CN112280798B - 一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用 - Google Patents

一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112280798B
CN112280798B CN202010997682.3A CN202010997682A CN112280798B CN 112280798 B CN112280798 B CN 112280798B CN 202010997682 A CN202010997682 A CN 202010997682A CN 112280798 B CN112280798 B CN 112280798B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
ksk
peaq
spinach green
spinach
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010997682.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112280798A (zh
Inventor
洪益国
俞志明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Normal University
Original Assignee
Hangzhou Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Normal University filed Critical Hangzhou Normal University
Priority to CN202010997682.3A priority Critical patent/CN112280798B/zh
Publication of CN112280798A publication Critical patent/CN112280798A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112280798B publication Critical patent/CN112280798B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用，属于生物学技术领域。本发明包括应用：植物tRNA在保护和/或稳定菠菜绿RNA适配体与荧光素分子DFHBI相互作用并实现菠菜绿RNA在植物体内可视化的应用。还包括一种方法：构建赖氨酸转运RNA‑菠菜绿RNA‑赖氨酸转运RNA，亚克隆至pEAQ‑HT载体中，得到pEAQ‑HT/KSK，用基因枪法将pEAQ‑HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，洋葱表皮浸润至DFHBI溶液中，在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。本发明利用分子信号标记、RNA结合标记蛋白及基于RNA适配体等方法，实现了RNA在植物活细胞内可视化。

Description

一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用。
背景技术
RNA主要作为信使将遗传信息从DNA传递到蛋白质。然而，RNA具有更加广泛的功能。越来越的证据证实RNA可以在转录、转录后和翻译水平上调节基因表达。植物中细胞mRNA、小干涉RNA（siRNA）、微小RNA以及病原性病毒和类病毒RNA可以通过胞间连丝在细胞之间移动，以及通过韧皮部高速公路扩散到远端组织。其中一些移动的RNA充当细胞内和细胞间以及系统性信号，以控制植物的防御，生长和发育。例如，流动的赤霉素不敏感基因（GAI）mRNA能够调节拟南芥，番茄和南瓜的叶片形态。CmNACP的系统移动会影响南瓜的芽和根尖分生组织的维持。BEL5 mRNA从叶尖移动到茎尖，促进马铃薯中块茎的形成和发育。移动的AtFT和ATCmRNA能够调控拟南芥开花。此外，许多RNA还能在不同植物之间或同种植物不同生态型之间嫁接的接穗间移动；在寄生植物与寄主之间双向移动，甚至在植物与真菌之间移动。因此，这类移动的RNA具有应对生物或非生物胁迫以及植物的生长发育巨大的潜力。这些新兴的RNA生理学前沿科学，需要开发新技术来对植物RNA进行可视化。
RNA可视化可以通过采用分子信号标记（MBs）、RNA结合标记蛋白（RBLPs）以及基于RNA适配体等方法实现。分子信号标记（MBs）涉及一种特异性探针，在均质溶液中可与靶RNA完美互补。RNA结合标记蛋白（RBLPs），比如MS2，PUM-HD，hnRNPA1，λN22，Cas9，Cas13a等，可以与特定RNA序列结合后可用于检测目标RNA。与MB及RBLP方法检测RNA不同，RNA适配体-菠菜绿（Spinach,也叫24-2或者24-2min）以及它的衍生物Spinach2可以将目标RNA模拟成绿色荧光蛋白（GFP）一样对RNA进行可视化。这些RNA适配体结合荧光素分子DFHBI（3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮）后会形成分子内G四联体从而发出绿色荧光。这个技术已经成功应用于大肠杆菌，酵母以及人类细胞的RNA直接标记，并且还用于定量细胞内的微小RNA。与菠菜绿Spinach类似的思路，最近，还开发了一种名为Pepper的荧光RNA适配体。Pepper通过与荧光素（（4-（（（2-羟乙基）（甲基）氨基）-亚苄基）-氰基苯基乙腈）结合在哺乳动物细胞中成像RNA。虽然基于菠菜绿RNA适配体荧光技术在植物领域引起了足够的重视，但一直未成功。本研究中，我们通过在洋葱表皮细胞中瞬时转入菠菜绿RNA，实现了在植物中“RNA模仿GFP”，本技术可用于RNA的可视化。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用。本发明利用洋葱表皮细胞无叶绿体的特点，利用基因枪的高压气体，将包裹有pEAQ-HT/KSK质粒大量导入到洋葱表皮细胞中。再通过DFHBI染料浸润染色后，即可在激光共聚焦显微镜中观察到绿色荧光。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
植物tRNA在保护和/或稳定菠菜绿RNA适配体（Spinach, S）与荧光素分子DFHBI相互作用并实现菠菜绿RNA在植物体内可视化的应用。
所述的应用，其特征在于所述植物tRNA为赖氨酸转运RNA（Lysine Transfer RNA,K）。
一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA即KSK；
2）将KSK亚克隆至pEAQ-HT载体中，得到pEAQ-HT/KSK，其核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；
3）采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，与DFHBI相互作用，在激光共聚焦显微镜下观察。
所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述步骤1）具体为：直接合成5’端含有Age I，3’端含有Sma I酶切位点序列的KSK片段，克隆赖氨酸转运RNA和菠菜绿RNA，构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA（KSK），赖氨酸转运RNA核苷酸序列（K）如SEQ ID No.1所示，菠菜绿RNA核苷酸序列（S）如SEQ ID No.2所示，赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA序列如SEQ ID No.3所示。
所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述步骤3）具体为：采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，轰击12小时后，将洋葱表皮浸润至100-200µM DFHBI溶液中30min，然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。
所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述基因枪法具体为：采用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒，提取pEAQ-HT/KSK质粒，浓缩后调至终浓度为1µg/µl，制备包裹pEAQ-HT/KSK质粒的金粉，空气中干燥，再加入30µl无水乙醇，取10µl金粉加至载样膜上，利用基因枪系统进行轰击，所述包裹质粒的金粉制备方法为：称取1.5mg直径为1µm的金粉，用70%乙醇洗涤一次，用100%乙醇洗涤两次，快速离心去上清后，获得洗净的金粉，空气中干燥，加50µl的50%甘油悬浮，然后依次加入10µgpEAQ-HT/KSK质粒，50µl浓度为2.5M的CaCl2溶液，20µl的0.1M的亚精胺，以及250µl的70%乙醇，每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒，待所有试剂加完后，快速离心，去除上清，沉淀即为包裹质粒的金粉。
所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述高渗培养基包括：含0.8%植物凝胶的1/2 MS固体培养基，pH=5.8，内含46.67g/L山梨醇，46.67g/L甘露醇。
所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述DFHBI溶液浓度为：100µM。
本发明利用分子信号标记、RNA结合标记蛋白以及基于RNA适配体等方法，实现了RNA在植物活细胞内可视化。赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA（缩写为KSK），一旦转入到无叶绿体的洋葱表皮细胞中，在荧光素分子DFHBI存在下，就可以发出很强的绿色荧光。
附图说明
图1为菠菜绿RNA在洋葱表皮细胞中发绿色荧光；
图2为KSK洋葱表皮细胞RNA模拟GFP洋葱细胞放大图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA，简称KSK
克隆赖氨酸转运RNA和菠菜绿RNA，直接合成5’端含有Age I，3’端含有Sma I酶切位点序列的KSK片段，构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA。赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，菠菜绿RNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA序列如SEQ ID No.3所示。
实施例2：KSK转入载体
将KSK亚克隆至pEAQ-HT载体中，得到pEAQ-HT/KSK，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
以含有KK序列的PVX/KK载体做模板，利用以下引物得到PCR扩增KK产物，回收PCR产物并利用Nru I及Xho I双酶切后，连接到采用相同两个酶酶切后的线性化pEAQ-HT空载体而得到。
（pEAQ-HT/K-K For 5'-ATATCGCGACAATCACAGTGTTGGCTTGCAAAC-3' 下划线为NruI酶切识别位点；pEAQ-HT/K-K Rev5'-ATACTCGAGTTGACCCTATGGGCTGTGTTG-3'下划线为XhoI酶切识别位点）pEAQ-HT/KSK载体是直接合成5’端含有Age I，3’端含有Sma I酶切位点序列的KSK片段，酶切处理后，连入线性化pEAQ-HT空载体（Age I和Sma I双酶切后回收的pEAQ-HT质粒）而得到。
实施例3：洋葱表皮观察到足够强的绿色荧光
采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，高渗培养基包括：0.8%植物凝胶的1/2 MS培养基，pH=5.8，46.67g/L内含山梨醇，46.67g/L甘露醇。轰击12小时后，将洋葱表皮浸润至100µM的DFHBI溶液中30min，然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光。
基因枪法具体为：采用Qiagen公司QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒，提取pEAQ-HT/KSK质粒，浓缩后调至终浓度为1µg/µl。制备包裹pEAQ-HT/KSK质粒的金粉，方法为：称取1.5mg直径为1µm的金粉，用70%乙醇洗涤一次，用100%乙醇洗涤两次，快速离心去上清后，获得洗净的金粉，空气中干燥，加50µl的50%甘油悬浮，然后依次加入10µgpEAQ-HT/KSK，50µl浓度为2.5M的CaCl2溶液，20µl的0.1M的亚精胺，以及250µl的70%乙醇，每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒，待所有试剂加完后，快速离心，去除上清，沉淀即为包裹质粒的金粉。空气中干燥，再加入30µl无水乙醇，取10µl金粉加至载样膜上，利用基因枪系统进行轰击。
DFHBI溶液制备：荧光素分子DFHBI（3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮）购自于美国LucernaTM公司。将DFHBI溶解于DMSO，制备40mM浓度的母液。用HEPES缓冲液（pH为7.5）稀释成2 mM的DFHBI，含有5%的DMSO的工作液体。在本研究中RNA模拟GFP实验中（RMG），DFHBI终浓度为100µM。
实施例4：基于菠菜绿的洋葱表皮细胞RNA类似GFP观察
为了在植物细胞中瞬时高效表达菠菜绿，我们亚克隆KK和KSK到双元载体pEAQ-HT载体中，分别命名为pEAQ-HT/KK，pEAQ-HT/KSK（图1A）。基因枪法pEAQ-HT/KK，pEAQ-HT/KSK以及pEAQ-HT/GFP质粒攻击至没有叶绿体的洋葱表皮细胞中。GFP作为阳性对照。轰击12小时后，可以观察到GFP蛋白的荧光信号（如图1B、1C）。在DFHBI存在下，与KK对照相比（图1D、1E），可以看到KSK有很强的绿色荧光（如图1F和1G、图2）。
图1中，A为pEAQ-HT/GFP，KK，KSK载体表达盒示意图；将GFP，KK，KSK克隆至pEAQ-HT载体的多克隆位点内，箭头表示花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，竖向垂直线段表示花椰菜花叶病毒转录终止序列，MCS表示多克隆位点，在MCS的两端，分别是豇豆花叶病毒的5’及3’非翻译区；P19为番茄丛矮病毒RNA沉默抑制子。B-C为pEAQ-HT/GFP阳性对照FITC通道荧光及可见光照片；D-E为pEAQ-HT/KK阴性对照FITC通道荧光及可见光照片；F-G为pEAQ-HT/KSK的FITC通道荧光及可见光照片；照片均为基因枪轰击12小时后拍摄，在B-C中，标尺为100μm，E-G中，标尺为50μm。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 一种基于菠菜绿RNA可视化的方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 73
<212> RNA
<213> 赖氨酸转运RNA(Lysine Transfer RNA)
<400> 1
gcccgucuag cucaguuggu agagcgcaag gcucuuaacc uuguggucgu ggguucgagc 60
cccacggugg gcg 73
<210> 2
<211> 80
<212> RNA
<213> 菠菜绿RNA(Spinach)
<400> 2
gacgcgaccg aaauggugaa ggacgggucc agugcuucgg cacuguugag uagaguguga 60
gcuccguaac uggucgcguc 80
<210> 3
<211> 250
<212> RNA
<213> 赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA(Lysine Transfer RNA-Spinach-Lysine Transfer RNA)
<400> 3
accggugccc gucuagcuca guugguagag cgcaaggcuc uuaaccuugu ggucgugggu 60
ucgagcccca cggugggcga agcuugacgc gaccgaaaug gugaaggacg gguccagugc 120
uucggcacug uugaguagag ugugagcucc guaacugguc gcgucgcaug cgcccgucua 180
gcucaguugg uagagcgcaa ggcucuuaac cuuguggucg uggguucgag ccccacggug 240
ggcgcccggg 250
<210> 4
<211> 10193
<212> DNA
<213> pEAQ-HT/KSK(pEAQ-HT/KSK)
<400> 4
cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa accttttcac gcccttttaa 60
atatccgatt attctaataa acgctctttt ctcttaggtt tacccgccaa tatatcctgt 120
caaacactga tagtttgtga accatcaccc aaatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 180
aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 240
gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgccat tcaggctgcg 300
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 360
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 420
taaaacgacg gccagtgaat tgttaattaa gaattcgagc tccaccgcgg aaacctcctc 480
ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgagaaga tagtggaaaa ggaaggtggc 540
tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac 600
agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 660
accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca 720
caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag 780
aggtattaaa atcttaatag gttttgataa aagcgaacgt ggggaaaccc gaaccaaacc 840
ttcttctaaa ctctctctca tctctcttaa agcaaacttc tctcttgtct ttcttgcgtg 900
agcgatcttc aacgttgtca gatcgtgctt cggcaccagt acaacgtttt ctttcactga 960
agcgaaatca aagatctctt tgtggacacg tagtgcggcg ccattaaata acgtgtactt 1020
gtcctattct tgtcggtgtg gtcttgggaa aagaaagctt gctggaggct gctgttcagc 1080
cccatacatt acttgttacg attctgctga ctttcggcgg gtgcaatatc tctacttctg 1140
cttgacgagg tattgttgcc tgtacttctt tcttcttctt cttgctgatt ggttctataa 1200
gaaatctagt attttctttg aaacagagtt ttcccgtggt tttcgaactt ggagaaagat 1260
tgttaagctt ctgtatattc tgcccaaatt cgcgaccggt gcccgtctag ctcagttggt 1320
agagcgcaag gctcttaacc ttgtggtcgt gggttcgagc cccacggtgg gcgaagcttg 1380
acgcgaccga aatggtgaag gacgggtcca gtgcttcggc actgttgagt agagtgtgag 1440
ctccgtaact ggtcgcgtcg catgcgcccg tctagctcag ttggtagagc gcaaggctct 1500
taaccttgtg gtcgtgggtt cgagccccac ggtgggcgct cgaggccttt aactctggtt 1560
tcattaaatt ttctttagtt tgaatttact gttattcggt gtgcatttct atgtttggtg 1620
agcggttttc tgtgctcaga gtgtgtttat tttatgtaat ttaatttctt tgtgagctcc 1680
tgtttagcag gtcgtccctt cagcaaggac acaaaaagat tttaatttta ttaaaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa gaccgggaat tcgatatcaa gcttatcgac ctgcagatcg ttcaaacatt 1800
tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 1860
tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 1920
agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 1980
atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatctc 2040
tagagtctca agcttggcgc gccagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg ttgcgattaa 2100
gaattcgagc tcggtacccc cctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct cagaagacca 2160
aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatttcggga aacctcctcg gattccattg 2220
cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct cctacaaatg 2280
ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 2340
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 2400
aaagcaagtg gattgatgtg acatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta 2460
tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggacagccca 2520
agcttcgact ctagaggatc cccttaaatc gatatggaac gagctataca aggaaacgac 2580
gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg gatggaggat caggaggtac cacttctccc 2640
ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg actgagtggc ggctacataa cgatgagacg 2700
aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta 2760
tttaagagat atctcagata cgacaggacg gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct 2820
tggacgggag attcggttaa ctatgcagca tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga 2880
tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt agtatcaccg tttctggagg gtctcgaact 2940
cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca 3000
atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga tgccctgaag gtactgagac cttcgaaaaa 3060
gaaagcgagt aaggggagct cgaattcgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat 3120
ctctctctat tttctccata aataatgtgt gagtagtttc ccgataaggg aaattagggt 3180
tcttataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt 3240
tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtactaaaat 3300
ccagatctcc taaagtccct atagatcttt gtcgtgaata taaaccagac acgagacgac 3360
taaacctgga gcccagacgc cgttcgaagc tagaagtacc gcttaggcag gaggccgtta 3420
gggaaaagat gctaaggcag ggttggttac gttgactccc ccgtaggttt ggtttaaata 3480
tgatgaagtg gacggaagga aggaggaaga caaggaagga taaggttgca ggccctgtgc 3540
aaggtaagaa gatggaaatt tgatagaggt acgctactat acttatacta tacgctaagg 3600
gaatgcttgt atttataccc tataccccct aataacccct tatcaattta agaaataatc 3660
cgcataagcc cccgcttaaa aattggtatc agagccatga ataggtctat gaccaaaact 3720
caagaggata aaacctcacc aaaatacgaa agagttctta actctaaaga taaaagatgg 3780
cgcgtggccg gcctacagta tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg 3840
atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc 3900
actcagccgc gggtttctgg agtttaatga gctaagcaca tacgtcagaa accattattg 3960
cgcgttcaaa agtcgcctaa ggtcactatc agctagcaaa tatttcttgt caaaaatgct 4020
ccactgacgt tccataaatt cccctcggta tccaattaga gtctcatatt cactctcaat 4080
ccaaataatc tgcaccggat ctggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4140
aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4200
cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 4260
caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 4320
gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 4380
ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 4440
tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 4500
tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 4560
agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 4620
actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgat gatctcgtcg tgacccatgg 4680
cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 4740
tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 4800
tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 4860
cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 4920
gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc 4980
gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc 5040
ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacg ggatctctgc ggaacaggcg 5100
gtcgaaggtg ccgatatcat tacgacagca acggccgaca agcacaacgc cacgatcctg 5160
agcgacaata tgatcgcggc gtccacatca acggcgtcgg cggcgactgc ccaggcaaga 5220
ccgagatgca ccgcgatatc ttgctgcgtt cggatatttt cgtggagttc ccgccacaga 5280
cccggatgat ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg 5340
ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa 5400
ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat 5460
tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc 5520
gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg actgtaggcc ggccctcact ggtgaaaaga 5580
aaaaccaccc cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa 5640
tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa cagctccccg accggcagct 5700
cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag cccatcagtc cgggacggcg tcagcgggag 5760
agccgttgta aggcggcaga ctttgctcat gttaccgatg ctattcggaa gaacggcaac 5820
taagctgccg ggtttgaaac acggatgatc tcgcggaggg tagcatgttg attgtaacga 5880
tgacagagcg ttgctgcctg tgatcaaata tcatctccct cgcagagatc cgaattatca 5940
gccttcttat tcatttctcg cttaaccgtg acagagtaga caggctgtct cgcggccgag 6000
gggcgcagcc cctggggggg atgggaggcc cgcgttagcg ggccgggagg gttcgagaag 6060
ggggggcacc ccccttcggc gtgcgcggtc acgcgcacag ggcgcagccc tggttaaaaa 6120
caaggtttat aaatattggt ttaaaagcag gttaaaagac aggttagcgg tggccgaaaa 6180
acgggcggaa acccttgcaa atgctggatt ttctgcctgt ggacagcccc tcaaatgtca 6240
ataggtgcgc ccctcatctg tcagcactct gcccctcaag tgtcaaggat cgcgcccctc 6300
atctgtcagt agtcgcgccc ctcaagtgtc aataccgcag ggcacttatc cccaggcttg 6360
tccacatcat ctgtgggaaa ctcgcgtaaa atcaggcgtt ttcgccgatt tgcgaggctg 6420
gccagctcca cgtcgccggc cgaaatcgag cctgcccctc atctgtcaac gccgcgccgg 6480
gtgagtcggc ccctcaagtg tcaacgtccg cccctcatct gtcagtgagg gccaagtttt 6540
ccgcgaggta tccacaacgc cggcggccgc ggtgtctcgc acacggcttc gacggcgttt 6600
ctggcgcgtt tgcagggcca tagacggccg ccagcccagc ggcgagggca accagcccgg 6660
tgagcgtcgg aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg tgatgtacac tagtcgctgg 6720
ctgctgaacc cccagccgga actgacccca caaggcccta gcgtttgcaa tgcaccaggt 6780
catcattgac ccaggcgtgt tccaccaggc cgctgcctcg caactcttcg caggcttcgc 6840
cgacctgctc gcgccacttc ttcacgcggg tggaatccga tccgcacatg aggcggaagg 6900
