EA004328B1

EA004328B1 - Способ придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусу, содержащему последовательность 3 тройного блока генов (tgb3), и трансгенное растение, устойчивое к указанному вирусу

Info

Publication number: EA004328B1
Application number: EA199900144A
Authority: EA
Inventors: Убер Гюйие; Жерар Жонар; Кен Ричардс; Салах Бузубаа; Клодин Блейкастен-Гроссханс; Ги Вейен; Марк Лефебвр
Original assignee: Сес Еуропе Н.В./С.А.
Priority date: 1996-08-19
Filing date: 1997-08-18
Publication date: 2004-04-29
Also published as: HU223266B1; PT938574E; SK19799A3; HUP9904271A3; US6297428B1; DE69726175T2; PL331837A1; HUP9904271A2; DK0938574T3; DE69726175D1; EP0938574B1; SK284152B6; EP0938574A1; PL189499B1; AU3935097A; ATE254180T1; EE9900074A; ES2210557T3; WO1998007875A1; EE04379B1

Abstract

Настоящее изобретение касается способа придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусу, содержащему последовательность 3 тройного блока генов (TGB3), с условием, что он не является вирусом картофеля X, состоящего из следующих этапов: получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность TGB3 указанного вируса или соответствующую ей кДНК, или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода, связанные с одной или более регуляторными последовательностям, активными в растении; трансформации растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, и при необходимости, регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. Настоящее изобретение также касается полученного растения.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение касается способа придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусам, в частности, способа придания клетке или растению сахарной свеклы устойчивости к вирусу ΒΝΥνν и получения клетки и растения, устойчивых к вирусу.

Предпосылки изобретения и уровень техники

Широко распространенное вирусное заболевание растения сахарной свеклы (Ве1а уи1дап8) под названием ризомания вызывается фуровирусом, вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (ΒΝΥνν) (23, 24), который передается корням свеклы почвенным грибком Ро1утуха Ье1ае (25).

Заболевание поражает значительные площади земли в акрах в областях, где растения сахарной свеклы выращивают для промышленного использования в Европе, США и Японии, и распространено в некоторых местностях в Западной Европе (26, 27). Поскольку не существует практического способа эффективного контроля распространения вируса в больших масштабах химическими или физическими средствами (28) ни в растениях, ни в почве, основной целью являлась идентификация природных источников устойчивости в плазме зародыша сахарной свеклы и получение, путем скрещивания, сортов сахарной свеклы, экспрессирующих гены устойчивости. Было идентифицировано множество таких генов толерантности к вирусу, и некоторые гены были удачно использованы в скрещивании коммерческих сортов сахарной свеклы (29, 30, 31).

Только использование ΒΝΥνν-устойчивых или толерантных сортов позволит фермерам выращивать растения сахарной свеклы в областях, инфицированных ΒΝΥνν, где растения сахарной свеклы являются существенным компонентом севооборота и значительно влияют на доход фермеров.

Ряд детальных исследований показал, что различие в чувствительности к ΒΝΥνν-инфекции среди генотипов или сортов сахарной свеклы отражает в основном различие в проникновении или распространении вируса в тканях корня (32).

Однако существуют сообщения, которые четко показывают, что гены толерантности, даже из различных источников плазмы зародыша сахарной свеклы или плазмы зародыша диких родственных культур (33), могут обеспечивать определенные механизмы устойчивости. Это может обеспечить более контролируемую ситуацию для создания стратегий долговременной ΒΝΥνν-устойчивости.

С 1986 года в ряде сообщений и публикаций было описано использование изолированных вирусных последовательностей генов, экспрессирующихся в растениях, для получения высокого уровня толерантности против этого вируса или даже широкого спектра устойчиво сти против ряда родственных вирусов (34, 35, 36). Одной из наиболее подтвержденных стратегий вирусной устойчивости, основанной на генетической инженерии, у многих культивируемых видов, таких как картофель, тыква, огурец или томат, является использование последовательности вирусного гена, кодирующего белок оболочки вируса-мишени (37), которая под контролем регуляторных элементов растений, будет экспрессироваться в растении.

