CN107227312B - 提高丹参毛状根中丹酚酸b含量的方法及漆酶基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，其特征在于，通过在丹参毛状根中过表达丹参漆酶SmLAC7基因或丹参漆酶SmLAC20基因从而得到丹酚酸B含量提高的转基因丹参毛状根，包括如下步骤：步骤S1，构建含有丹参漆酶SmLAC7基因或含有丹参漆酶SmLAC20基因的过表达载体；步骤S2，将步骤S1得到的过表达载体转染入农杆菌，得到重组农杆菌；步骤S3，用步骤S2得到的重组农杆菌转化丹参组织并诱导发根，获得转基因丹参毛状根，其中，丹参漆酶SmLAC7基因的序列如SEQ ID No：1所示，丹参漆酶SmLAC20基因的序列如SEQ ID No：2所示。

Description

提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法及漆酶基因
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，以及在该方法中应用的漆酶基因。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种重要的中药材，包含多种有效成分。其中，丹酚酸B是研究得较多的一种，具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管系统等多种药理作用。
目前，丹酚酸B的获得主要依赖于从丹参的干燥根中提取。然而，自然状态下丹参根部的丹酚酸B含量较低，使得丹参根部提取物中的丹酚酸B含量也不够理想，影响了其药用价值。
研究表明，丹参体内酚酸类化合物共用同一个生物途径。在丹酚酸B的生物合成过程(生物合成过程参见附图1)中，迷迭香酸(RA)是丹酚酸B(SAB)的直接前体，并且该转化过程关系到丹参中SAB的最终含量。
发明内容
本发明的发明人在发现前述SAB生物合成过程的基础上进行了体外酶转化试验，发现漆酶能够将RA转化为SAB。发明人进一步发现，丹参体内有多种疑似漆酶的基因，但其中仅有少数对SAB的含量具有影响。
基于上述发现，为了提高丹参体内，尤其是丹参毛状根内的丹酚酸B含量，发明人提出了如下技术方案：
本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，其特征在于，通过在丹参毛状根中过表达丹参漆酶SmLAC7基因或丹参漆酶SmLAC20基因从而得到丹酚酸B含量提高的转基因丹参毛状根，包括如下步骤：
步骤S1，构建含有丹参漆酶SmLAC7基因或含有丹参漆酶SmLAC20基因的过表达载体；
步骤S2，将步骤S1得到的过表达载体转染入农杆菌，得到重组农杆菌；
步骤S3，用步骤S2得到的重组农杆菌转化丹参组织并诱导发根，获得转基因丹参毛状根，
其中，丹参漆酶SmLAC7基因的序列如SEQ ID No：1所示，丹参漆酶SmLAC20基因的序列如SEQ ID No：2所示。
本发明提供的提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，还可以具有这样的技术特征，其中，过表达载体为含有丹参漆酶SmLAC7基因的过表达载体，其序列如SEQ ID No：4所示。
本发明提供的提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，还可以具有这样的技术特征，其中，过表达载体为含有丹参漆酶SmLAC20基因的过表达载体，其序列如SEQ ID No：5所示。
进一步，本发明还提供了一种用于提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的丹参漆酶基因序列，其特征在于：其中，丹参漆酶基因序列为丹参漆酶SmLAC7基因序列，其序列如SEQID No：1所示。
进一步，本发明还提供了一种用于提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的过表达载体，其特征在于：其中，过表达载体含有丹参漆酶SmLAC7基因序列，该过表达载体的基因序列如SEQ ID No：4所示。
进一步，本发明还提供了一种用于提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的丹参漆酶基因序列，其特征在于：其中，丹参漆酶基因序列为丹参漆酶SmLAC20基因，其序列如SEQ IDNo：2所示。
进一步，本发明还提供了一种用于提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的过表达载体，其特征在于：其中，过表达载体含有丹参漆酶SmLAC20基因序列，该过表达载体的基因序列如SEQ ID No：5所示。
发明作用与效果
根据本发明的提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法及漆酶基因，将丹参中的漆酶基因SmLAC7或SmLAC20与载体连接并通过农杆菌转入丹参并诱导，就能够得到丹酚酸B含量提高的转基因丹参毛状根，提升丹参的药用价值。
具体实施方式
以下结合实施例来说明本发明的具体实施方式。在下述各实施例中，所采用的试剂、酶及试剂盒如无特殊说明均从一般商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商的建议条件。另外，以下实施例所采用的无菌丹参苗由丹参种子培育而得，该丹参种子的来源为发明人所在课题组从陕西商洛天士力GMP种植基地购买自行保存的紫花丹参。
实施例1：漆酶基因序列的扩增
本实施例的目的是从丹参中获得疑似漆酶基因的基因片段，并进行扩增，得到扩增后的相关基因片段以备转化，包括如下步骤：
步骤1-1，从丹参中提取总RNA，其操作方法参考TRANSGENE的TransZol UP PlusRNA Kit总RNA提取试剂的使用手册，包括如下子步骤：
步骤1-1-1，将在培养室中生长10周的无菌丹参苗在超净台中剪下叶片，保存液氮中；
步骤1-1-2，在叶片中加入液氮快速研磨成细粉状，立即将粉末分装于预先加入TRNzol-UP的eppendorf管中，每50mg-100mg叶片使用1mL TRNzol-UP；
步骤1-1-3，用匀浆仪混匀，室温静置5min，加入0.2mL氯仿4℃10,000×g离心15min，混合液将分为三层，将上层无色水相转移到新的离心管中，加入等体积(约600μL)乙醇，轻轻混匀；
步骤1-1-4，将得到的溶液和沉淀一起加入到离心柱中，室温1200×g离心30sec，弃去流出液(若液体大于0.8mL，则分几次离心)；
步骤1-1-5，向离心柱中加入0.5mLCB9，室温1200×g离心30sec，弃掉流出液，并重复该操作一次；
步骤1-1-6，向离心柱中加入0.5mLWB9(使用前需要加入无水乙醇)，室温1200×g离心30sec，弃掉流出液，并重复该操作一次；
步骤1-1-7，室温1200×g离心2min，在室温静置2min，彻底除去柱子中残留的乙醇；
步骤1-1-8，向离心柱中加入50-100μL RNase-free H2O，放置于RNase-free Tube中，室温静置1min；
步骤1-1-9，室温1200×g离心2min，洗脱RNA，于－80℃保存。
步骤1-2，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度与纯度，具体包括如下子步骤：
步骤1-2-1，在电子天平上称取0.25g琼脂糖粉末于30mL 1×TAE中加热溶解，使用溴化乙锭(EB)作为荧光染色剂，倒入插好孔板的制胶槽中冷却；
步骤1-2-2，将RNA 2.5μL，10×Loading Buffer 1μL用枪头混匀后上样，设置电压为140V，电泳15min；
步骤1-2-3，采用凝胶成像系统对电泳后的凝胶进行检测，结果可以清晰地看到三条带(28sRNA、18sRNA、5sRNA)，理论上讲28S条带的亮度应该为18S条带亮度的1～2倍。
步骤1-2-4，使用NANO DROP2000超微量分光光度计直接测定RNA的浓度：吸取2μLRNase-free H2O作为背景溶液进行Blank测定，然后吸取待测的RNA溶液，根据波长260nm与280nm处的吸光度的比值测定总RNA浓度(μg/μL)(其中，OD260/OD280在1.8～2.0之间为佳)。
步骤1-3，以丹参总RNA为模板，参照北京全式金生物有限公司TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒的操作说明合成cDNA，反应体系如下表1-1所示：
表1-1 合成cDNA的反应体系
Figure BDA0001321613470000031
反应条件为42℃孵育30min、85℃加热5min，得到的cDNA保存在-80℃。
步骤1-4，获得疑似漆酶的基因，包括如下子步骤：
步骤1-4-1，序列比对：将丹参转录组数据库中的基因序列通过与多个物种(拟南芥、小麦、白杨等)的漆酶基因进行同源性比对，再经过序列拼接和注释，获得三个疑似漆酶基因的开放阅读框(ORF)序列，并设计引物序列，设计得到的引物序列见下表1-2。
表1-2 Smlacs基因的相关引物序列表
Figure BDA0001321613470000032
步骤1-4-2，通过RT-PCR，获得疑似漆酶的目的基因。其中，目的基因的数量为三个，以下将该三个疑似漆酶基因分别称为Smlac7、Smlac20和Smlac28。
RT-PCR的过程如下：
取150μL离心管，使用北京全式金生物技术有限公司Trans Start FastPfu FlyDNA Polymerase试剂盒进行扩增，反应体系如下表1-3所示：
表1-3 RT-PCR的反应体系
cDNA 1μL
SmlacF(10μmol/L) 1μL
SmlacR(10μmol/L) 1μL
dNTPs 10μL
FastPfu Fly buffer 5μL
FastPfu Fly Polymerase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 31μL
总体积 50μL
PCR反应条件如下：
Figure BDA0001321613470000041
采用琼脂糖凝胶电泳，分离并回收目的基因片段(Smlac7为1689bp，Smlac20为1707bp，Smlac28包含三个片段，分别为750bp、751bp、529bp)。
步骤1-5，将目的基因连接载体并转化大肠杆菌，操作方法为：
将Blunt-Zero载体与胶回收产物按照1:4的比例混合在25℃放置25min。从-80℃冰箱中取出保存完好的Trans1T1感受态细胞，冰浴融化；将连接产物加入50μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴25min；在42℃的水浴锅中热激90sec，迅速放入冰中静置2min；加入500μL无抗的LB培养基，在37℃的摇床200rpm震荡1h；将菌液吸到含75mg/L卡钠霉素的LB培养基平板上，用无菌涂布器将菌液均匀展开；倒置于37℃恒温培养箱培养13～15h。
步骤1-6，采用PCR检测大肠杆菌的阳性克隆，操作方法为：
在8个无菌的离心管中加入1ml的LB液体培养基(含有75mg/L卡钠霉素)，随机取8个独立的菌体于离心管中恒温摇床震荡，37℃、200rpm培养3～4h，菌液作为下一步PCR模板。
反应体系如下表1-4所示：
表1-4 检测大肠杆菌阳性克隆的PCR反应体系
Figure BDA0001321613470000042
PCR反应程序设定如下：
Figure BDA0001321613470000043
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，对于含有目的片段的菌液，各取100μL送测序。测序正确的菌液活化后加入甘油于-80℃冰箱保存菌种。
如上所述，经过总RNA提取、cDNA合成以及RT-PCR，从丹参基因组中获得了三个疑似漆酶的目的基因Smlac7、Smlac20和Smlac28，其中Smlac7的序列如SEQ ID No：1所示，Smlac20的序列如SEQ ID No：2所示，Smlac28的序列如SEQ ID No：3所示。该三个目的基因具有与其他物种漆酶基因的高同源性，且各自具有相应的开放阅读框，能够编码相应的酶蛋白，因此属于漆酶基因。
实施例2：构建过表达载体
本实施例的目的在于从实施例1中得到的含有目的基因的大肠杆菌中获取目的基因，并将三个目的基因分别与PHB-flag载体连接，构建得到含有目的基因的过表达载体，包括以下步骤：
步骤2-1，设计引物，对目的片段进行克隆。
其中，PCR引物设计原则为：选取PHB-flag上含有的的单克隆酶切位点且该酶切位点在基因的ORF区上不存在，同时去掉目的基因的终止密码子。设计得到的引物序列如下表2-1所示。表2-1中，斜体部分表示酶切位点。
表2-1 克隆目的片段所用的引物
Figure BDA0001321613470000051
PCR反应体系如下表2-2所示：
表2-2 克隆目的片段所用的PCR反应体系
含目的基因的质粒 1μL
SmlacsOVXF 0.5μL
SmlacsOVXR 0.5μL
5Buffer 5μL
2.5mMdNTPs 2.5μL
PCR Stimulant 5μL
FastPfu Fly Polymerase 1.5μL
ddH<sub>2</sub>O 9μL
总体积 25μL
PCR程序设置为：
Figure BDA0001321613470000052
PCR结束后进行凝胶电泳，回收目的片段，连接Bunt-Zero转化Trans1-T1后涂卡那霉素抗性平板，菌检有目的条带者送测序。测序正确者提取质粒保存于-20℃。
步骤2-2，对目的基因质粒和载体进行双酶切，反应体系如下表2-3所示：
表2-3 双酶切的反应体系
PHB-flag载体质粒或目的基因质粒 30μL
酶1 1.5μL
酶2 1.5μL
Buffer 5μL
ddH<sub>2</sub>O 12μL
总体积 50μL
将酶切后的片段(载体切大片段，目的基因切小片段)进行凝胶电泳，并回收。
步骤2-3，将目的基因质粒和载体进行连接正向目的片段和载体酶切片段以摩尔质量的比例为1:10进行连接，连接体系见下表2-4所示：
表2-4 目的片段和载体片段连接的反应体系
载体片段 2μL
目的片段双酶切产物 8μL
T4连接Buffer 3μL
T4DNA Ligase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 6μL
总计 20μL
采用上述反应体系，25℃连接1h后，转入Trans1-T1感受态细胞，并涂卡那霉素抗性的平板。挑选阳性菌株送测序，测序正确者提取质粒保存于-20℃冰箱，待转化农杆菌。
如上所述，经过PCR、载体及目的基因双酶切以及连接，从实施例1获得的大肠杆菌的质粒中得到了目的基因，并与载体连接形成了过表达载体。上述过程中，Smlac7、Smlac20和Smlac28的PCR、酶切及连接分别独立进行，因此最终得到的是分别含有三种目的基因的三个过表达载体。
实施例3：构建重组农杆菌
本实施例的目的是将实施例2得到的过表达载体分别转入农杆菌，得到重组农杆菌，包括如下步骤：
步骤3-1，配制所需试剂，各试剂配方如下：
LB培养基：酵母提取物5g，氯化钠5g，胰蛋白胨10g溶于1L去离子水，调节PH为7；固体培养基每L加入7.5g植物琼脂粉；
YEB培养基：称取酵母提取物、蔗糖、牛肉浸膏、蛋白胨、MgSO4·7H2O 0.983g，去离子水1000mL使溶解，调节pH＝7.2，若配制固体培养基，加入7g琼脂即可。121℃20min高温高压灭菌，备用。
B5培养基：B5粉3.21g,，MgSO4·7H2O 0.983g，植物琼脂粉7.5g，蔗糖20g，高压蒸汽灭菌，121℃，20min；
卡那霉素、潮霉素溶液：去离子水溶解，过滤除菌于-20℃冰箱保存。
利福平溶液：DMSO溶解，过滤除菌后于-20℃冰箱保存。
1/2MS培养基：称取MS粉4.43g，蔗糖30g溶于1L的去离子水中，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。固体培养基每L培养基加入7.5g植物琼脂粉一起灭菌即可。
步骤3-2，制备农杆菌感受态细胞。本实施例中，采用的农杆菌为C58C1农杆菌，制备感受态细胞的操作流程包括如下子步骤：
步骤3-2-1，将C58C1农杆菌在1mL含有45mg/L利福平的YEB液体培养基活化12小时，取20μL活化好的农杆菌在20mL上述培养基中培养至OD600达到0.5；
步骤3-2-2，在4℃的低温离心机上4000rpm离心8min；
步骤3-2-3，0.1M CaCl2在经过抽滤灭菌后放置在冰上预冷，待温度降至4℃左右，取10mL重悬菌体。冰浴半小时再离心8min，弃去上清；
步骤3-2-4，加入5mL30％甘油混匀，每100μL分装一管，于-80℃冰箱保存。
步骤3-3，将过表达载体转入农杆菌，包括如下子步骤：
步骤3-3-1，从-80℃冰箱取出制备好的C58C1感受态细胞，放置冰上待融化后加入10μL的含有目的基因的PHB-flag载体质粒，混匀后冰浴30min；
步骤3-3-2，在液氮中放置5min后，置于冰中3min，取出于37℃水浴5min.；
步骤3-3-3，热激完毕，加入600μL无抗的YEB培养基，28℃200rpm活化5h；
步骤3-3-4，5000rpm离心8min，去掉200μL上清液后重悬菌体涂含有75mg/L Kan和40mg/L Rif的YEB固体平板；
步骤3-3-5，在28℃恒温培养箱中培养48h后进行菌检，菌检引物为PHB-flag上的R端引物和目的基因上的F端引物以及PHB-flag上特殊的潮霉素抗性基因hpt的两段引物。
实施例4：转基因毛状根培养与鉴定
本实施例的目的在于用实施例3得到的重组农杆菌转化丹参组织(本实施例选择丹参叶盘作为待转化的丹参组织)，并对其进行诱导发根，从而得到分别含有目的基因Smlac7、Smlac20和Smlac28的丹参毛状根，包括以下步骤：