tttccagctt gagcgggtac ggctcccggt gcgagctgaa atagtcgaac atccgtcggg 6960
ccgtcggcga cagcttgcgg tacttctccc atatgaattt cgtgtagtgg tcgccagcaa 7020
acagcacgac gatttcctcg tcgatcagga cctggcaacg ggacgttttc ttgccacggt 7080
ccaggacgcg gaagcggtgc agcagcgaca ccgattccag gtgcccaacg cggtcggacg 7140
tgaagcccat cgccgtcgcc tgtaggcgcg acaggcattc ctcggccttc gtgtaatacc 7200
ggccattgat cgaccagccc aggtcctggc aaagctcgta gaacgtgaag gtgatcggct 7260
cgccgatagg ggtgcgcttc gcgtactcca acacctgctg ccacaccagt tcgtcatcgt 7320
cggcccgcag ctcgacgccg gtgtaggtga tcttcacgtc cttgttgacg tggaaaatga 7380
ccttgttttg cagcgcctcg cgcgggattt tcttgttgcg cgtggtgaac agggcagagc 7440
gggccgtgtc gtttggcatc gctcgcatcg tgtccggcca cggcgcaata tcgaacaagg 7500
aaagctgcat ttccttgatc tgctgcttcg tgtgtttcag caacgcggcc tgcttggcct 7560
cgctgacctg ttttgccagg tcctcgccgg cggtttttcg cttcttggtc gtcatagttc 7620
ctcgcgtgtc gatggtcatc gacttcgcca aacctgccgc ctcctgttcg agacgacgcg 7680
aacgctccac ggcggccgat ggcgcgggca gggcaggggg agccagttgc acgctgtcgc 7740
gctcgatctt ggccgtagct tgctggacca tcgagccgac ggactggaag gtttcgcggg 7800
gcgcacgcat gacggtgcgg cttgcgatgg tttcggcatc ctcggcggaa aaccccgcgt 7860
cgatcagttc ttgcctgtat gccttccggt caaacgtccg attcattcac cctccttgcg 7920
ggattgcccc gactcacgcc ggggcaatgt gcccttattc ctgatttgac ccgcctggtg 7980
ccttggtgtc cagataatcc accttatcgg caatgaagtc ggtcccgtag accgtctggc 8040
cgtccttctc gtacttggta ttccgaatct tgccctgcac gaataccagc gaccccttgc 8100
ccaaatactt gccgtgggcc tcggcctgag agccaaaaca cttgatgcgg aagaagtcgg 8160
tgcgctcctg cttgtcgccg gcatcgttgc gccacatcta ggtactaaaa caattcatcc 8220
agtaaaatat aatattttat tttctcccaa tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat 8280
agctcgacat actgttcttc cccgatatcc tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg 8340
tcataccact tgtccgccct gccgcttctc ccaagatcaa taaagccact tactttgcca 8400
tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg 8460
ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcttct 8520
tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca gtaagtaatc caattcggct 8580
aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc 8640
ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct 8700
tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt 8760
tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca gccatagcat catgtccttt 8820
tcccgttcca catcataggt ggtcccttta taccggctgt ccgtcatttt taaatatagg 8880
ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag acattccttc cgtatctttt 8940
acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg atattctcat tttagccatt 9000
tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc ccaagaagct aattataaca 9060
agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct taaataccag aaaacagctt 9120
tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc gacggagccg attttgaaac 9180
cacaattatg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt ttttgaggtg 9240
ctccagtggc ttctgtttct atcagctgtc cctcctgttc agctactgac ggggtggtgc 9300
gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc gctatctctg ctctcactgc cgtaaaacat 9360
ggcaactgca gttcacttac accgcttctc aacccggtac gcaccagaaa atcattgata 9420
tggccatgaa tggcgttgga tgccgggcaa cagcccgcat tatgggcgtt ggcctcaaca 9480
cgattttacg tcacttaaaa aactcaggcc gcagtcggta actatgcggt gtgaaatacc 9540
gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga 9600
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 9660
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 9720
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 9780
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 9840
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 9900
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 9960
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 10020
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 10080
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc aggtaacctc gcgcatacag ccgggcagtg 10140
acgtcatcgt ctgcgcggaa atggacgggc ccccggcgcc agatctgggg aac 10193

Claims (4)

1.植物tRNA在保护和/或稳定菠菜绿RNA适配体与荧光素分子DFHBI相互作用并实现菠菜绿RNA在植物体内可视化的应用，所述植物tRNA为赖氨酸转运RNA，具体为赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA，所述赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA即KSK，具体为：直接合成5’端含有Age I，3’端含有Sma I酶切位点序列的KSK片段，克隆赖氨酸转运RNA和菠菜绿RNA，构建赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA，赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，菠菜绿RNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，赖氨酸转运RNA-菠菜绿RNA-赖氨酸转运RNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
2）将KSK亚克隆至pEAQ-HT载体中，得到pEAQ-HT/KSK，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
3）采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，与DFHBI相互作用，在激光共聚焦显微镜下观察，具体为：采用基因枪法将pEAQ-HT/KSK攻击至无叶绿体的洋葱表皮细胞中，将洋葱表皮放置在高渗培养基上，轰击12小时后，将洋葱表皮浸润至100-200µM DFHBI溶液中30min，然后在激光共聚焦显微镜下观察到足够强的绿色荧光；
所述基因枪法具体为：采用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒，提取pEAQ-HT/KSK质粒，浓缩后调至终浓度为1µg/µl，制备包裹pEAQ-HT/KSK质粒的金粉，空气中干燥，再加入30µl无水乙醇，取10µl金粉加至载样膜上，利用基因枪系统进行轰击，所述包裹质粒的金粉制备方法为：称取1.5mg直径为1µm的金粉，用70%乙醇洗涤一次，用100%乙醇洗涤两次，快速离心去上清后，获得洗净的金粉，空气中干燥，加50µl的50%甘油悬浮，然后依次加入10µgpEAQ-HT/KSK质粒，50µl浓度为2.5M的CaCl2溶液，20µl的0.1M的亚精胺，以及250µl的70%乙醇，每加入一样试剂均剧烈涡旋2-3秒，待所有试剂加完后，快速离心，去除上清，沉淀即为包裹质粒的金粉。
3.如权利要求2所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述高渗培养基包括：含0.8%植物凝胶的1/2 MS固体培养基，pH=5.8，内含46.67g/L山梨醇，46.67g/L甘露醇。
4.如权利要求2所述的一种基于菠菜绿RNA可视化的方法，其特征在于所述DFHBI溶液浓度为：100µM。
CN202010997682.3A 2020-09-21 2020-09-21 一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用 Active CN112280798B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010997682.3A CN112280798B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010997682.3A CN112280798B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112280798A CN112280798A (zh) 2021-01-29
CN112280798B true CN112280798B (zh) 2023-01-10

Family

ID=74422113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010997682.3A Active CN112280798B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112280798B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104962561A (zh) * 2015-06-25 2015-10-07 河南农业大学 酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法
EP3211083A1 (en) * 2016-02-26 2017-08-30 Centre National De La Recherche Scientifique Fluorescent aptamers and their applications
WO2020116446A1 (ja) * 2018-12-03 2020-06-11 国立研究開発法人科学技術振興機構 蛍光発生核酸分子、及び標的ｒｎａの蛍光標識方法
CN111593052A (zh) * 2019-04-28 2020-08-28 华东理工大学 一种rna检测与定量的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013016694A2 (en) * 2011-07-27 2013-01-31 Cornell University Methods for rna detection and quantification

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104962561A (zh) * 2015-06-25 2015-10-07 河南农业大学 酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法
EP3211083A1 (en) * 2016-02-26 2017-08-30 Centre National De La Recherche Scientifique Fluorescent aptamers and their applications
WO2020116446A1 (ja) * 2018-12-03 2020-06-11 国立研究開発法人科学技術振興機構 蛍光発生核酸分子、及び標的ｒｎａの蛍光標識方法
CN111593052A (zh) * 2019-04-28 2020-08-28 华东理工大学 一种rna检测与定量的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A genetically encoded fluorescent tRNA is active in live-cell protein synthesis;A genetically encoded fluorescent tRNA is active in live-cell pr;《 Nucleic Acids Research》;20161212;第45卷(第7期);第4081~4093页 *
FASTmiR: an RNA-based sensor for in vitro quantification and live-cell localization of small RNAs;Kun Huang1 et al.;《Nucleic Acids Research》;20170606;第45卷(第14期);第e130页 *
PREDICTED: Cannabis sativa methylsterol monooxygenase 1-1 (LOC115716028), mRNA;NCBI;《GenBank》;20200518;ACCESSION number:XM_030644714 *
Spinach-based RNA mimicking GFP in plant cells;Yu, Zhiming et al.;《FUNCTIONAL & INTEGRATIVE GENOMICS》;20220323;第22卷(第3期);第423-428页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112280798A (zh) 2021-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wydro et al. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana
US6369296B1 (en) Recombinant plant viral vectors
EP2385130B1 (en) Method for producing recombinant proteins from plant hairy roots
Verchot et al. Development of a reverse genetic system for studying rose rosette virus in whole plants
CN105939599B (zh) 使用柑橘衰退病毒载体进行外源基因表达
CN112280798B (zh) 一种基于菠菜绿rna可视化的方法及其应用
CN113355292B (zh) 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用
CN108130340B (zh) 表达鸭源禽流感病毒ns1蛋白的方法以及该方法的应用
Maiti et al. Gene expression regulated by gene VI of caulimovirus: transactivation of downstream genes of transcripts by gene VI of peanut chlorotic streak virus in transgenic tobacco
US20120284871A1 (en) Protein expression systems
CN105823888B (zh) 一种利用甘蔗条纹花叶病毒p3n-pipo构建的亚细胞定位试剂盒
CN101182530B (zh) 一种诱导增强性组成型启动子及其应用
Kanneganti et al. In planta expression of oomycete and fungal genes
CN114438115A (zh) 一种CRISPR/Cas9基因编辑载体、构建方法及其应用
Jung et al. Use of animal viral internal ribosome entry site sequence makes multiple truncated transcripts without mediating polycistronic expression in rice
CN110157710A (zh) 花烟草NaD1基因启动子及其用途
CN112501177B (zh) 促进丹参侧根发育并提高丹参根中丹参酮含量的方法、丹参基因序列以及过表达载体
KR101724370B1 (ko) Trsv 재조합 벡터 및 이의 용도
KR100354972B1 (ko) 닭전염성기관지염 바이러스 ｓ1 단백질을 발현하는유전자재조합 마렉바이러스 및 그의 제조방법
Shrestha et al. Identification of novel pararetroviral promoters for designing efficient plant gene expression systems
Stevens et al. Production of a full-length infectious GFP-tagged cDNA clone of Beet mild yellowing virus for the study of plant–polerovirus interactions
CN106947764B (zh) 一种植物根特异性启动子及其应用
CN117050994A (zh) 优化的病毒载体亚基因组启动子及其应用
EP0419666A1 (en) Promoter, plasmid containing the same, and recombinant avipoxvirus
CN114621974B (zh) 植物单基因或多基因crispr激活技术的载体及构建方法、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant