液体培养基生产蛹虫草子实体的方法 | |
| KR101063754B1 (ko) | 참바늘버섯의 인공재배방법 | |
| CN112772282A (zh) | 一种蛹虫草的培育方法 | |
| CN100338211C (zh) | 农业废弃物发酵菌剂及其制备方法 | |
| CN106797801A (zh) | 一种蝉花的人工培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |