CN117050994A - 优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了核苷酸序列是SEQ ID No.2第2405‑2641位所示的DNA分子或核苷酸序列是SEQ ID No.2第2405‑2647位所示的DNA分子，本发明还提供上述DNA分子作为启动子启动目的基因在植物中表达中的应用。本发明提供的DNA分子作为启动子不限于特定植物，本发明实施例中验证了目的基因可在烟草、菠菜和柑橘中表达。同时，本发明实施例中分别给出了4种优化的启动子，其中载体opsTRV2:GFP在受体植物中的表达量远高于初始载体及另外三个改造的载体，说明该优化的启动子具有预料不到的技术效果。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用。
背景技术
传染性疾病给我国乃至世界的医疗保健系统带来了巨大负担，该类疾病导致约17％的死亡率。预防和控制传染病的传统方法包括疫苗接种、卫生保健、药物抑制病原体、或减弱宿主免疫系统等。虽然利用动物细胞提供疫苗抗体可以保证蛋白的翻译后修饰、产量较高，但是成本较高，且有人类病毒寄生风险，这就受到高成本和有限扩展性的阻碍，特别是在传染病流行且控制不力的国家。植物常被描述为“有前途的”或“新兴的”平台，具有大规模生产试剂的潜力，可用于制造小分子药物、重组抗病毒药物、亚单位疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗和治疗性蛋白质等(Chichester and Yusibov,2007)。利用植物生产系统表达抗原已经用于多种治疗，它可以快速产出抗体、抗原，包括各种病毒样颗粒。2008年已有文献报道可利用植物表达流感病毒的病毒样颗粒(D'Aoust et al.,2008)。但是，利用植物表达蛋白最大的问题就是收获量比较低，因此提高蛋白表达量对于突破植物生物技术的瓶颈至关重要。
烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)常用于病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)，作为一种有效的反向遗传学技术已经被广泛的应用于多种植物(Lu et al.,2003)，其也可以在植物中表达异源蛋白。TRV病毒基因组由两条RNA链组成，RNA1编码复制酶134kDa和194kDa，运动蛋白(MP)29kDa，以及一个16kDa富含亮氨酸的蛋白。RNA2编码外壳蛋白CP以及两个非结构蛋白P2b和P2c。在之前的研究中，在RNA1 134kDa的基因组序列中通过EcoR1和Xba1插入一段拟南芥ACTIN1(GenBank:U27981.1)内含子2(1957-2111bp)的序列，用来减弱TRV引起的病症，该载体命名为psTRV1。在RNA2中，将两个非结构蛋白P2b和P2c去除，替换为多克隆位点(MacFarlane and Popovich,2000)。通过EcoR1和Nco1插入豌豆早褐病毒(Pea early browning virus,PEBV.GenBank:X78455.1)外壳蛋白(Coat protein,CP)的亚基因组启动子(237bp)，再利用Nco1和BamH1插入GFP片段，CP启动子与GFP串联，但连接处形成一个Nco1酶切位点(CCATGGCT)(双下滑线标注为Nco1酶切位点，ATGGCT为GFP起始编码框)，该载体命名为：psTRV2:GFP(US8853493B2，2014-10-07)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何提高植物蛋白的表达量。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种DNA分子，所述DNA分子是C1)或C2)，
C1)核苷酸序列是SEQ ID No.2第2405-2641位所示的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2第2405-2647位所示的DNA分子。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供应用，所述应用为A1)-A3)中任一项：
A1)上述的DNA分子作为启动子的应用；
A2)上述DNA分子作为启动子在启动目的基因表达中的应用；
A3)上述DNA分子作为启动子在启动目的基因在植物中表达中的应用。
本发明中，所述DNA分子是在豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV.GenBank:X78455.1)外壳蛋白(Coat protein,CP)的亚基因组启动子(promoter,237bp，简称为CPpro)的基础上优化获得的。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明还提供一种DNA分子，所述DNA分子宝库包括目的基因和位于所述目的基因上游启动所述目的基因表达的启动子，所述启动子为上述的DNA分子。
为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供含有上述DNA分子的表达盒。
为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供含有上述DNA分子的重组表达载体或含有上述表达盒的重组表达载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体的核苷酸序列是SEQ ID No.2。
为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供含有上述DNA分子的重组微生物或含有上述表达盒的重组微生物或含有上述重组表达载体的重组微生物。
为解决上述技术问题，第七个方面，本发明提供含有上述DNA分子的生物材料在调控植物中目的基因表达中的应用；
所述生物材料为B1)-B6)中任意一种：
B1)上述的表达盒；
B2)上述的重组载体；
B3)上述的重组微生物；
B4)、含有上述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有上述表达盒的转基因植物细胞系、或含有上述重组载体的转基因植物细胞系；
B5)、含有上述DNA分子的转基因植物组织、或含有上述表达盒的转基因植物组织、或含有上述重组载体的转基因植物组织；
B6)、含有上述DNA分子的转基因植物器官、或含有上述表达盒的转基因植物器官、或含有上述重组载体的转基因植物器官。
进一步地，上述的应用中，所述调控目的基因的表达为提高目的基因的表达。
本发明中，所述目的基因可以是异源基因。
本发明中，所述调控目的基因表达可为进行如下6种调控中至少一种调控1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达可为促进或提高所述基因表达，所述促进或提高所述基因表达可通过改造启动子实现。
上述生物材料中，B3)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述生物材料中，B5)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述生物材料中，B6)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
进一步地，上述的应用中，所述植物选自P1)-P10)中任一种：
P1)双子叶植物；
P2)茄科植物；
P3)烟草属植物；
P4)烟草；
P5)藜科植物；
P6)菠菜属植物；
P7)菠菜；
P8)芸香科植物；
P9)柑橘属植物；
P10)柑橘。
为解决上述技术问题，第八个方面，本发明提供一种在植物中表达目的基因的方法，包括将上述DNA分子导入目的植物，从而在目的植物中表达所述目的基因。
上述方法中，所述目的基因可以是所述植物的异源基因。
在背景技术中所交代的研究基础上，进一步对载体psTRV2:GFP进行改造，获得一个高表达的优化载体opsTRV:GFP(optimized psTRV2:GFP)。
本发明取得的有益技术效果如下：
1、在田间，TRV的寄主范围非常广泛，可以侵染多种植物。所以，本发明的受体植物或目的植物不限于特定植物。本发明实施例中示例性的给出了目的基因在烟草、菠菜和柑橘中的表达验证实验。
2、本发明实施例中分别构建了4种优化的启动子，其中opsTRV2:GFP在受体植物中的表达量远高于初始载体及另外三个改造的载体，说明该启动子的优化具有预料不到的技术效果。
附图说明
图1为psTRV2:GFP的四个优化载体的改造示意图。
图2为优化载体opsTRV2:GFP在烟草中的表达水平。
图3为利用优化载体opsTRV2:GFP表达免疫蛋白的结果。
图4为优化载体opsTRV2:GFP在菠菜和柑橘中的表达验证。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的psTRV1由本实验室保存，在文献“Jing Qu,Jian Ye,Yun-FengGeng,Yan-Wei Sun,Shi-Qiang Gao,Bi-Pei Zhang,Wen Chen,Nam-Hai Chua.Dissectingfunctions of KATANIN and WRINKLED1 in cotton fiber development by virus-induced gene silencing.Plant Physiology.October 2012,Vol.160,pp.738–748.DOI:10.1104/pp.112.198564.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、psTRV2:GFP载体的优化
psTRV2:GFP载体和psTRV2001载体是本实验室早期构建的植物性蛋白表达载体，在公开号为US8853493B2，公开日为2014年10月7号公布的专利公布文件中有记载。
本发明中下述实施例中所指的psTRV2:GFP载体(也称原始载体)是将专利中公开的psTRV2:GFP载体的BamH1酶切位点替换为Kpn1酶切位点，替换后的psTRV2:GFP载体的苷酸序列是SEQ ID No.1，在该psTRV2:GFP载体的基础上进行改造，构建以下四个克隆：
(I)以psTRV2:GFP为模板扩增豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV.GenBank:X78455.1)外壳蛋白(Coat protein,CP)的亚基因组启动子(promoter,237bp，简称为CPpro)，末端两个核苷酸由“CC”替换为“AG”(引物CPpro-F:TCTGTGAGTAAGGTTACCGTGCACACAAGGTTAAAA；CPpro+GFP-R:TTCTCCTTTG CTAGCCATGA ATTCCTCGTTAACTCGGGTA AG)。以psTRV2:GFP为模板扩增GFP片段(引物CPpro+GFP-F:CTTACCCGAGTTAACGAG GAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAA；psTRV-GFP-R:ACGCGTGAGC TCGGTACCTTATTTGTAGAG CTCATC.下划线为EcoR1酶切位点)。将psTRV2001载体用EcoRI和KpnI双酶切，通过多片段同源重组将CPpro和GFP连于psTRV2001载体。且将启动子5’端EcoRI酶切位点去除，在CPpro-GFP之间插入“GAATTC”EcoRI酶切位点，保持psTRV2001的其他核苷酸序列不变，获得优化后的载体I。
优化后的载体I命名为psTRV2-CPpro:GFP，其改造示意图如图1中I。psTRV2-CPpro:GFP的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。其中SEQ ID No.2第2405-2641位是优化后的PEBV外壳蛋白的亚基因组启动子的核苷酸序列，第2642-2647位是EcoRI酶切识别位点，第2648-3368位是GFP的编码序列。
(II)用PEBV 9K蛋白的亚基因组启动子(9Kpro)替换psTRV2:GFP载体中的PEBV外壳蛋白CP的亚基因组启动子，合成引物psTRV-9k-GFP-F：TCTGTGAGTAAGGTTACCattattactgtg ccctccacta acctttccaa atgtattaaa gac GAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAA；psTRV-9k-GFP-R:TTCTCCTTTG CTAGCCATGAATTCGTCTTT AATACATTTG GAAAGGTTAGTGGAGGGCAC AGTAATAATG GTAACCTTAC TCACAGA(其中小写字母为9Kpro,下划线为EcoR1酶切位点)，将两条单链DNA通过高温退火获得9Kpro片段。同时以psTRV2:GFP为模板扩增GFP片段(引物9k-GFP-F：ttccaa atgtattaaa gac GAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAA；psTRV-GFP-R:ACGCGTGAGC TCGGTACCTT ATTTGTAGAG CTCATC.下划线为EcoR1酶切位点)。通过多片段同源重组将9Kpro和GFP连于EcoRI和KpnI双酶切的psTRV2001载体上。在9Kpro-GFP之间保留“GAATTC”EcoRI酶切位点，保持psTRV2001的其他核苷酸序列不变，获得优化的载体II。优化后的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其中SEQ ID No.3第1-45位为9Kpro启动子的核苷酸序列，SEQ ID No.3第46-51位为限制性内切酶EcoRI的核苷酸序列。
优化后的载体II命名为psTRV2-9Kpro:GFP，其改造示意图如图1中II。载体II是将psTRV2:GFP(SEQ ID No.1)第2405-2647位替换为核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子，保持psTRV2:GFP的其他核苷酸序列不变，获得优化后的载体。
(III)以psTRV2:GFP为模板扩增PEBV CP的亚基因组启动子(237bp)(引物CPpro-F:TCTGTGAGTAAGGTTACCGTGCACACAAGGTTAAAA；CPpro-9Kpro-R:GGAGGGCACA GTAATAATCTCGTTAACTCG GGTAAG)，合成的PEBV 9K亚基因组启动子(CPpro-9k-GFP-F:CTTACCCGAGTTAACGAGat tattactgtg ccctccacta acctttccaa atgtattaaa gacGAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAA；CPpro-9k-GFP-R:TTCTCCTTTG CTAGCCATGA ATTCGTCTTTAATACATTTG GAAAGGTTAG TGGAGGGCACAGTAATAATC TCGTTAACTC GGGTAAG，其中正向引物中小写字母为9Kpro,下划线为EcoR1酶切位点)，以psTRV2:GFP为模板扩增GFP片段(引物9k-GFP-F：ttccaa atgtattaaa gac GAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAA；psTRV-GFP-R:ACGCGTGAGCTCGGTACCTT ATTTGTAGAG CTCATC.下划线为EcoR1酶切位点)。将psTRV2001载体用EcoRI和KpnI双酶切，通过多片段同源重组将CPpro、9Kpro和GFP连于双酶切psTRV2001载体。且将5’端EcoRI酶切位点去除，在9Kpro-GFP之间保留“GAATTC”EcoRI酶切位点，保持psTRV2001的其他核苷酸序列不变获得优化的载体III，用CPpro和9Kpro双启动子启动GFP的表达。优化后的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.4第1-237位是PEBV外壳蛋白的亚基因组启动子的核苷酸序列，SEQ ID No.4第238-282位为9Kpro启动子的核苷酸序列，SEQ ID No.4第283-288位为限制性内切酶EcoRI的核苷酸序列。
优化后的载体III命名为psTRV2-(CP+9K)pro:GFP，其改造示意图如图1中III。载体III是将psTRV2:GFP(SEQ ID No.1)第2405-2647位替换为核苷酸序列是SEQ ID No.4的DNA分子，保持psTRV2:GFP的其他核苷酸序列不变，获得优化后的载体。
(IV)委托公司人工合成两个串联的PEBV CP的亚基因组启动子，长度分别为237bp和192bp，237bp在前，192bp在后。以psTRV2:GFP为模板扩增GFP片段(引物CPpro+GFP-F:CTTACCCGAGTTAACGAG GAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAA；psTRV-GFP-R:ACGCGTGAGC TCGGTACCTTATTTGTAGAG CTCATC.下划线为EcoR1酶切位点)。通过多片段同源重组将2xCPpro和GFP连于EcoRI和KpnI双酶切psTRV2001载体。且将5’端EcoRI酶切位点去除，在CPpro-GFP之间保留“GAATTC”EcoRI酶切位点，保持psTRV2001的其他核苷酸序列不变获得优化的载体IV，用两个串联的CPpro启动GFP的表达。优化后的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5，其中SEQ IDNo.5第1-237位是PEBV外壳蛋白的亚基因组启动子(237bp)的核苷酸序列，SEQ ID No.5第238-429位是PEBV外壳蛋白的亚基因组启动子(192bp)的核苷酸序列，SEQ ID No.5第430-435位为限制性内切酶EcoRI的核苷酸序列。
优化后的载体IV命名为psTRV2-2×CPpro:GFP，其改造示意图如图1中IV。载体IV是将psTRV2:GFP(SEQ ID No.1)第2405-2647位替换为核苷酸序列是SEQ ID No.5的DNA分子，保持psTRV2:GFP的其他核苷酸序列不变，获得优化后的载体。
实施例2、优化载体的效果验证
将实施例1中的四个改造的载体和原始载体psTRV2:GFP(原始载体)通过电击转化根癌农杆菌EHA105，挑取阳性克隆，在含有卡那霉素(终浓度0.1mg/ml)和利福平抗生素(终浓度为0.025mg/ml)的LB液体培养基中培养24h，获得农杆菌培养物。4000rpm离心10min集菌，之后用农杆菌悬浮缓冲液(10mM MgCl2；100μM乙酰丁香酮；10mM MES)将农杆菌重悬，并调至OD600＝1.0，与psTRV1按照1：1比例混合后注射4-6叶期的本生烟。
2.1、受体组织中的荧光强度
接种三天后，在紫外灯下观察GFP的荧光强度。其中，GFP显像和荧光定量分析的方法为：为了在叶片和整株植物上可视地监测GFP荧光，使用手持式100W长波UV灯(UVProducts，Upland，CA)，且使用安装有UV和Kenko黄色透镜(Tokyo，Japan)的Nikon Coolpix995数码相机(Tokyo，Japan)拍摄荧光图像。
结果如图2中A所示，图2的A中，I表示转化的是载体I，II表示转化的是载体II，III表示转化的是载体III，IV表示转化的是载体IV。
结果表明：转化载体I的叶片(图2中A记为“I”)中GFP表达量最高，且高于原始载体。
2.2、抗体和蛋白质凝胶印迹分析
抗体和蛋白质凝胶印迹分析的方法为：总植物蛋白通过12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将抗GFP蛋白的鼠单克隆IgG(北京全式金生物技术有限公司，Code#HT801-01)用作一抗。将ECL辣根过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG用作二抗(北京全式金生物技术有限公司，Code#HS201-01)。使用ECL蛋白印迹检测试剂(GE healthcare)来观察免疫反应性条带。将考马斯亮蓝染色的rbcL条带用作上样对照。
结果如图2中B所示，免疫印记条带用Image J软件进行定量，且将原始载体psTRV2:GFP叶片中的GFP表达量标准化为1，结果显示改造载体I表达量最高，且高于原始载体，GFP表达量提高约75％。
2.3、载体在植物中系统上传的验证
接种5天后，参照2.1所示的方法观察系统叶中GFP的亮度，结果如图2中C所示。其中。图2中C的psTRV2:GFP(原始载体)表示受体烟草中转化的是初始载体，上方箭头所指位置表明顶端第三片叶刚开始发病，下方箭头所指位置表明顶端第四片叶还未发病；opsTRV2:GFP表示受体烟草中转化的是载体I，左侧箭头所指位置表明顶端第三片叶已经发病，半片叶子已经有绿色荧光，右侧箭头所指位置表明顶端第四片叶已开始发病，叶柄已经出现绿色荧光。结果显示改造载体的GFP可以系统上传，且比原始载体发病快。
2.4、受体植物中目的基因表达量的测定
参照2.2所示方法用免疫印记检测原始载体和优化载体系统发病叶片中GFP的表达水平，GFP条带用ImageJ软件进行定量，且将原始载体psTRV2:GFP叶片中的GFP表达量标准化为1,考马斯亮蓝染色的rbcL条带作为上样对照。结果如图2中D所示，图2中D的psTRV2:GFP(原始载体)表示受体烟草中转化的是初始载体，opsTRV2:GFP表示受体烟草中转化的是载体I，结果表明转化载体I的烟草中GFP的表达量高于原始载体2倍以上。
结合以上结果，将高表达的优化载体I命名为opsTRV2:GFP(optimized psTRV2:GFP)。且GFP可以通过EcoR1和Kpn1切除，替换为其他蛋白，也可以用Kpn1单酶切，将目的蛋白重组入载体中，保留GFP标签。
实施例3、干扰素蛋白的表达验证
人工合成植物密码子优化的猫科动物干扰素蛋白(feline interferonsFeIFNw1)基因(SEQ ID No.6)，该蛋白去除N端信号肽(70-591bp)。分别将psTRV2:GFP和opsTRV2:GFP用Kpn1单酶切，通过同源重组将FeIFNw1基因分别构建到酶切后载体上，得到含有FeIFNw1基因的重组表达载体psTRV2:GFP-FeIFNw1和opsTRV2:GFP-FeIFNw1(图3中A)。
