CN114621974B - 植物单基因或多基因crispr激活技术的载体及构建方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用，所述载体为能表达sgRNA的TRV2载体；TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV‑BsaI‑BsaI‑sgRNA2.0，序列如SEQ ID NO.9所示；其中，两个BsaI位点为sgRNA插入位点，采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，并插入到TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2‑SG2.0。本发明所述载体只需完成一次番茄遗传转化，获得SlAct3.0line植株后，仅需针对不同的靶标基因构建含有靶向其启动子区sgRNA的TRV2载体，并侵染SlAct3.0line植株，在3周内即可快速高效的获得不同靶基因的过表达植物材料，而通过传统的遗传转化获得基因过表达植株则需要将近1年的时间，因此该方法更加快捷高效，省时省力，极大缩短了试验周期。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因编辑载体，具体为植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用。
背景技术
近年来，CRISPR/Cas基因组编辑技术因其准确、高效、简单的操作优势而发展迅速，在植物基因功能研究、遗传育种等方面得到了广泛的应用，已成为分子生物学领域的重要研究手段。目前，在植物基因功能研究方面，CRISPR/Cas技术主要用于创制目的基因功能缺失突变体，即在sgRNA的引导下，Cas蛋白在靶标区域进行DNA双链切割，而后在植物内源DNA修复机制的作用下，使靶标区域发生碱基的插入或缺失，从而使目的基因丧失编码正常蛋白的能力，最终获得目的基因的功能缺失突变体。然而，为了全面科学地研究目的基因的功能，研究者往往还需要创制目的基因过量表达的遗传材料，如果目的基因片段较大、或者要实现多个基因同时过表达，则克隆目的基因片段、构建过量表达载体等过程就会十分繁琐，费时费力。
随着CRISPR/Cas技术的发展，研究发现，Cas9蛋白的RuvC1和HNH核酸酶结构域各发生一个氨基酸突变后(D10A和H841A)，会形成核酸酶活性丧失的Cas9(dead Cas9，dCas9)。dCas9与sgRNA共同表达时，仍会形成DNA识别复合物，且该复合物只与靶DNA紧密结合而不诱导切割靶基因。基于这样的发现，研究人员将一个组成型转录激活结构域VP64与dCas9形成融合蛋白，在转录水平上实现了目的基因的转录激活。后来，研究者对CRISPR-dCas9系统激活基因转录的结构进行了优化，陆续开发出了dCas9–SunTag，dCas9–TV，dCasEV2.1和CRISPR–Act2.0等转录激活系统。近期，Pan等人在CRISPR–Act2.0的基础上，又开发出了比上述几种系统都更加高效的CRISPR–Act3.0系统，该团队也将Cas12b和SpRY变体等应用到了CRISPR–Act3.0系统中，实现了靶向富含T的PAM序列或不依赖PAM序列的靶基因激活。然而，该系统主要是在水稻和拟南芥中完成的，而在番茄中仅用了原生质体对其有效性进行了初步探索，在番茄植株中是否有效仍有待研究。此外，跟传统的基因过量表达策略一样，上述基于CRISPR的基因激活系统仍需要进行稳定的遗传转化过程才能获得目的基因过量表达的植物遗传材料，这个过程依然耗时耗力。
植物病毒载体可以在植物体内高效表达向导sgRNA,从而引导Cas蛋白实现靶基因编辑。在植物中，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是一种有效用于病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)的载体，已广泛用于多种植物的功能基因组学研究，如烟草、番茄和棉花等。TRV有一个由两个阳性单链RNA组成的双组分基因组，分别为RNA1和RNA2，并分别被改造为pTRV1与pTRV2两个载体以应用于VIGS。pTRV2可携带并表达外源基因片段用于转录后基因沉默。与基因敲除、转基因、突变体筛选等植物转基因技术相比，VIGS无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便、获得表型快速、成本低等优点，已广泛应用于植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导及生长发育等相关基因功能研究，在植物功能基因组学领域发挥重要作用。Zahir Ali等人在烟草中用TRV2瞬时表达sgRNA，实现了基因敲除。前期研究中，本课题组通过对TRV2载体进行改造，在番茄中瞬时表达一个或多个sgRNA，实现了对番茄单个或多个目标基因的敲除，并利用此技术创制了靶向全基因组的番茄突变体文库。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，在植物中实现对单个或多个目标基因的敲除，从而能够快速高效的获得不同靶基因的过表达植物材料；鉴于此，本发明提供了植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用。
为实现以上目的，以番茄为例，本发明对CRISPR–Act3.0系统进行了一系列优化，包括启动子替换、转录终止子替换、密码子优化等，大大提高了该系统在番茄中的工作效率，优化后的系统命名为CRISPR–SlAct3.0，通过遗传转化，我们获得了CRISPR–SlAct3.0稳定遗传的番茄转基因材料，命名为SlAct3.0 line；同时，我们也对TRV2载体进行了改造，使其表达的sgRNA适用于CRISPR–SlAct3.0。TRV2携带靶向不同基因启动子区的sgRNA,并在SlAct3.0 line中表达，成功实现了单基因或多基因同时激活表达。利用该系统，我们只需完成一次番茄遗传转化获得SlAct3.0 line植株，而后仅需针对不同的靶标基因，构建含有靶向其启动子区sgRNA的TRV2载体，并侵染SlAct3.0 line幼苗，仅在3周内即可快速高效的获得不同靶基因的过表达植物材料，而通过传统的遗传转化获得基因过表达植株则需要近1年的时间，因此该方法更加快捷高效，省时省力，极大缩短了试验周期。
技术方案：植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体，所述载体为能表达sgRNA的TRV2载体；TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV-BsaI-BsaI-sgRNA2.0，序列如下SEQ ID NO.9：GAATTCGAGCATCTTGTTCTGGGGTTTCACACTATCTTTAGAGAAAGTGTTAAGTTAATTAAGTTATCTTAATTAAGAGCATAATTATACTGATTTGTCTCTCGTTGATAGAGTCTATCATTCTGTTACTAAAAATTTGACAACTCGGTTTGCTGACCTACTGGTTACTGTATCACTTACCCGAGTTAACGAGGAGACCATCTAGACGGTCTCTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGTTTT；其中，两个BsaI位点为sgRNA插入位点，采用序列如SEQ ID NO.10：CCGAATTCGAATTCGAGCATCTTGTTCTGG和SEQ ID NO.11：GCGGATCCAAAACAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，并插入到TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2-SG2.0。