步骤4-1，转化叶盘，即将重组农杆菌转化入丹参叶盘，包括以下子步骤：
步骤4-1-1，在1.5mL的离心管中加入1mL的含有卡那霉素(75mg/L)和利福平(40mg/L)的YEB培养基和20μL的含有目的基因载体的菌液，在28℃恒温摇床上200rpm过夜培养，空菌使用含有利福平(40mg/L)的YEB培养基；
步骤4-1-2，从过夜培养的菌液中取500μL加入到25mL含有抗性的YEB培养基，于28℃培养至OD600等于0.6；
步骤4-1-3，8000rpm离心10min，收集菌体，用1/2MS重悬使OD600等于1.0；
步骤4-1-4，剪取无菌培养罐中培养60天的丹参植株叶片，将边缘剪掉，在MS培养基上暗培养两天后备用；
步骤4-1-5，暗培养结束后，将的叶片用1/2MS重悬好的菌液浸泡，在28℃的恒温摇床上培养10min，然后在超净台中用无菌的镊子将活化好的菌液放在无菌纸上吸干多余的菌液，放置于1/2MS无抗培养基上暗培养2天。
步骤4-2，对转化后的丹参叶盘进行诱导发根和降抗处理，包括如下子步骤：
步骤4-2-1，将暗培养两天的转化叶盘置于含有500mg/LCef的1/2MS培养基上除菌培养15天，叶盘边缘会出1cm左右的发根；
步骤4-2-2，当发根长约5cm左右时，剪下独立的发根置于含有Cef(250mg/L)和Hygr(20mg/L)的1/2MS培养基上继续培养，其中Hygr主要用于阳性发根的筛选；
步骤4-2-3，约15天后，挑出能够在潮霉素筛选下生长良好的发根；
步骤4-2-4，继续将挑出的发根在含有Cef(250mg/L)和Hygr(20mg/L)的1/2MS培养基上暗培养，每周更换培养基，同时降低Cef的浓度直到为0；
步骤4-2-5，培养至发根长满平板。
步骤4-3，等量选取步骤4-2中得到的各组发根，提取DNA并进行检测，包括如下子步骤：
步骤4-3-1，预先准备1.5ml离心管，加入700μL GP1缓冲液，继而加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％，混匀后于65℃水浴预热；
步骤4-3-2，取丹参组织约100mg或干重组织约30mg，液氮中充分研磨至粉末状。在液氮完全挥发之前，将研磨好的粉末迅速转移到第一步中准备的离心管中，混匀后65℃水浴20min，期间颠倒离心管数次以混匀样品。
步骤4-3-3，加入氯仿700μL，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。
步骤4-3-4，将所得上层水相转入新的离心管中，下层弃之，加入700μL缓冲液GP2，用枪打匀。
步骤4-3-5，将液体转入吸附柱CB3，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
步骤4-3-6，加入500μL缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
步骤4-3-7，向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
步骤4-3-8，将吸附柱CB3放回收集管中，重复操作步骤7。
步骤4-3-9，将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃废液。室温静置吸附柱CB3数分钟，以彻底晾干残余的漂洗液。
步骤4-3-10，将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜悬空加入50～200μl洗脱缓冲液TE，室温静置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，收集溶液。
步骤4-3-11，进行琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测，其操作与步骤2-1中的RNA提取与检测的方法相同，其中OD260/OD280一般要求在1.6以上，DNA浓度(μg/μL)的计算公式为OD260×50×200(稀释倍数)×10-3。
步骤4-4，对降抗后的发根进行鉴定，获取含有目的基因的转基因发根。
rolB、rolC基因为发根农杆菌的特殊基因，具有诱发并维持发根形态的功能。因此，通过设计rolB、rolC基因的特异性引物进行PCR，就可以鉴定发根是否为毛状根。
另外，载体上自带含有潮霉素抗性的基因hpt，设计该基因的特异性引物可以检测发根是否为包含过表达载体的转基因发根。
对于目的基因，采用载体上特殊的两段引物JDPDK-F和JDPDK-1R进行PCR即可鉴别。也就是说，采用上述三种不同的引物进行PCR，即可鉴别发根是否为转入了目的基因的转基因发根。其中，PCR反应体系如下表4-1所示：
表4-1 发根鉴定的PCR反应体系
DNA 1μL
正向引物 0.5μL
反向引物 0.5μL
LA Taq 5μL
ddH<sub>2</sub>O 3μL
总体积 10μL
PCR反应的条件设定为：
Figure BDA0001321613470000081
鉴定过程中所采用的各引物如表4-2所示：
表4-2 发根鉴定所用引物
Figure BDA0001321613470000082
步骤4-5，将鉴定结果均为阳性(即含有目的基因)的转基因毛状根置于200mL的B5液体培养基中培养，每隔9天换一次培养基。
上述培养过程中，含有SmLAC7及SmLAC20的转基因毛状根生长情况良好，但含有SmLAC28的转基因毛状根则生长情况差，几乎无法得到完整的毛状根。因此，本实施例仅得到分别含有SmLAC7及SmLAC20的两种转基因毛状根。其中，含有SmLAC7的转基因毛状根共有四组，分别记为SmLAC7OVX-A、SmLAC7OVX-B、SmLAC7OVX-F以及SmLAC7OVX-G；含有SmLAC20的转基因毛状根共有四组，分别记为SmLAC20OVX-B、SmLAC20OVX-C、SmLAC20OVX-E以及SmLAC20OVX-F。
实施例5：测定转基因毛状根中的相关化合物含量
本实施例的目的在于对实施例4得到的各组转基因毛状根中的相关化合物(包括迷迭香酸和丹酚酸B)含量进行检测，以验证转入目的基因提高丹酚酸B含量的效果，包括如下步骤：
步骤5-1，制备标准品溶液和供试品溶液，各溶液的制备操作如下：
(1)标准品溶液
精密称定丹酚酸B、迷迭香酸各2.00mg分别用甲醇定容至2mL，得混合标准品储备液1mg/mL。
使用时，取上述标准品储备液用流动相稀释，得到标准品溶液，其中丹酚酸B和迷迭香酸的浓度分别是10μg/mL、4μg/mL。
(2)供试品溶液
将转基因发根在40℃烘箱中干燥5小时得到干燥发根。
将干燥发根用组织研磨机研磨成粉，过100目筛，取50mg，用70％甲醇超声提取3次，每次30min(总共使用5mL甲醇)。
提取完毕后，于离心机上13,500rpm离心10min，然后将上清吸取干净，于容量瓶中定容到20mL，过滤并用流动相稀释即得。
步骤5-2，采用质谱对丹酚酸B和迷迭香酸进行鉴定，质谱参数如下表5-1所示：
表5-1 质谱参数
Figure BDA0001321613470000091
质谱条件设定为：Gas Temp 350℃；Gas Flow 10L/min；Nebulizer 40psi；Capillary 4000V；Sheath Gas Temp 350℃；Sheath Gas Flow 10L/min。
步骤5-3，采用HPLC对丹酚酸B和迷迭香酸的含量进行测定，HPLC条件为：
仪器：安捷伦1200液相色谱串联G6410A三重四级杆质谱联用仪
色谱柱：Waters xSELECT CSHTM C18(2.5μm，2.1×50mm)PN.186006101LN.0101313441
流动相：乙腈-(0.1％甲酸+2mmol/L醋酸铵)水溶液
柱温：35℃
流动相流速：0.3mL/min
进样量：10μL
单针时间：7.0min。
其中，流动相的时间梯度设定如下表5-2所示：
表5-2 流动相的时间梯度
Figure BDA0001321613470000101
图2为本发明的转基因毛状根中的相关化合物含量示意图。图2中，横坐标代表转基因毛状根的不同组，纵坐标达标相对表达量。图中的符号“*”代表t检验P值大于0.01，小于0.05；“**”代表P值小于0.01。
经过上述测定过程，测得实施例4中得到的各组转基因毛状根中的丹酚酸B及迷迭香酸含量，结果如图2以及表5-3、表5-4所示。其中，CK表示空白对照组(即转入了空白载体的转基因毛状根)。
表5-3 含有SmLAC7的转基因丹参毛状根中的迷迭香酸和丹酚酸B含量
Figure BDA0001321613470000102
表5-4 含有SmLAC20的转基因丹参毛状根中的迷迭香酸和丹酚酸B含量
Figure BDA0001321613470000103
上述表5-3以及表5-4中，每个表格中的数字有两行。上一行的数字为干燥根中相关化合物的平均含量(mg/g)，下一行括号中的数字为标准差。