其中，psTRV2:GFP-FeIFNw1是将SEQ ID No.6所示的DNA分子插入psTRV2:GFP的KpnⅠ酶切位点，保持psTRV2:GFP的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；
opsTRV2:GFP-FeIFNw1是将SEQ ID No.6所示的DNA分子插入opsTRV2:GFP的KpnⅠ酶切位点，保持opsTRV2:GFP的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。
将psTRV2:GFP-FeIFNw1和opsTRV2:GFP-FeIFNw1载体通过电击转化根癌农杆菌EHA105，挑取阳性克隆，在含有卡那霉素(终浓度0.1mg/ml)和利福平抗生素(终浓度为0.025mg/ml)的LB液体培养基中培养，获得农杆菌培养物。之后用农杆菌悬浮缓冲液将农杆菌培养物调至OD600＝1.0，与psTRV1按照1：1比例混合后注射4-6叶期的本生烟。
接种三天后，参照实施例2中2.1所示的方法在紫外灯下观察GFP的荧光强度，结果如图3中B所示，结果表明改造载体opsTRV2:GFP-FeIFNw1的荧光强度高于原始载体。
参照实施例2中2.2，使用免疫印记检测原始载体和优化载体GFP-FeIFNw1的表达水平，GFP条带用Image J软件进行定量，且将原始载体psTRV2:GFP-FeIFNw1叶片中的蛋白表达量标准化为1，考马斯亮蓝染色的rbcL条带用作上样对照。结果如图3中C所示，结果表明相较原始载体，优化载体GFP-FeIFNw1表达量提高约47％。
实施例4、其他受体植物中的基因表达验证
将opsTRV2:GFP载体通过电击转化根癌农杆菌EHA105，挑取阳性克隆，在含有卡那霉素(终浓度0.1mg/ml)和利福平抗生素(终浓度为0.025mg/ml)的LB液体培养基中培养，获得农杆菌培养物。之后用农杆菌悬浮缓冲液将农杆菌培养物调至OD600＝1.0，获得含有opsTRV2:GFP载体的农杆菌培养液。
在田间，TRV的寄主范围非常广泛，可以侵染多种植物。除了模式植物烟草，将含有opsTRV2:GFP载体的农杆菌培养液接种菠菜(品种：黑帅菠菜，购自寿光金鹏种业)接种三天后，参照实施例2中2.1的方法在紫外下观察GFP荧光，结果如图4中A所示，其中A中左图表示白光条件下健康植物和opsTRV2:GFP接种植物叶片的状态，右图表示紫外光照射下，健康植物和opsTRV2:GFP接种植物中GFP的荧光情况。结果表明在注射opsTRV2:GFP的叶片中可观察到绿色荧光。
抗体和蛋白质凝胶印迹分析的方法参照实施例2中2.2，结果如图4中B所示，与健康植物相比，opsTRV2:GFP接种的植物可以在菠菜中表达，且表达量较高。在接种21天后，将上部未注射叶片放在紫外灯下观察，发现在系统叶片中也可以看到绿色荧光(图4中C)，说明GFP在菠菜中可以系统上传。
随后用含有opsTRV2:GFP载体的农杆菌培养液注射柑橘叶片(品种：香橙种子；购自辉煌花木院)，注射5天后参照实施例2.2的方法在紫外下观察GFP荧光，结果如图4中D所示，在紫外灯照射下，与对照植物相比，发现只在opsTRV2:GFP注射叶片中有绿色荧光，说明opsTRV2:GFP在柑橘中也可以表达。
这些结果表明opsTRV2:GFP可以在多种植物中表达，并且可以系统上传，这就说明我们可以利用该优化载体在整株植物上表达目的蛋白，这将大大提高目的蛋白的表达量和产出率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10630
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcttggtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac 60
agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat cgggaaacct 120
cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag aaaaggaaga 180
tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctac 240
cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt 300
tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatggt caacatggtg gagcacgaca 360
ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccagagg gctattgaga 420
cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 480
acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata 540
aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 600
ccacgaggaa catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 660
gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 720
cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggat aaaacattgc acctatggtg 780
ttgccctggc tggggtatgt cagtgatcgc agtagaatgt actaattgac aagttggaga 840
atacggtaga acgtccttat ccaacacagc ctttatccct ctccctgacg aggtttttgt 900
cagtgtaata tttctttttg aactatccag cttagtaccg tacgggaaag tgactggtgt 960
gcttatcttt gaaatgttac tttgggtttc ggttctttag gttagtaaga aagcacttgt 1020
cttctcatac aaaggaaaac ctgagacgta tcgcttacga aagtagcaat gaaagaaagg 1080
tggtggtttt aatcgctacc gcaaaaacga tggggtcgtt ttaattaact tctcctacgc 1140
aagcgtctaa acggacgttg gggttttgct agtttcttta gagaaaacta gctaagtctt 1200
taatgttatc attagagatg gcataaatat aatacttgtg tctgctgata agatcatttt 1260
aatttggacg attagacttg ttgaactaca ggttactgaa tcacttgcgc taatcaacat 1320
gggagatatg tacgatgaat catttgacaa gtcgggcggt cctgctgact tgatggacga 1380
ttcttgggtg gaatcagttt cgtggaaaga tctgttgaag aagttacaca gcataaaatt 1440
tgcactacag tctggtagag atgagatcac tgggttacta gcggcactga atagacagtg 1500
tccttattca ccatatgagc agtttccaga taagaaggtg tatttccttt tagactcacg 1560
ggctaacagt gctcttggtg tgattcagaa cgcttcagcg ttcaagagac gagctgatga 1620
gaagaatgca gtggcgggtg ttacaaatat tcctgcgaat ccaaacacaa cggttacgac 1680
gaaccaaggg agtactacta ctaccaaggc gaacactggc tcgactttgg aagaagactt 1740
gtacacttat tacaaattcg atgatgcctc tacagctttc cacaaatctc taacttcgtt 1800
agagaacatg gagttgaaga gttattaccg aaggaacttt gagaaagtat tcgggattaa 1860
gtttggtgga gcagctgcta gttcatctgc accgcctcca gcgagtggag gtccgatacg 1920
tcctaatccc tagggattta aggacgtgaa ctctgttgag atctctgtga aattcagagg 1980
gtgggtgata ccatattcac tgatgccatt agcgacatct aaatagggct aattgtgact 2040
aatttgaggg aatttccttt accattgacg tcagtgtcgt tggtagcatt tgagtttcgc 2100
aatgcacgaa ttacttagga agtggcttga cgacactaat gtgttattgt tagataatgg 2160
tttggtggtc aaggtacgta gtagagtccc acatattcgc acgtatgaag taattggaaa 2220
gttgtcagtt tttgataatt cactgggaga tgatacgctg tttgagggaa aagtagagaa 2280
cgtatttgtt tttatgttca ggcggttctt gtgtgtcaac aaagatggac attgttactc 2340
aaggaagcac gatgagcttt attattacgg acgagtggac ttagattctg tgagtaaggt 2400
taccgaattc gtgcacacaa ggttaaaaac gctgtagtaa tacatgcgca agaacaggct 2460
gagcatcttg ttctggggtt tcacactatc tttagagaaa gtgttaagtt aattaagtta 2520
tcttaattaa gagcataatt atactgattt gtctctcgtt gatagagtct atcattctgt 2580
tactaaaaat ttgacaactc ggtttgctga cctactggtt actgtatcac ttacccgagt 2640
taacgccatg gctagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga 2700
attagatggt gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc 2760
tacatacgga aagcttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg 2820
gccaacactt gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca 2880
tatgaaacgg gcatgacttt ttcaagagtg ccatgcccga aggttatgta caggaacgca 2940
ctatatcttt caaagatgac gggaactaca agacgcgtgc tgaagtcaag tttgaaggtg 3000
atacccttgt taatcgtatc gagttaaaag gtattgattt taaagaagat ggaaacattc 3060
tcggacacaa actcgagtac aactataact cacacaatgt atacatcacg gcagacaaac 3120
aaaagaatgg aatcaaagct aacttcaaaa ttcgccacaa cattgaagat ggatccgttc 3180
aactagcaga ccattatcaa caaaatactc caattggcga tggccctgtc cttttaccag 3240
acaaccatta cctgtcgaca caatctgccc tttcgaaaga tcccaacgaa aagcgtgacc 3300
acatggtcct tcttgagttt gtaactgctg ctgggattac acatggcatg gatgagctct 3360
acaaataagg taccgagctc acgcgtctcg aggcccgggc atgtcccgaa gacattaaac 3420
tacggttctt taagtagatc cgtgtctgaa gttttaggtt caatttaaac ctacgagatt 3480
gacattctcg actgatcttg attgatcggt aagtcttttg taatttaatt ttctttttga 3540
ttttatttta aattgttatc tgtttctgtg tatagactgt ttgagatcgg cgtttggccg 3600
actcattgtc ttaccatagg ggaacggact ttgtttgtgt tgttatttta tttgtatttt 3660
attaaaattc tcaacgatct gaaaaagcct cgcggctaag agattgttgg ggggtgagta 3720
agtactttta aagtgatgat ggttacaaag gcaaaagggg taaaacccct cgcctacgta 3780
agcgttatta cgcccgtctg tacttatatc agtacactga cgagtcccta aaggacgaaa 3840
cgggttggga attctaagag gagtccacca tggtagatct gactagtgtt aacgctagcc 3900
accaccacca ccaccacgtg tgaattacag gtgaccagct cgaatttccc cgatcgttca 3960
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 4020
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 4080
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 4140
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 4200
gatcgggaat taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa 4260
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cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga 4440
catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt 4500
tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta gaatacttgc gactagaacc ggagacatta 4560
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ccaggacttg accaaccaac gggccgaact gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc 4680
cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct 4740
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tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga 5520
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gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga 5760
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acatatgggc caccgccgac ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg 5940
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aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc 6060
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aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag 6420
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tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt 9840
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gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc cgaattaatt cctaggccac catgttgggc 10620
ccggcgcgcc 10630
<210> 2
<211> 10630
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcttggtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac 60
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gcttatcttt gaaatgttac tttgggtttc ggttctttag gttagtaaga aagcacttgt 1020
cttctcatac aaaggaaaac ctgagacgta tcgcttacga aagtagcaat gaaagaaagg 1080
tggtggtttt aatcgctacc gcaaaaacga tggggtcgtt ttaattaact tctcctacgc 1140
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gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa 6720
gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa 6780
ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat 6840
tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg 6900
gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt 6960
ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac 7020
gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg 7080
aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc 7140
cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac 7200
accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta 7260
tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg 7320
gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac 7380
ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt 7440
ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg 7500
atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag 7560
ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc 7620
ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa 7680
tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc 7740
tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg 7800
tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata 7860
aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa 7920
acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg 7980
cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc 8040
gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc 8100
gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca ccctgcctcg cgcgtttcgg 8160
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 8220
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 8280
gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg 8340
gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 8400
gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 8460
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 8520
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 8580
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 8640
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 8700
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 8760
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 8820
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 8880
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 8940
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 9000
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 9060
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 9120
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 9180
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 9240
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcattcta ggtactaaaa caattcatcc 9300
agtaaaatat aatattttat tttctcccaa tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat 9360
agctcgacat actgttcttc cccgatatcc tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg 9420
tcataccact tgtccgccct gccgcttctc ccaagatcaa taaagccact tactttgcca 9480
tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg 9540
ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcttct 9600
tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca gtaagtaatc caattcggct 9660
aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc 9720
ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct 9780
tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt 9840
tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca gccatagcat catgtccttt 9900
tcccgttcca catcataggt ggtcccttta taccggctgt ccgtcatttt taaatatagg 9960
ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag acattccttc cgtatctttt 10020
acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg atattctcat tttagccatt 10080
tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc ccaagaagct aattataaca 10140
agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct taaataccag aaaacagctt 10200
tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc gacggagccg attttgaaac 10260
cgcggtgatc acaggcagca acgctctgtc atcgttacaa tcaacatgct accctccgcg 10320
agatcatccg tgtttcaaac ccggcagctt agttgccgtt cttccgaata gcatcggtaa 10380
catgagcaaa gtctgccgcc ttacaacggc tctcccgctg acgccgtccc ggactgatgg 10440
gctgcctgta tcgagtggtg attttgtgcc gagctgccgg tcggggagct gttggctggc 10500
tggtggcagg atatattgtg gtgtaaacaa attgacgctt agacaactta ataacacatt 10560
gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc cgaattaatt cctaggccac catgttgggc 10620
ccggcgcgcc 10630
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attattactg tgccctccac taacctttcc aaatgtatta aagacgaatt c 51
<210> 4
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgcacacaa ggttaaaaac gctgtagtaa tacatgcgca agaacaggct gagcatcttg 60
ttctggggtt tcacactatc tttagagaaa gtgttaagtt aattaagtta tcttaattaa 120
gagcataatt atactgattt gtctctcgtt gatagagtct atcattctgt tactaaaaat 180
ttgacaactc ggtttgctga cctactggtt actgtatcac ttacccgagt taacgccatt 240
attactgtgc cctccactaa cctttccaaa tgtattaaag acgaattc 288
<210> 5
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcacacaa ggttaaaaac gctgtagtaa tacatgcgca agaacaggct gagcatcttg 60
ttctggggtt tcacactatc tttagagaaa gtgttaagtt aattaagtta tcttaattaa 120
gagcataatt atactgattt gtctctcgtt gatagagtct atcattctgt tactaaaaat 180
ttgacaactc ggtttgctga cctactggtt actgtatcac ttacccgagt taacgagagg 240
ctgagcatct tgttctgggg tttcacacta tctttagaga aagtgttaag ttaattaagt 300
tatcttaatt aagagcataa ttatactgat ttgtctctcg ttgatagagt ctatcattct 360
gttactaaaa atttgacaac tcggtttgct gacctactgg ttactgtatc acttacccga 420
gttaacgagg aattc 435
<210> 6
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtgctcttc ctggttctca tgctcaggtt tccagagata accttgttct tcttggtcaa 60
atgcgtcgtc tttctccttt tctttgtctt agagctcgta aggattttag gtttcctcgt 120
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cttcttcaac aaacttttaa tcttctccac actgaaagaa gttctgcagc ttggtctcct 240
gctcctttgc atggtcttag gtcaggtctt cataggcaac ttgaggctct tgatgcttgt 300
tggcttcaag ctactggtga aggtgaaaga gctccaggta tgcatggtcc tgttcttgct 360
attaagagat attttcaaga catccgtgtt tatcttgaag atgaaggtta ttctgattgt 420
gcttgggaaa ttgtgagatt ggagattatg agagctttgt cttctagtgc tactcttcag 480
gactcccttg ctattaaaga cggtgagctt gctagtagtt aa 522
Claims (10)
1.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是C1)或C2)，
C1)核苷酸序列是SEQ ID No.2第2405-2641位所示的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2第2405-2647位所示的DNA分子。
2.应用，其特征在于：所述应用为A1)-A3)中任一项：
A1)权利要求1所述的DNA分子作为启动子的应用；
A2)权利要求1所述DNA分子作为启动子在启动目的基因表达中的应用；
A3)权利要求1所述DNA分子作为启动子在启动目的基因在植物中表达中的应用。
3.一种DNA分子，包括目的基因和位于所述目的基因上游启动所述目的基因表达的启动子，所述启动子为权利要求1所述的DNA分子。
4.含有权利要求3所述DNA分子的表达盒。
5.含有权利要求3所述DNA分子的重组表达载体或含有权利要求4所述表达盒的重组表达载体。
6.含有权利要求3所述DNA分子的重组微生物或含有权利要求4所述表达盒的重组微生物或含有权利要求5所述重组表达载体的重组微生物。
7.含有权利要求3所述DNA分子的生物材料在调控植物中目的基因表达中的应用；
所述生物材料为B1)-B6)中任意一种：
B1)权利要求4所述的表达盒；
B2)权利要求5所述的重组载体；
B3)权利要求6所述的重组微生物；
B4)、含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有权利要求3所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有权利要求4所述重组载体的转基因植物细胞系；
B5)、含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物组织、或含有权利要求3所述表达盒的转基因植物组织、或含有权利要求4所述重组载体的转基因植物组织；
B6)、含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物器官、或含有权利要求3所述表达盒的转基因植物器官、或含有权利要求4所述重组载体的转基因植物器官。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述调控目的基因的表达为提高目的基因的表达。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述植物选自P1)-P10)中任一种：
P1)双子叶植物；
P2)茄科植物；
P3)烟草属植物；
P4)烟草；
P5)藜科植物；
P6)菠菜属植物；
P7)菠菜；
P8)芸香科植物；
P9)柑橘属植物；
P10)柑橘。
10.一种在植物中表达目的基因的方法，是将权利要求3所述DNA分子导入目的植物，从而在目的植物中表达所述目的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210490305.XA CN117050994A (zh) | 2022-05-07 | 2022-05-07 | 优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210490305.XA CN117050994A (zh) | 2022-05-07 | 2022-05-07 | 优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117050994A true CN117050994A (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=88667943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210490305.XA Pending CN117050994A (zh) | 2022-05-07 | 2022-05-07 | 优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117050994A (zh) |
-
2022
- 2022-05-07 CN CN202210490305.XA patent/CN117050994A/zh active Pending
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