优选的，含有sgRNA2.0模块的sgRNA2.0-tRNA序列如下SEQ ID NO.12：AGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA，其以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2-GT2.0。
优选的，所述载体TRV2-SG2.0与多顺反子sgRNA2.0-tRNA用金门连接法组装，得到TRV2-multiSG2.0载体。
以上任一所述植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
S1、TRV2载体改造
人工合成表达sgRNA2.0的模块proPeBV-BsaI-BsaI-sgRNA2.0，序列如SEQ IDNO.9所示；并采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，将扩增产物插入TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2-SG2.0；
S2、人工合成sgRNA2.0-tRNA序列
人工合成序列SEQ ID NO.12，并以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2-GT2.0，后续步骤中pCE2-GT2.0作为模板使用，以合成不同靶标的sgRNA2.0-tRNA单元；
S3、合成TRV2-multiSG2.0载体
依据金门组装原则设计引物，并以S2中的pCE2-GT2.0为模板，通过PCR合成多顺反子sgRNA2.0-tRNA，将多顺反子sgRNA2.0-tRNA与TRV2-SG2.0用金门连接法组装，得到TRV2-multiSG2.0载体。具体方法为：依据金门组装原则(Golden Gate assembly)设计引物并合成多顺反子sgRNA2.0-tRNA(PTG)。为了将多个DNA片段按照一定的顺序用金门组装法连接，DNA片段用BsaI(或其他II型核酸内切酶，如AarI、BbsI、BsmAI、BsmBI)消化后，顺次连接的两个片段需要有且唯一且能重叠的4个碱基，而gRNA间隔区(即靶标序列)是各个PTG之间唯一不同的序列，因此，各PTG应在gRNA间隔区内被划分为两个DNA片段。将多顺反子sgRNA2.0-tRNA与TRV2-SG2.0用金门连接法组装，质粒Sanger测序验证，得到TRV2-multiSG2.0载体。
以上任一所述植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体在制备番茄单基因或多基因过表达材料中的应用。
优选的，应用方法包括以下步骤：
(1)构建CRISPR–SlAct3.0载体
以番茄基因组DNA为模板，以引物EF1a-F、序列如SEQ ID NO.1：GGCTACGGTCTCATCGAAGTTAACGAAAAATTTAATTATTTAAAGTAAG所示，和EF1a-R、序列如SEQ ID NO.2：GGCTACGGTCTCAGTAGTCCATCTTGAGACACTAAGAAACTG所示通过PCR反应扩增得到SlEF1a(Solyc06g005060)启动子，命名为proSlEF1a；以引物RPS5A-F、序列如SEQ ID NO.3：GGCTACGGTCTCATGACTCAGGTGAGAGTCA所示，和RPS5A-R、序列如SEQ ID NO.4：GGCTACGGTCTCTCAGGTCCCATTTCTTCTTCTACTTCTCTTG所示通过PCR反应扩增得到SlRPS5A(Solyc10g078620)启动子，命名为proSlRPS5A；
利用在线网站www.genscript.com/的GenSmartTM Codon Optimization Tool工具，将CRISPR–Act3.0系统中NLS-SpRY-NLS-5*Gslinker-Vp64-T2A-MS2-NLS-10*GCN4模块序列进行针对番茄表达的密码子优化，之后添加rscS-E9t-Ter转录终止子，经商业合成模板后以引物F、SEQ ID NO.5：GGCTACGGTCTCACTACAAGGATCACGATGG，R、SEQ ID NO.6：GGCTACGGTCTCAGTCAGGCAAGTCATAAAATGCATTAAAAAATATTTTC扩增该模板序列；将scFv-sfGFP-2*TAD-GB1进行针对番茄表达的密码子优化，之后添加AtHSP18.2-Ter转录终止子，经商业合成模板后以引物F、SEQ ID NO.7：GGCTACGGTCTCTCCTGATATTGTTATGACA，R、SEQ ID NO.8：GGCTACGGTCTCAAGCTCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCCAT扩增该模板序列；
采用本实验室保存的载体pCAMBIA1300为双元表达载体，采用Golden Gate连接法，将上述克隆获得的4个片段连接到pCAMBIA1300载体上，终载体命名为p1300-SpRY-SlAct3.0，其序列为SEQ ID NO.17；
P1300-SpRY-SlAct3.0载体序列:
TGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGAGCTTGTCGATCGACAGATCCGGTCGGCATCTACTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGTCGTGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATAGCCTCCGCGACCGGTTGTAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTAAACTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCCCCGGGATCTGCGAAAGCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGgagaccatctagacggtctcAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGAGCGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGACTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTT。
(2)构建番茄转基因材料
采用叶盘转化法，将p1300-SpRY-SlAct3.0转化番茄品种Ailsa Craig，获得转基因材料，命名为SlAct3.0 line；
(3)载体侵染
将SlAct3.0 line的番茄种子发芽至0.5-1cm后进行抽真空侵染，采用冻融法将pTRV1，TRV2-SG2.0或TRV2-multiSG2.0载体质粒导入根癌农杆菌菌株GV3101，涂布LB平板(含卡那霉素(50μg/mL)、利福平(25μg/mL)、庆大霉素(25μg/mL)3种抗生素)，然后挑斑、摇菌至OD600值在0.8-1.0之间，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体沉淀至OD600＝1-1.5，按照体积比pTRV1：TRV2-SG2.0＝1:1(单基因过表达)或者pTRV1：TRV2-multiSG2.0＝1:1(多基因过表达)混合侵染。采用抽真空法侵染发芽种子，经qRT-PCR鉴定靶标基因的表达水平，制备获得番茄单基因或多基因过表达材料。具体侵染过程如下：
将SlAct3.0 line的番茄种子用无菌水在烧瓶中发芽。瓶子放在25号的瓶子里以每分钟200转的速度摇24小时。用滤纸和无菌水将种子转移到平板上。发芽约24h后，种子发芽长度达0.5～1cm，进行抽真空侵染。
采用冻融法将pTRV1、TRV2-SG2.0或TRV2-multiSG2.0导入根癌农杆菌菌株GV3101。将含有目标基因的农杆菌涂LB平板(含卡那霉素(50μg/mL)、利福平(25μg/mL)、庆大霉素(25μg/mL)3种抗生素)，28℃培养2天左右出现单菌落。挑取单菌落于含有3mL LB培养基的10mL离心管中，28℃，200rpm摇菌24h。按1：100比例将上述农杆菌菌液加入3种相同抗生素的50mLB培养基中，扩大培养至OD600值在0.8-1.0之间(约12h)。4000g，4℃，离心10min，弃上清。预冷侵染液悬浮沉淀至OD600＝1-1.5(侵染液配制：10mM氯化镁、10mM MES，pH＝5.7，用时加乙酰丁香酮至150μM)。室温放置3h混合侵染。
在每1.5或2.0ml离心管中放置渗透混合物和发芽种子(约10粒)。然后，将离心管放入真空干燥器中。利用幼芽真空渗透系统一个连接到便携式空气压缩机(GAST)的真空干燥机将农杆菌渗透到幼芽中。相对真空度为-25kpa。真空压力维持约30秒，然后迅速释放到大气压，重复了5次。处理过的幼芽播于营养土壤中。幼苗培养条件：(21±2℃，20–30％相对湿度)，光照强度为300μM/m2/s，光-暗周期16/8h。
将以上植株取样，提取RNA，qRT-PCR鉴定靶标基因的表达水平，选出靶标基因发生上调表达的植株，进行后续实验。
优选的，所述植物为番茄、烟草、茄子、辣椒或棉花。
有益效果：(1)本发明所述方法通过对CRISPR–Act3.0系统进行了一系列优化，包括启动子替换、转录终止子替换、密码子优化等，大大提高了该系统在番茄中的工作效率；(2)所述载体只需完成一次番茄遗传转化，获得SlAct3.0 line植株后，仅需针对不同的靶标基因构建含有靶向其启动子区sgRNA的TRV2载体，并侵染SlAct3.0 line植株，在3周内即可快速高效的获得不同靶基因的过表达植物材料，而通过传统的遗传转化获得基因过表达植株则需要将近1年的时间，因此该方法更加快捷高效，省时省力，极大缩短了试验周期。
附图说明
图1是p1300-SpRY-SlAct3.0载体图谱；
图2是TRV2-SG2.0载体图谱；
图3a是实施例2中番茄植株形态图，图3b是实施例2中La基因表达水平对比图；
图4a为实施例3中番茄叶片的叶脉对比图，图4b是实施例3中番茄叶片中花青素含量图；图4c是实施例3中CHS1、CHI和DFR的基因表达水平对比图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1构建植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体
植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体，所述载体为能表达sgRNA的TRV2载体；TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV-BsaI-BsaI-sgRNA2.0，序列如下SEQ IDNO.9：GAATTCGAGCATCTTGTTCTGGGGTTTCACACTATCTTTAGAGAAAGTGTTAAGTTAATTAAGTTATCTTAATTAAGAGCATAATTATACTGATTTGTCTCTCGTTGATAGAGTCTATCATTCTGTTACTAAAAATTTGACAACTCGGTTTGCTGACCTACTGGTTACTGTATCACTTACCCGAGTTAACGAGGAGACCATCTAGACGGTCTCTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGTTTT；其中，两个BsaI位点为sgRNA插入位点，采用序列如SEQ ID NO.10：CCGAATTCgaattcGAGCATCTTGTTCTGG和SEQ ID NO.11：GCGGATCCaaaacaaaaaagcaccgactcggtgcca所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，并插入到TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2-SG2.0。
含有sgRNA2.0模块的sgRNA2.0-tRNA序列如下SEQ ID NO.12：AGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA，其以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2-GT2.0。
所述载体TRV2-SG2.0与多顺反子tRNA-gRNA用金门连接法组装，得到TRV2-multiSG2.0载体。
所述植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
S1、TRV2载体改造
人工合成表达sgRNA2.0的模块proPeBV-BsaI-BsaI-sgRNA2.0，序列如SEQ IDNO.9所示；并采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，将扩增产物插入TRV2载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2-SG2.0；
S2、人工合成sgRNA2.0-tRNA序列
人工合成序列SEQ ID NO.12，并以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2-GT2.0，后续步骤中pCE2-GT2.0作为模板使用，以合成不同靶标的sgRNA2.0-tRNA单元；
S3、合成TRV2-multiSG2.0载体
依据金门组装原则设计引物，并以S2中的pCE2-GT2.0为模板，通过PCR合成多顺反子sgRNA2.0-tRNA，将多顺反子sgRNA2.0-tRNA与TRV2-SG2.0用金门连接法组装，得到TRV2-multiSG2.0载体。具体方法为：依据金门组装原则(Golden Gate assembly)设计引物并合成多顺反子sgRNA2.0-tRNA(PTG)。为了将多个DNA片段按照一定的顺序用金门组装法连接，DNA片段用BsaI(或其他II型核酸内切酶，如AarI、BbsI、BsmAI、BsmBI)消化后，顺次连接的两个片段需要有且唯一且能重叠的4个碱基，而gRNA间隔区(即靶标序列)是各个PTG之间唯一不同的序列，因此，各PTG应在gRNA间隔区内被划分为两个DNA片段。将多顺反子sgRNA2.0-tRNA与TRV2-SG2.0用金门连接法组装，质粒Sanger测序验证，得到TRV2-multiSG2.0载体。
实施例2番茄中单基因激活
番茄基因La(lanceolate，Solyc07g062680,SlTCP2)是已知的一个调控番茄复叶发育的重要基因，过表达La可以引起番茄叶片变小，叶缘平滑，复叶形成受到抑制，这些明显的叶片形态变化可以非常好的作为La内源基因表达水平变化的标志。我们在La基因启动子区的-1bp到-250bp区间内，设计了一个靶标sgRNA,为sgLa(SEQ ID NO.13):TCGAAGGCAAATACGAACGT，将sgLa构建到TRV2-SG2.0载体上，转农杆菌侵染SlAct3.0 line幼苗，同时以TRV2-SG2.0空载体作为对照。4周后，我们发现，大部分TRV2：La植株的叶片都发生了预期的形态变化，包括茄叶片变小，叶缘平滑等(如图3a)，表明内源La基因受到了激活表达。随后我们提取叶片RNA,通过qRT-PCR实验表明，TRV2：La植株叶片中La基因的表达提高了35倍左右，进一步证明了我们这套载体激活内源基因表达的有效性(如图3b)。
实施例3番茄中多基因激活
花青素合成是在CHS1、CHS2、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR、ANS和3GT等一系列花青素合成相关酶的作用下实现的。我们选取了花青素合成途径中三个关键基因CHS1(Solyc09g091510)、CHI(Solyc05g010320)和DFR(Solyc02g085020)作为靶标基因，分别在其启动子区的-1bp到-250bp区间内设计了1个靶标，分别为sgCHS1(SEQ ID NO.14):ACCTACTTTATCAAGATCAA，sgCHI(SEQ ID NO.15):CCGACAATGATTTAGTTGTT,sgDFR(SEQ IDNO.16):TTGGATTAACCAAATGTGAC,同时设计如下引物：
L5AD-F-pTRV(SEQ ID NO.18):TACAGCTAGAGTCGAAGTAGGGTCTCATGATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTA G；
gCHS1-R(SEQ ID NO.19):ATGGTCTCAGATAAAGTAGGTTGCACCAGCCGGGAATCGA；
gCHS1-F(SEQ ID NO.20)：TAGGTCTCCTATCAAGATCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
gCHI-R(SEQ ID NO.21):ATGGTCTCA AATCATTGTCGGTGCACCAGCCGGGAATCGA；
gCHI-F(SEQ ID NO.22):TAGGTCTCCGATTTAGTTGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
gDFR-R(SEQ ID NO.23):ATGGTCTCA TGGTTAATCCAATGCACCAGCCGGGAATCGA；
gDFR-F(SEQ ID NO.24):TAGGTCTCCACCAAATGTGACGTTTTAGAGCTAGAAATAG；
L3AD-R(SEQ ID NO.25):ATGGTCTCCAAACTGCACCAGCCGGGAATCGA。
以如下4个引物对组合：L5AD-F-pTRV+gCHS1-R；gCHS1-F+gCHI-R；gCHI-F+gDFR-R；gDFR-F+L3AD-R，以pCE2-GT2.0为模板进行PCR反应，扩增得到各个靶标的多顺反子sgRNA2.0-tRNA，然后将这四个片段通过金门连接法以串联的形式构建到载体TRV2-SG2.0上，命名为TRV2:CHS1/CHI/DFR,转农杆菌侵染SlAct3.0 line幼苗，同时以TRV2-SG2.0空载体作为对照。4周后，我们发现，大部分TRV2:CHS1/CHI/DFR植株叶片的叶脉都呈现紫色(图4a)，表明其积累了大量的花青素，以1％盐酸甲醇法提取叶片花青素并检测含量后(图4b)，进一步证明了TRV2:CHS1/CHI/DFR侵染植株叶片比对照植株积累了更多的花青素；随后我们提取叶片RNA,通过qRT-PCR实验表明，TRV2：CHS1/CHI/DFR植株叶片中CHS1、CHI和DFR的基因表达水平提高了33-80倍左右(图4c)，这证明了我们这套载体可以同时激活多个内源基因的表达。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctacggtc tcatcgaagt taacgaaaaa tttaattatt taaagtaag 49
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctacggtc tcagtagtcc atcttgagac actaagaaac tg 42
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctacggtc tcatgactca ggtgagagtc a 31
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctacggtc tctcaggtcc catttcttct tctacttctc ttg 43
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctacggtc tcactacaag gatcacgatg g 31
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctacggtc tcagtcaggc aagtcataaa atgcattaaa aaatattttc 50
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggctacggtc tctcctgata ttgttatgac a 31
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggctacggtc tcaagctctt atctttaatc atattccata gtccat 46
<210> 9
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaattcgagc atcttgttct ggggtttcac actatcttta gagaaagtgt taagttaatt 60
aagttatctt aattaagagc ataattatac tgatttgtct ctcgttgata gagtctatca 120
ttctgttact aaaaatttga caactcggtt tgctgaccta ctggttactg tatcacttac 180
ccgagttaac gaggagacca tctagacggt ctctgtttta gagctaggcc aacatgagga 240
tcacccatgt ctgcagggcc tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttggcc 300
aacatgagga tcacccatgt ctgcagggcc aagtggcacc gagtcggtgc ttttttttgt 360
ttt 363
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgaattcga attcgagcat cttgttctgg 30
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggatccaa aacaaaaaag caccgactcg gtgcca 36
<210> 12
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agagctaggc caacatgagg atcacccatg tctgcagggc ctagcaagtt aaaataaggc 60
tagtccgtta tcaacttggc caacatgagg atcacccatg tctgcagggc caagtggcac 120
cgagtcggtg ctttttttta acaaagcacc agtggtctag tggtagaata gtaccctgcc 180
acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgca 216
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgaaggcaa atacgaacgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acctacttta tcaagatcaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgacaatga tttagttgtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttggattaac caaatgtgac 20
<210> 17
<211> 8937
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggaacaggc agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata 60
ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac 120
cagcttatat accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc 180
gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct 240
tttctacagt atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca 300
ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca 360
aagttggcgt ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca 420
gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca 480
aacccggcag cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc 540
gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg 600
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 660
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 720
actgaattaa cgccgaatta attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta 780
ggaattagaa attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc 840
ttatatgctc aacacatgag cgaaacccta taggaaccct aattccctta tctgggaact 900
actcacacat tattatggag aaactcgagc ttgtcgatcg acagatccgg tcggcatcta 960
ctctatttct ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact 1020
tctacacagc catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca 1080
gtcccggctc cggatcggac gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg 1140
aaattgccgt caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc 1200
cggagtcgtg gcgatcctgc aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc 1260
tccatacaag ccaaccacgg cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc 1320
ccgaacatcg cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca 1380
ttgttggagc cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa 1440
agcatcagct catcgagagc ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc catcacagtt 1500
tgccagtgat acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat 1560
tgaccgattc cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca 1620
gcgatcgcat ccatagcctc cgcgaccggt tgtagaacag cgggcagttc ggtttcaggc 1680
aggtcttgca acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgcta 1740
aactccccaa tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa 1800
acataacgat ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc 1860
cctcctacat cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg 1920
gagacgctgt cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc 1980
tttttcatat ctcattgccc cccgggatct gcgaaagctc gagagagata gatttgtaga 2040
gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga 2100
aggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg tcatccctta cgtcagtgga gatatcacat 2160
caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg 2220
ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct 2280
ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag 2340
tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa 2400
gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga 2460
gtgtcgtgct ccaccatgtt atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 2520
tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca 2580
gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct 2640
tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg 2700
tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta 2760
tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttggc aagctgctct 2820
agccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 2880
acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 2940
ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 3000
tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgaggaga 3060
ccatctagac ggtctcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 3120
accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 3180
atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 3240
gctagagcag cttgagcttg gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag 3300
tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg 3360
gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc 3420
acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt 3480
cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt 3540
tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg 3600
cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc 3660
cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg 3720
ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag 3780
gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac 3840
agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg 3900
catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac 3960
gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct 4020
aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg 4080
cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga 4140
aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg 4200
cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg 4260
tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga 4320
acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 4380
gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 4440
cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 4500
ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac 4560
agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 4620
gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 4680
tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt 4740
ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 4800
ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 4860
tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 4920
ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc 4980
tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 5040
tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 5100
ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 5160
ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc 5220
aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 5280
gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc 5340
aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 5400
ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 5460
gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat 5520
gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg 5580
tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct 5640
gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga gcggtcgcaa 5700
accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa 5760
ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg 5820
gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc 5880
gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta 5940
tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa 6000
gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt 6060
ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt 6120
ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg 6180
cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa 6240
gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca 6300
gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat 6360
tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct 6420
agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca 6480
ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg 6540
cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag 6600
cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct 6660
gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta 6720
ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg 6780
gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggactc tttcctgtgg atagcacgta 6840
cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc 6900
gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt 6960
ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata 7020
actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg 7080
ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc 7140
tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg 7200
ccggcgccca catcaaggca ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 7260
gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 7320
aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt 7380
cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact 7440
gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat 7500
caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 7560
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 7620
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 7680
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 7740
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 7800
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 7860
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 7920
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 7980
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8040
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8100
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 8160
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 8220
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 8280
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8340
gattttggtc atgcattcta ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat aatattttat 8400
tttctcccaa tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat actgttcttc 8460
cccgatatcc tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg tcataccact tgtccgccct 8520
gccgcttctc ccaagatcaa taaagccact tactttgcca tctttcacaa agatgttgct 8580
gtctcccagg tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa 8640
atcatacagc tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcttct tcccagtttt cgcaatccac 8700
atcggccaga tcgttattca gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt ctaagctatt 8760
cgtataggga caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc ctgatgcact ccgcatacag 8820
ctcgataatc ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct tccgagcaaa ggacgccatc 8880
ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt tcaaagtgca ggacctt 8937
<210> 18
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tacagctaga gtcgaagtag ggtctcatga ttgaacaaag caccagtggt ctag 54
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggtctcag ataaagtagg ttgcaccagc cgggaatcga 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taggtctcct atcaagatca agttttagag ctagaaatag 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggtctcaa atcattgtcg gtgcaccagc cgggaatcga 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taggtctccg atttagttgt tgttttagag ctagaaatag 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atggtctcat ggttaatcca atgcaccagc cgggaatcga 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
taggtctcca ccaaatgtga cgttttagag ctagaaatag 40
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atggtctcca aactgcacca gccgggaatc ga 32
Claims (3)
1.植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体在制备番茄单基因或多基因过表达材料中的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：
（1）构建CRISPR–SlAct3.0载体，所述载体命名为p1300-SpRY-SlAct3.0，序列为SEQ IDNO.17；
（2）构建番茄转基因材料
采用叶盘转化法，将p1300-SpRY-SlAct3.0转化番茄品种Ailsa Craig，获得转基因材料，命名为SlAct3.0 line；
（3）构建TRV2-multiSG2.0载体
人工合成表达sgRNA2.0的模块proPeBV-BsaI-BsaI-sgRNA2.0，序列如SEQ ID NO.9所示；并采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列，将扩增产物插入TRV2 载体多克隆位点，获得表达sgRNA2.0模块的TRV2-SG2.0；
人工合成序列SEQ ID NO.12，并以TOPO克隆方法连接于载体pCE2，命名为pCE2-GT2.0，后续步骤中pCE2-GT2.0作为模板使用，以合成不同靶标的sgRNA2.0-tRNA单元；
依据金门组装原则设计引物，并以S2中的pCE2-GT2.0为模板，通过PCR合成多顺反子sgRNA2.0-tRNA，将多顺反子sgRNA2.0-tRNA与TRV2-SG2.0用金门连接法组装，得到TRV2-multiSG2.0载体；
（4）载体侵染
将SlAct3.0 line的番茄种子发芽至0.5-1cm后进行抽真空侵染，采用冻融法将pTRV1，TRV2-SG2.0或TRV2-multiSG2.0载体质粒导入根癌农杆菌菌株GV3101，涂布含50μg/mL卡那霉素、25μg/mL利福平、25μg/mL庆大霉素3种抗生素的LB平板，然后挑斑、摇菌至OD600值在0.8-1.0之间，离心收集菌体，用侵染液悬浮菌体沉淀至OD600=1-1.5，按照体积比pTRV1:TRV2-SG2.0=1:1，或者 pTRV1:TRV2-multiSG2.0=1:1混合侵染；采用抽真空法侵染发芽种子，经qRT-PCR鉴定靶标基因的表达水平，制备获得番茄单基因或多基因过表达材料。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过金门组装法连接的DNA片段采用II型核酸内切酶酶切。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用的II型核酸内切酶为BsaI、AarI、BbsI、BsmAI或BsmBI。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN106086062A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-11-09 | 上海市农业科学院 | 一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法 |
| CN111334527A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-26 | 江苏科技大学 | 一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用 |
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Non-Patent Citations (1)
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| CRISPR-Act3.0 for highly efficient multiplexed gene activation in plants;Changtian Pan等;《Nat Plants .》;第7卷(第7期);942-953 * |
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