实施例作用与效果
如图2以及表5-3、表5-4所示，将SmLAC7和SmLAC20转入丹参后，其毛状根内的丹酚酸B含量均有显著提高。虽然迷迭香酸的含量也有一定提高，但其提高倍数低于丹酚酸B的提高倍数，说明丹酚酸B提高的原因不是由于其前体化合物迷迭香酸含量提高了。也就是说，SmLAC7和SmLAC20的过表达确实有促进迷迭香酸向丹酚酸B转化，并提高丹酚酸B的最终含量的效果。
例如，实验组SmLAC20OVX-B中，丹酚酸B的含量为142.21mg/g，其对照组的丹酚酸B含量则为32.14mg/g，转基因毛状根中丹酚酸B含量提高倍数为4.4倍；同一组中，迷迭香酸的含量为12.91mg/g，对照组的迷迭香酸含量为7.24mg/g，其提高倍数为1.8倍。因此，丹酚酸B的提高倍数明显高于迷迭香酸的提高倍数。
另外，转入了SmLAC28的转基因毛状根生长情况较差，说明该漆酶基因SmLAC28的过表达会影响丹参自身的生长，因而无法应用。
如上所述，将SmLAC7或SmLAC20与载体连接并通过农杆菌转入丹参后，诱导得到的丹参毛状根内的丹酚酸B含量有显著提高，且其含量最高可达142.21mg/g，是空白对照组含量的4.4倍。因此，本实施例提供的方法及两种漆酶基因能够显著提高丹参毛状根内的丹酚酸B含量，提升丹参的药用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学第二附属医院
<120> 提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法及漆酶基因
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1689
<212> DNA
<213> Salvia miltiorrhiza Bunge
<400> 1
atgaagtttc tcatcgtgta tttttcgttg ctttttttca tatgtggctt tgtagcagtt 60
catggaaaga tcctaagaca gagatttgtg ttacaagatg ccccatacac acgattgtgc 120
ggcagtaaga gcatattaac cgtgaacgga aaatttcccg ggcccaccat atatgcgaga 180
gtgggagaca cagtaattgt ggacgtcatc aacagagcta gtgaaaatat tactattcac 240
tggcatgggg tgaaacagcc aagaaaccca tggtcagatg ggccggctta cataacccag 300
tgcccgatcc gaccgggaac taatttcagc caaagaatcg tgttgtctga tgaaatcggg 360
actctatggt ggcacgctca catcgaatgg tttcgcgcta ctgtctatgg tgctctcgtt 420
gttttaccta acttgggaga tcaatatccc ttccctaaac ctgctgccga aattcccatc 480
atattaggag aatggtggaa cagtgatatt agggaagttc tgagggaagg ccttcaaagc 540
ggatcggatt ttaatgcatc taatgctttc ctcatcaatg gtcaacctgg agatctatat 600
ccttgttcca actcagatac attcaaagtg aaagtggact ctggcaaaac atacctactt 660
cgaatgatca acaatgtgat gaacaacatc atgttcttca aaatcgccaa ccacaacctc 720
accgtagtcg gctccgacgc cgcctacacg aagccgttca cggccgagta cgtggcaata 780
tctccgggcc aaaccataga tgtcttgttc gtagccaacc aacaaccaag ccactattac 840
atggcctctc ggccccacaa cgtcgccggg aacttcgcca acacgaccac aaccgccatc 900
ctcgagtaca ccggaaacta cacggcaccc tcgtctcctc tcctccccac cctccccgac 960
tttgcagacg aggtcgcctc tgacagtttc acagcacggc tgcgaagctt agcgacagag 1020
gctcacccca ttgacgtccc tcaaacagtg gacaaggagc ttctgtttac cctctcggta 1080
aacatattcg aatgcgctct aaacgagact tgcaacggac cgttgcaagg ccggttcaga 1140
acgagcctca acaacataac gttcgtgcag ccaagaatct ccattcttga tgcctattat 1200
aaccgtgtta acggagtcta cgaggaagat ttccctcaga atccgccttt cccgttcaac 1260
tacacgatgg agttcgtgcc acagctgcta tggatacctc aaaatgggac agaagttaga 1320
gtggtggagt ataatacttc agtagagctt gtcttccaag gaacaaacat tcttggtggg 1380
acataccatc ctatgcatct ccatggctac agcttctatg tggtcggaag aggcaacgga 1440
aactttgacc gggaaaggga cccttccagc tataatcttg tcgatcctcc tctgcagaac 1500
accattgcag ttccaagaaa cgggtggaca gcgattaggt tcaaggcgaa taatccaggt 1560
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agatgctaa 1689
<210> 2
<211> 1707
<212> DNA
<213> salvia miltiorrhiza bunge
<400> 2
atgggatcca caaagacgac gagaatcttg cattttctag cattttttct cttagctgga 60
gtgatttcta tccatgccaa gacccatcat caaacctttg tagtgagtga tgctccatat 120
agtaggctgt gtagcaacaa gagcatattg actgtaaatg gaaagtttcc tggaccgact 180
gtacgtgtaa ctgagggtga taccattgca attgttgttg tgaatagagc aagagaaaat 240
ataaccattc attggcatgg agtgaagcag ccgagatatc cgtggtcgga cgggccggaa 300
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gatgagatcg ggactatgtg gtggcatgcg catagcgact ggtcgcgtgc tacggtgcat 420
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ggtgatttgt atgaccttcc atgctcaacc aaagacacgt tcaagctgag tgtggaccac 660
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aaccctagcc actactacat ggcctctaga gcctacgccg tcgccggaga tttcgacaac 900
accaccacca gcgcccgcgt ggagtactcc ggaaactaca ccccgccggc gtccccactg 960
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ccgtttccgt tcaactacac ctcggactcc gtcccgcggg acctgtggga gccgcggaac 1320
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agtacggtaa acgcgccgat tgatcatccc atgcatctgc atggccacag cttctatgtt 1440
gtaggatggg gatttgggaa tttcaacagc actcgggacc caccgaacta caatctcgtc 1500
gacccgccgc ttcagaacac catcgcggtg cctagagccg gttggaccgc gattagattc 1560
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ccaccgtcgg atttccctat gtgctga 1707
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<211> 1734
<212> DNA
<213> salvia miltiorrhiza bunge
<400> 3
atgttttctt ataggaagct taaggttttc atcctatgct tcttaggtat tattatgctc 60
ggaggcatgg gtccagtcca tgctttagtt cataagtttg aagtgagaag atcttcacac 120
accaggctat gcaccaccaa aagcatccta acgataaacg ggcagttccc agggccaact 180
atatatgcta gaaggggaga attggtggta atcgatgtta ttaatcgcgc cgatcaaaat 240
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gaccacaacg tgacggtggt gggcatggac ggcgcctaca cgaagccgct gaacaccgat 780
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<211> 14590
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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aaaacctata tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac 180
gggaaaagga catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact 240
ttgaacggca tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct 300
cggaagagta tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca 360
tcaggctctt tcactccatc gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc 420
gcttagccga attggattac ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact 480
gggaagaaga cactccattt aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa 540
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cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg 3960
ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca 4020
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag 3060
ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg 3120
tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga 3180
gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag 3240
gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg 3300
ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc 3360
gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga 3420
aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg 3480
ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg 3540
acatatgggc caccgccgac ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg 3600
gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg 3660
aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc 3720
gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg 3780
gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag 3840
ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag 3900
cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg 3960
ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca 4020
aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag 4080
caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag 4140
aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag 4200
gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac tggaaccccc aagcccgagg 4260
aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat 4320
gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa 4380
gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa 4440
ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat 4500
tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg 4560
gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt 4620
ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac 4680
gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg 4740
aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc 4800
cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac 4860
accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta 4920
tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg 4980
gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac 5040
ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt 5100
ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg 5160
atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag 5220
ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc 5280
ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa 5340
tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc 5400
tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg 5460
tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata 5520
aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa 5580
acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg 5640
cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc 5700
gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc 5760
gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca ccctgcctcg cgcgtttcgg 5820
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 5880
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 5940
gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg 6000
gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 6060
gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 6120
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 6180
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 6240
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 6300
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 6360
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 6420
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 6480
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 6540
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 6600
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 6660
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 6720
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 6780
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 6840
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 6900
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcattcta ggtactaaaa caattcatcc 6960
agtaaaatat aatattttat tttctcccaa tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat 7020
agctcgacat actgttcttc cccgatatcc tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg 7080
tcataccact tgtccgccct gccgcttctc ccaagatcaa taaagccact tactttgcca 7140
tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg 7200
ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcttct 7260
tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca gtaagtaatc caattcggct 7320
aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc 7380
ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct 7440
tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt 7500
tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca gccatagcat catgtccttt 7560
tcccgttcca catcataggt ggtcccttta taccggctgt ccgtcatttt taaatatagg 7620
ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag acattccttc cgtatctttt 7680
acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg atattctcat tttagccatt 7740
tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc ccaagaagct aattataaca 7800
agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct taaataccag aaaacagctt 7860
tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc gacggagccg attttgaaac 7920
cgcggtgatc acaggcagca acgctctgtc atcgttacaa tcaacatgct accctccgcg 7980
agatcatccg tgtttcaaac ccggcagctt agttgccgtt cttccgaata gcatcggtaa 8040
catgagcaaa gtctgccgcc ttacaacggc tctcccgctg acgccgtccc ggactgatgg 8100
gctgcctgta tcgagtggtg attttgtgcc gagctgccgg tcggggagct gttggctggc 8160
tggtggcagg atatattgtg gtgtaaacaa attgacgctt agacaactta ataacacatt 8220
gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc cgaattaatt cgggggatct ggattttagt 8280
actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatag aagtatttta caaatacaaa 8340
tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga aaccctatag gaaccctaat 8400
tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa ctcgagtcaa atctcggtga 8460
cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 8520
catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 8580
gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct 8640
tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 8700
tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 8760
gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 8820
gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 8880
gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 8940
ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 9000
tagactcgag agagatagat ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa 9060
atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca 9120
tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 9180
tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca 9240
gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct 9300
tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg 9360
tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta 9420
tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc acatcaatcc 9480
acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg 9540
ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg 9600
caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag 9660
atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca 9720
atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg 9780
tgctccacca tgttggcaag ctgctctagc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 9840
ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 9900
gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc 9960
ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 10020
atgaccatga ttacgaattc gcccggggat ctcctttgcc ccagagatca caatggacga 10080
cttcctatat ctctacgatc tagtcaggaa gttcgacgga gaaggtgacg ataccatgtt 10140
caccactgat aatgagaaga ttagcctttt caatttcaga aagaatccta acccacagat 10200
ggttagagac gcttacgcag caggtctcat caagacgatc tacccgagca ataatctcca 10260
ggagatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca ggactaactg 10320
catcaagaac acagagaaag atatatttct caagatcaga agtactattc cagtatggac 10380
gattcaaggc ttgcttcaca aaccaaggca agtaatagag attggagtct ctaaaaaggt 10440
agttcccact gaatcaaagg ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact 10500
cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa 10560
aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac gcttgtctac ctccaaaaat atcaaagata 10620
cagtctcaga agaccaaagg gaattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct 10680
cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg 10740
tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc 10800
cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 10860
tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgataac atggtggagc acgacacgct 10920
tgtctacctc caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggaa ttgagacttt 10980
tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 11040
tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 11100
aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 11160
gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 11220
tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc 11280
ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc 11340
taagcttaga tctatgggat ccacaaagac gacgagaatc ttgcattttc tagcattttt 11400
tctcttagct ggagtgattt ctatccatgc caagacccat catcaaacct ttgtagtgag 11460
tgatgctcca tatagtaggc tgtgtagcaa caagagcata ttgactgtaa atggaaagtt 11520
tcctggaccg actgtacgtg taactgaggg tgataccatt gcaattgttg ttgtgaatag 11580
agcaagagaa aatataacca ttcattggca tggagtgaag cagccgagat atccgtggtc 11640
ggacgggccg gaatatataa cgcagtgccc gattcagccc ggatctaatt ttagtcagaa 11700
gattgtgctg tcggatgaga tcgggactat gtggtggcat gcgcatagcg actggtcgcg 11760
tgctacggtg catggtgcgc tcatagtgta tcctcttatc cagaatgatt atcctttccc 11820
tgtgcctgat gaagaagttc ccatcatatt aggggagtgg tggaaaagtg atattcaggc 11880
tgttctcact gaatttcttc aaactggagg agaccctaat aattctgatg catttcttat 11940
aaatggacaa ccgggtgatt tgtatgacct tccatgctca accaaagaca cgttcaagct 12000
gagtgtggac cacgggaaga gatacctaat tcgaatggtt aacgccgtga tgaacaccat 12060
catgttcttc aaaatcggcg gccacaacgt caccatcgtc ggctccgacg gcgcgtacct 12120
gaagcccttc acctccgact acatcgccat ctccccgggc caaaccatcg acttcctcct 12180
cctcgccgac caaaacccta gccactacta catggcctct agagcctacg ccgtcgccgg 12240
agatttcgac aacaccacca ccagcgcccg cgtggagtac tccggaaact acaccccgcc 12300
ggcgtcccca ctgctcccaa ccctccccga tttcaccgac acggccgcat cagtgaactt 12360
caccgcccga ctccgcagcc tcgcctacaa aaaccaccca atccaagtgc cgttgaacgt 12420
gacgacgaat ctcctcttca ccctctccat caacaccaga aactgcccca acgcggactg 12480
cttggggccg cagggcaacc gcctcctcgc gagcgtcaac aacatcacgt ttcagtcgcc 12540
gcggattgcg atcctgcagg cctattacga gcggatcagc ggcgtctaca gcgcgaattt 12600
cccgagcaac cccccgtttc cgttcaacta cacctcggac tccgtcccgc gggacctgtg 12660
ggagccgcgg aacgggacga gggtgagggt gctcgactat aactccacgg tggagctcgt 12720
ctttcaagga actagtacgg taaacgcgcc gattgatcat cccatgcatc tgcatggcca 12780
cagcttctat gttgtaggat ggggatttgg gaatttcaac agcactcggg acccaccgaa 12840
ctacaatctc gtcgacccgc cgcttcagaa caccatcgcg gtgcctagag ccggttggac 12900
cgcgattaga ttccaagcaa ataatccagg ggtttggcta atgcattgcc atttcgagag 12960
acatataagc tggggaatgg agatggtgtt tattactaga aatgggaaag gcgcgaacga 13020
aacgatgctt cctccaccgt cggatttccc tatgtgcgct agcactagtg acggtatcga 13080
taagcttatg gactacaagg atgacgacga caaggactac aaggatgacg acgacaagga 13140
ctacaaggac gacgacaaga tggatgctag cccgggccat taagctagcg agctcgaatt 13200
gatcctctag agctttcgtt cgtatcatcg gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca 13260
tcagtttcat tgcgcacaca ccagaatcct actgagttcg agtattatgg cattgggaaa 13320
actgtttttc ttgtaccatt tgttgtgctt gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc 13380
gctatcgaac tgtgaaatgg aaatggatgg agaagagtta atgaatgata tggtcctttt 13440
gttcattctc aaattaatat tatttgtttt ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa 13500
attataagag atatgcaaac attttgtttt gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta 13560
atgaccgaag ttaatatgag gagtaaaaca cttgtagttg taccattatg cttattcact 13620
aggcaacaaa tatattttca gacctagaaa agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt 13680
cctcttgtgt tttagacatt tatgaacttt cctttatgta attttccaga atccttgtca 13740
gattctaatc attgctttat aattatagtt atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa 13800
atatttttta atgcatttta tgacttgcca attgattgac aacatgcatc aatcgatggc 13860
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 13920
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 13980
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgctag agcagcttga gcttggatca 14040
gattgtcgtt tcccgccttc agtttagctt catggagtca aagattcaaa tagaggacct 14100
aacagaactc gccgtaaaga ctggcgaaca gttcatacag agtctcttac gactcaatga 14160
caagaagaaa atcttcgtca acatggtgga gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat 14220
caaagataca gtctcagaag accaaagggc aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 14280
cggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga 14340
aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga 14400
tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 14460
agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt 14520
aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 14580
atttcatttg gagagaacac gggggactct tgac 14614

Claims (4)

1.一种提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，其特征在于，通过在所述丹参毛状根中过表达丹参漆酶SmLAC7基因从而得到丹酚酸B含量提高的转基因丹参毛状根，包括如下步骤：
步骤S1，构建含有所述丹参漆酶SmLAC7基因的过表达载体；
步骤S2，将步骤S1得到的所述过表达载体转染入农杆菌，得到重组农杆菌；
步骤S3，用步骤S2得到的所述重组农杆菌转化丹参组织并诱导发根，获得所述转基因丹参毛状根，
其中，所述丹参漆酶SmLAC7基因的序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的方法，其特征在于：
其中，所述过表达载体为含有所述丹参漆酶SmLAC7基因的过表达载体，其序列如SEQID No：4所示。
3.一种用于提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的丹参漆酶基因，其特征在于：
其中，所述丹参漆酶基因为丹参漆酶SmLAC7基因，其序列如SEQ ID No：1所示。
4.一种用于提高丹参毛状根中丹酚酸B含量的过表达载体，其特征在于：
其中，所述过表达载体含有如权利要求3所述的丹参漆酶SmLAC7基因，该过表达载体的基因序列如SEQ ID No：4所示。
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