Однако в случае устойчивости, опосредованной белком оболочки, экспрессия определенного уровня устойчивости в трансгенном растении может определяться различными механизмами, такими как ко-супрессия РНК, и необязательно продукцией белковой последовательности.

В общем, последовательность вируса будет трансформирована в подходящую культуру клеток или тканей видов растений с использованием системы трансформации, опосредованной агробактериями, или путем прямого переноса генов, в соответствии с ограничениями способа культивирования тканей или клеток, который может успешно применяться для данных видов. Будет регенерировано целое растение и охарактеризована экспрессия трансгена.

Хотя сахарная свекла с трудом поддается клеточному культивированию, что ограничивает применение практических методов генетической инженерии для этого вида, имеется ряд сообщений об успешной трансформации и регенерации целых растений (38). Также было опубликовано несколько примеров создания толерантности к вирусу ΒΝΥνν путем трансформации и экспрессии последовательности белка оболочки вируса ΒΝΥνν в геноме сахарной свеклы (39, \УО 91/13159), хотя в них редко сообщаются данные о полностью функционирующих трансгенных растениях сахарной свеклы (40). В частности, в сообщениях демонстрируются ограниченные данные об уровне устойчивости, наблюдаемой в условиях инфицирования у трансгенных растений сахарной свеклы, трансформированных геном, кодирующим последовательность белка оболочки вируса ΒΝΥνν (41, 42) .

Полное содержание технологии, включая способ трансформации сахарной свеклы и использование экспрессии последовательности белка оболочки вируса ΒΝΥνν в качестве источника устойчивости у трансгенного растения сахарной свеклы, полученного указанным способом трансформации, описано в международной заявке \¥О 91/13159.

На основе опубликованной информации нельзя заключить, что механизм устойчивости, опосредованной белком оболочки, обеспечивает какой-либо потенциал для придания растению сахарной свеклы абсолютного иммунитета к ΒΝΥνν-инфекции путем полного ингибирования механизмов размножения и проникновения вируса. Для идентификации механизма устойчивости, который позволяет значительно блокировать распространение вируса на ранней стадии инфекции, основным критерием успеха являлось бы получение такой устойчивости в трансгенном растении, которая была бы сравнима с уровнем устойчивости, известным для генов устойчивости, идентифицированных в зародышевой плазме сахарной свеклы, и могла бы разнообразить имеющиеся механизмы устойчивости.

Поскольку показано, что заболевание распространяется во многих странах или областях со скоростью, зависящей от сочетания многих местных факторов окружающей среды и сельского хозяйства, существует большой интерес к обеспечению разнообразия источников механизмов генетической устойчивости, которые могут, по отдельности или в сочетании, предоставить стабильную и долговременную стратегию устойчивости для существующих и будущих сортов растений сахарной свеклы, которые выращивают для промышленного использования.

Публикация Хи Н. с соавт. (Р1ап1 Се 11 Верой, Уо1.15, рр. 91-96, 1995) описывает полученную с помощью генетической инженерии конструкцию, обеспечивающую устойчивость к вирусу Х картофеля в четырех коммерческих культиварах картофеля. Однако в указанном документе определяются такие клоны трансгенного картофеля, которые включали ген 8КО (конструкция ТОВ3). Однако когда эти трансгенные растения инфицировали вирусом РУХ, то защиты против этого вируса не возникало, что говорит о том, что белок ОК не играет роли в защите против вируса РУХ.

Цели изобретения

Настоящее изобретение имеет целью обеспечение нового способа придания растительной клетке и растению устойчивости к различным вирусам и получение устойчивых к вирусам растительной клетки и растения.

Основной целью изобретения является обеспечение нового способа придания растительной клетке и растению устойчивости к вирусу ВХУУУ и получение устойчивых к вирусу ВИУУУ растительной клетки и растения, в частности, клетки и растения сахарной свеклы (Ве1а уи1дап5 ввр.).

Краткое изложение изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает использование альтернативной последовательности растительного вируса, в частности, вируса ВИУУУ, для получения высокого уровня толерантности к вирусной инфекции, в частности, для обеспечения быстрого и полного блокирования механизмов размножения и распространения вируса в растении, в частности, в растении сахарной свеклы (Ве1а сиЦагй). включая кормовую свеклу, листовую свеклу (мангольд) и столовую свеклу, которые также могут быть объектами этой вирусной инфекции. Экспрессия устойчивости будет получена в трансгенных клетке или растении, в частности, в клетках или растениях сахарной свеклы, полученных путем трансформации согласно международной заявке XVО 95/10178 или другими способами трансформации, основанными на использовании бактерий ЛдтоЬас1егшт 1нтеГас1еп5 или на прямом переносе генов. Из-за своей высокой эффективности способ трансформации, как показано в νθ 95/10178, делает возможным получение большого количества трансформированных растений, в частности, растений сахарной свеклы, и будет предпочтительным для получения трансгенных растений, которые могут быть проанализированы и охарактеризованы по уровню их устойчивости к вирусу, в частности, устойчивости к вирусу ВИУУУ, включая их оценку в полевых условиях.

Геном вируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВИУУУ) состоит из пяти положительных РНК, две из которых (РНК 1 и 2) кодируют функции, существенные для инфицирования всех растений, тогда как три другие РНК (РНК 3, 4 и 5) вовлечены в векторопосредованное инфицирование корней сахарной свеклы (Ве1а уиЦагй) (1). Движение вируса ВИУУУ от клетки к клетке регулируется набором трех последовательных, слегка перекрывающихся вирусных генов на РНК 2, известных как тройной блок генов (ТВО) (2), который кодирует по порядку вирусные белки Р42, Р13 и Р15 (генные продукты обозначены в соответствии с их вычисленной молекулярной массой, выраженной в килодальтонах (3)).

В последующем описании гены ТОВ и соответствующие белки будут обозначаться следующим образом: ТОВ1, ТОВ2, ТОВ3 или Р42, Р13 и Р15 по номеру кодируемого ими вирусного белка. Аналогичные последовательности ТОВ представлены и у других фуровирусов (4, 5), и у потекс-, карла- и гордеивирусов (6).

В табл. 1 представлены вирусы, имеющие последовательность ТОВ3, молекулярные массы последовательностей ТОВ3 указанных вирусов, их хозяева и ссылки.

Таблица 1

Вирус	Размер ТОВ3	Хозяин	Ссылка
Вирус ямчатости ствола яблони	8 кДа	яблоня	1е1ктап, 1. Оеп. У1го1. 75, 1535-1542 (1994)
Вирус ожога черники	7 кДа	черника	СауПеег е1 а1., 1. Оеп. ¥1го1. 75, 711-720 (1994)
Вирус М картофеля	7 кДа	картофель	/аупеу е! а1. , 5. Оеп. У1го1. 72, 9-14 (1991)
Вирус мозаики белого клевера	8 кДа	клевер	Тог§1ег е! а1. , Хис1. Лс108 К.ез. 16, 291- 303 (1988)
Вирус мозаики орхидеи Сут- ЬИшт	10 кДа	орхидея	№о е1 а1., Р1ап1 Мо1. Вю1. 18, 1027-1029 (1992)
Вирус полосатой мозаики ячменя	17 кДа	ячмень	(гиЛаГ^оп е1 а1., \ис1. Лс108 Ке8. 14, 3895- 3909 (1986)

Вирус курчавости верхушки картофеля	21 кДа	картофель	8соИ е1 а1., Т Сеп. ¥1го1. 75, 3561-3568 (1994)
Вирус кустистости арахиса	17 кДа	арахис	11ег/од е1 а1. , 3. Сеп. ¥1го1. 75, 3147-3155 (1994)
Вирус свеклы, передающийся через почву	22 кДа	сахарная свекла	Коеп1§ е1 а1. , У1го1оду 216, 202-207 (1996)

Изобретатели предлагают здесь новый способ обеспечения вирусной устойчивости к растительным вирусам путем блокирования механизмов размножения и распространения вируса в указанном растении, особенно в ткани его корня. Для демонстрации указанной устойчивости изобретатели описывают ниже влияние сверхэкспрессии последовательностей ТСВ. по отдельности или в сочетании, на механизмы размножения и проникновения вируса ΒΝΥνν в растения С. с.|шпоа. которые также являются хозяевами вируса ΒΝΥνν и которые легче поддаются манипуляциям профессионалов в данной области.

Изобретатели выполнили эксперименты также на Вс1а тасгосагра. Эти результаты показали, что растения можно трансформировать также способом согласно данному изобретению и получить экспрессию гена ТСВ3 с помощью указанных растений. Поэтому, как объясняется в приведенном ниже описании, указанный способ можно использовать для получения устойчивости к различным вирусам в различных видах растений, подверженных инфекции вирусами, характеризующимися наличием последовательности ТСВ3 в их геноме.

Известно, что вирус ΒΝΥνν не нуждается в синтезе вирусного белка оболочки для продуцирования местных повреждений на листьях хозяев, таких как Сйепоробшт с.|шпоа (7), что означает, что образование вириона не требуется для движения вируса от клетки к клетке.

Однако способ, с помощью которого компоненты ТСВ участвуют в процессе движения, не понятен, хотя осуществленное с помощью компьютера сравнение последовательностей обнаружило характерные консервативные последовательности, которые могут обеспечить ключ к разгадке их функций. Таким образом, 5'проксимальный белок ТСВ (ТСВ1) неизменно содержит ряд последовательностей, характерных для АТР/СТР-связывающих геликаз, тогда как второй белок (ТСВ2) всегда имеет два потенциально связывающихся с мембраной гидрофобных домена, разделенных гидрофильной последовательностью, которая содержит высоко консервативную пептидную последовательность неизвестного назначения (6).

Последовательность и размер третьего белка ТСВ (ТСВ3) являются более вариабельными, хотя Ν-терминальный участок обычно является гидрофобным. С помощью 5'-концевого картирования в 3'-5' направлении от откры тых рамок считывания (ОРС) последовательностей ТСВ1 и ТСВ2 вируса ΒΝΥνν (фиг. 1) были обнаружены субгеномные РНК, но такие субгеномные последовательности не были обнаружены в последовательности ТСВ3 вируса ΒΝΥνν (2) или любых других ТСВсодержащих вирусов. В случае вируса X картофеля (РУХ; ссылка 8) и вируса полосатой мозаики ячменя (В8МУ; ссылка 9), существуют данные, что продукты ТСВ2 и ТСВ3 экспрессируются с тех же субгеномных РНК.

До настоящего времени не было ни одного сообщения о вирусе, в котором три члена ТСВ располагались бы иначе на одной и той же РНК или распределялись бы по различным геномным РНК, что означает, что их соединение в определенном порядке может быть важным для регуляции их функции.

Настоящее изобретение касается способа придания устойчивости к вирусу, содержащему тройной блок генов (ТСВ), при условии, что этот вирус не является вирусом X картофеля. Предпочтительней, чтобы указанный вирус был выбран из группы, состоящей из вируса ямчатости ствола яблони, вируса ожога черники, вируса М картофеля, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики орхидеи СутЫбшт, вируса полосатой мозаики ячменя и вируса свеклы, передающегося через почву; указанный способ состоит из следующих этапов:

получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность ТСВ3 указанного вируса или соответствующую ей кДНК или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода, связанные с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении, трансформации растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты и, при необходимости, регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.

Предпочтительней, чтобы растение являлось растением, которое может быть инфицировано описанным выше вирусом, и предпочтительней, чтобы оно было выбрано из группы, состоящей из яблони, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя, арахиса и сахарной свеклы.

Настоящее изобретение также касается полученной растительной клетки и трансгенного (или трансформированного) растения (полученного из указанной растительной клетки), устойчивых к указанным вирусам и содержащих указанную конструкцию нуклеиновой кислоты.

Изобретатели также неожиданно обнаружили, что можно индуцировать устойчивость к вирусу ΡΝΥ νν в растении способом, который состоит из следующих этапов:

получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность ТСВ3, которая заключена между нук леотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК2 вируса ΒΝΥνν, или соответствующую ей кДНК или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода, связанную с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении, трансформации растительной клетки указанной конструкцией и, при необходимости, регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.

Последовательность нуклеиновой кислоты, которая заключена между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК2, кодирующая белок Р15, описана на фигуре 6 и в публикации (3). Указанная нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность представлены ниже в виде БЕО ΙΌ N0.1.

Другой аспект настоящего изобретения касается растительной клетки и трансгенного растения (полученного из указанной растительной клетки), устойчивых к вирусу ΒΝΥνν и содержащих конструкцию нуклеиновой кислоты, имеющую нуклеотидную последовательность, соответствующую, по крайней мере, 70%, предпочтительней, по крайней мере, 90% нуклеотидной последовательности, заключенной между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК2 вируса ΒΝΥνν или соответствующей ей кДНК, связанной с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении.

Предпочтительней, чтобы указанная растительная клетка или трансгенное растение (полученное из указанных растительных клеток), устойчивые к вирусу ΒΝΥνν, были получены способом в соответствии с настоящим изобретением.

Варианты нуклеотидной последовательности, описанной как БЕО ΙΌ N0.1, содержат вставку, замену или делецию нуклеотидов, кодирующих одинаковые или различные аминокислоты. Поэтому настоящее изобретение также касается указанных вариантов нуклеотидной последовательности БЕО ΙΌ N0.1, которые представляют более чем 70% гомологию с указанной нуклеотидной последовательностью, и которые, что предпочтительно, способны гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью в жестких или нежестких условиях.

Предпочтительней, чтобы указанные последовательности также были способны индуцировать устойчивость к вирусу ΒΝΥνν в растении.

Термин придавать растению устойчивость к вирусу означает индукцию возможного уменьшения или значительного замедления появления симптомов инфекции, размножения вируса или механизмов его распространения в растении, особенно в ткани корня.

Регуляторная последовательность (последовательности) указанной нуклеотидной последовательности является промоторной последовательностью (последовательностями) и терминаторной последовательностью (последовательностями), активными в растении.

Конструкция нуклеиновой кислоты может также включать ген селективного маркера, который мог бы использоваться для идентификации трансформированных клетки или растения и экспрессировать конструкцию нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением.

Предпочтительней, чтобы клетка являлась устьичной клеткой, и растение являлось сахарной свеклой (Ъе1а сиЦапк ккр.), полученной из указанных клеток.

В соответствии с изобретением, промоторная последовательность является конститутивной или чужеродной растительной промоторной последовательностью, предпочтительно, выбранной из группы, состоящей из промотора 358 вируса мозаики цветной капусты, промотора полиубиквитина АгаЫборкй 1йаНапа (43), промотора, который активен в основном в тканях корня, такого, как промотор раг гена гемоглобина Регокроша апбегкопл (Ьапбктап с1 а1. Мо1. Оеп. СепеЕ 214:68-73 (1988)) или их смеси.

Последний аспект настоящего изобретения относится к ткани трансгенного растения, такой как плод, ствол, корень, клубень, семя трансгенного растения, в соответствии с изобретением или к воспроизводимой структуре (предпочтительно, выбранной из группы, состоящей из каллусов, почек или зародышей), полученных из трансгенного растения или клетки в соответствии с изобретением.

Методы трансформации растений, культивирования ткани и регенерации, использованные в способе в соответствии с изобретением, хорошо известны профессионалам в данной области. Предпочтительней, чтобы эти методы соответствовали методам, описанным в международных заявках XV0 95/10178 или XV 0 91/13159, соответствующей заявке ЕР-В0517833, которые включены здесь посредством ссылки. Предпочтительней, чтобы эти методы использовались для получения трансгенной сахарной свеклы в соответствии с изобретением.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 представляет структуру РНК2 вируса ΒΝΥνν дикого типа и репликоны, экспрессирующие белки ΤΟΒ.

Фиг. 2 представляет трансляцию ш νίΙΐΌ репликонов генов ΤΟΒ в экстракте зародышей пшеницы.

Фиг. 3 представляет амплификацию репликонов, кодирующих белки ΤΟΒ в протопластах Сйепоробшт с.|шпоа и экспрессию Р42.

Фиг. 4 представляет комплементацию транскриптов РНК2, содержащих дефекты в различных генах ΤΟΒ, с помощью соответст вующих генов дикого типа, полученных из репликона.

Фиг. 5 показывает влияние репликонов на инфекцию РНК 1 и 2 вируса ΒΝΥνν дикого типа.

Фиг. 6 представляет нуклеотидную и аминокислотную последовательность ТСВ3, кодирующую Р15 вируса ΒΝΥνν.

Фиг. 7 показывает присутствие кодирующих районов гена р15 вируса ΒΝΥνν в геноме сахарной свеклы с помощью ПЦР.

Фиг. 8 показывает интеграцию гена Р15 вируса ΒΝΥνν в геном сахарной свеклы, определенную с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

Описание изобретения

Для того чтобы определить потенциальное использование определенных последовательностей генов, выделенных из РНК2 вируса ΒΝΥνν, и создать устойчивость к вирусу ΒΝΥνν у сахарной свеклы путем трансформации растений, изобретатели исследовали, может ли осуществляться независимая экспрессия белка ТСВ вируса ΒΝΥνν путем внесения каждой ОРС в вирусный, зависимый от репликации, репликон, полученный из РНК3 вируса ΒΝΥνν. Изобретатели показали, что при смешанной инфекции листьев С. с.|шпоа совместно экспрессирующиеся белки ТСΒ1 или ТСΒ2 вируса ΒΝΥνν могут комплементировать РНК2 вируса ΒΝΥνν, содержащую мутацию, отменяющую функцию соответствующего белка ТСΒ. Никакой комплементации не наблюдали с репликон-содержащей последовательностью ТСΒ3, однако, если только ОРС последовательности ТСΒ3 не была расположена в 5'-3' направлении от ОРС для последовательности ТСΒ2 в репликоне. При совместной инокуляции с РНК 1 и 2 дикого типа, репликон, экспрессирующий ОРС ТСΒ3 вируса ΒΝΥνν, ингибировал инфекцию. Эти данные совпадают с моделью экспрессии белков ТСΒ, в которой трансляция Р15 с дицистронной субгеномной РНК регулирует уровни экспрессии Р15 ίη νίνο. Изобретатели также определили, что высокая экспрессия Р15 обеспечивала быстрое и абсолютное блокирование размножения вируса и механизмов его распространения в растении.

Материалы и методы кДНК-клоны

Транскрипционными векторами для продукции полноразмерных РНК 1 и 2 вируса ΒΝΥνν дикого типа были рВ15 (10) и рВ2-14 (11), соответственно. Транскрипционными векторами для предварительно описанных мутантных РНК2 являлись ρΒ2-14-Ε, -Н, -I и -1 (2) и ρΒ2-14-Δ8Ν, -А812, - Δ837, -АВ1, -АВ2, -АВ2, -ΔΝ и -САА (11). Делеционный мутант РНК2 рВ2-14- НР1 получали путем удаления последовательности между нуклеотидами 3158 и 3258. Полученный из РНК3 вируса ΒΝΥνν пустой репликон герО получали путем транскрипции делеционного мутанта РНК3 рВ35ААЕ8 (12). Последовательности ТСΒ для встраивания в герО были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием праймеров, каждый из которых содержал нематричный сайт ΒатΗI на его 5'-конце. Фрагменты ПЦР, соответствующие гену Р42 (нуклеотиды 2127-3297), гену Р13 (нуклеотиды 3282-3650), гену Р15 (нуклеотиды 3627-4025) и обоим генам Р13 и Р15 (нуклеотиды 3282-4025), гидролизовали с помощью рестриктазы ΒатΗI и встраивали в расщепленную ΒатΗI рВ35ААЕ8. Полученные конструкции использовали для транскрипции гер42, гер13, гер15 и гер1315, соответственно. Репликон, содержащий мутацию со сдвигом рамки в ОРС Р15 (Кер15X), получали путем заполнения выступов вставкой сайта ХЬа1 (нуклеотид 3948). Введение мутаций со сдвигом рамки в гер13-1, гер1315-1 и гер15-1 осуществляли, как описано для соответствующих мутаций в полноразмерной РНК2 (2). Клонированные последовательности, амплифицированные с помощью ПЦР, были проверены на отсутствие ошибок путем секвенирования (13).

Транскрипты, полученные ίη νίΐτο Каптированные транскрипты получали путем гцп-οίί транскрипции (10) с помощью полимеразы бактериофага Т7 плазмидной ДНК, линеаризованной с помощью ΗίηάΙΙΙ для рВ15 и репликонных конструкций и с помощью 8а11 для рВ2-14 и родственных конструкций. Концентрацию и целостность транскрипта оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле. Листья механически инокулировали 50 мкл на лист буфера для инокуляции, содержащего 1 мкг каждого транскрипта (2). В некоторых экспериментах, транскрипты РНК 1 и 2 заменяли 0,025 мкг высокоинфекционной вирусной РНК, очищенной из изолята 81га5 12 вируса ΒΝΥνν (10). Предварительные эксперименты показали, что такое количество вирусной РНК было приблизительно эквивалентно по эффективности (как измеряли путем анализа локальных повреждений) смеси, содержащей 1 мкг каждого из транскриптов РНК 1 и 2. Для инфицирования протопластов 0,5 мкг вирусных РНК 1 и 2 плюс 3 мкг репликонного транскрипта инокулировали в 2-10⁵ протопластов путем электропорации (2).

Полученные из репликонов транскрипты подвергали трансляции в экстракте зародышей пшеницы (14) и продукты трансляции, меченые [³⁵8], визуализировали с помощью авторадиографии после электрофореза в ПААГ с 8Ό8 (15, 16). Радиоактивность, включенную в продукты трансляции, определяли количественно с помощью биоанализатора Еирх МА81000, и эти значения корректировали для содержания метионина при вычислении относительных уровней трансляции.

Определение вирусной РНК и белков

Общую РНК экстрагировали (2) из инокулированных листьев на 10 день после инокуляции и из протопластов - через 48 часов после инокуляции. Вирусную РНК определяли с помощью нозерн-гибридизации с антиСмысловыми транскриптами вирусной РНК, мечеными ³²Р, в качестве зондов (17). Проба, специфичная для РНК1, была комплементарна нуклеотидам 4740-5650, проба, специфичная РНК2, была комплементарна нуклеотидам 2324-3789, а проба, специфичная для РНК3, была комплементарна нуклеотидам 1-380. Р42, Р14 и белок оболочки определяли вестерн-блотингом тотальных белковых экстрактов инфицированных протопластов, используя кроличью поликлональную сыворотку, специфичную для каждого белка (18). Стабильность мутаций, введенных в РНК2, тестировали с помощью полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции (ВТРСВ) тотальных экстрактов РНК из инфицированных растений. Обратные транскрипты получали с помощью набора для обратной транскрипции Ехрапб™ гсусг^с йащспрйоп кй (Воегшдег), следуя указаниям производителя. ПЦР проводили в точности, как описано (19), используя 25 циклов следующего режима: 94° (30 с), 50° (30 с), 72° (3 мин). Пары праймеров для ПЦР-амплификации различных участков кДНК РНК2 соответствовали (или были комплементарны, в случае второго члена каждой пары праймеров) нуклеотидам 1143-1151 и 3393-3412 (ген Р42), и нуклеотидам 3151-3169 и 4128-4148 (гены Р13 и Р15). Праймер, использованный для инициации синтеза кДНК до реакций ПЦР, был комплементарен нуклеотидам 4128-4148.

Результаты

Репликоны, экспрессирующие белки ТОВ вируса ΒΝΥνν

При условии поддержания достаточного количества последовательностей на 3'- и 5'концах, транскрипт РНК3 вируса ΒΝΥνν, из которого был делетирован центральный район, может эффективно реплицироваться в листьях С. с.|шпоа при совместной инокуляции с РНК 1 и 2, и может экспрессировать чужеродный ген, встроенный вместо делетированной последовательности (12, 20). Изобретатели использовали такие репликоны на основе РНК3 для экспрессии каждого из белков ТОВ вируса ΒΝΥνν вне их нормального окружения на РНК2 и тестировали способность каждого репликона комплементировать мутантную РНК2, дефектную по соответствующему гену ТОВ.

Использованные в этом исследовании репликоны изображены на фиг. 1. Фиг. 1 представляет собой геномную карту РНК2. Гены ТОВ оттенены, и линии над картой указывают протяженность субгеномных РНК 2§цЬ_а и 2§цЬ_Ь. Показаны положения делеций и вставок, индуцирующих сдвиг рамки в РНК2. 5'-концевая кэп-структура РНК обозначена квадратиком. Р21 является основным вирусным белком оболочки. ВТ = домен считывания (геабЮгоидй боташ)(3). (В) - репликоны, полученные из РНК3 вируса ВКТУУ, содержащие гены ТОВ вируса ВКТУУ (светлое окрашивание), или ген ТОВ3, кодирующий Р17 вируса кустистости арахиса (РСУ) (темное окрашивание). Показан сайт ВатН1 в пустом репликоне (гер0), использованный для вставки последовательностей ТОВ, амплифицированных с помощью ПЦР. Обозначены положения вставок, индуцирующих сдвиг рамки, в различных мутантных репликонах Р13 и Р15. В дополнение к конструкциям гер42, гер13 и гер15, каждая из которых содержит ген ТОВ, была получена четвертая конструкция (гер1315), содержащая оба гена Р13 и Р15, расположенных в той же относительной конфигурации, что и в РНК2. Способность каждого репликона направлять экспрессию встроенного гена или генов тестировали с помощью трансляции ш У11го транскрипта в экстракте зародышей пшеницы. Каждый транскрипт гер42, гер13 и гер15 направлял синтез полноразмерного продукта (фиг. 2 А, дорожка 2; фиг. 2В, дорожки 2 и 3), который не продуцировался в процессе трансляций, запрограммированных транскриптом, соответствующим пустому репликону, гер0 (фиг. 2А, дорожка 1; фиг. 2В, дорожка 1) . На фиг. 2(А) представлены меченые 8³⁵метионином продукты трансляции пустого репликона гер0 (дорожка 1) и гер42 (дорожка 2), продемонстрированные с помощью авторадиографии после электрофореза в ПААГ (15) . Обозначенная полоса была идентифицирована как Р42 путем сравнения ее подвижности с подвижностью маркеров молекулярных весов (не показаны). На фигуре 2 (В) представлены продукты трансляции, управляемой гер0 (дорожка 1), гер13 (дорожка 2), гер15 (дорожка 3) и гер1315 (дорожка 4), показанные с помощью авторадиографии после электрофореза в ПААГ (16). Полосы, предварительно идентифицированные как Р13 и Р15, показаны справа. Также была синтезирована фоновая полоса, обозначенная звездочкой, когда в экстракт для трансляции не вводили транскрипт. Относительные подвижности различных продуктов трансляции были такими, как и ожидалось, за исключением того, что предполагаемый Р13 мигрировал несколько более медленно, чем Р15, возможно, из-за его нетипичного аминокислотного состава. Дицистронная конструкция гер1315 направляла синтез как Р13, так и Р15 (фиг. 2В, дорожка 4) в относительных молярных количествах 3:1 (значения скорректированы по различию в содержании метионина в двух белках; если Ν-концевой метионин каждого белка удаляется после трансляции, молярное соотношение составляет 5:1).

Способность репликонов амплифицироваться с помощью вирусной системы репликации ίπ у|уо тестировали при совместной иноку ляции репликонных транскриптов в протопластах С. с.|шпоа с РНК 1 и 2 вируса ΒΝΥνν. Анализ с помощью нозерн-блотинга общей РНК, экстрагированной из протопластов через 48 ч после инокуляции, выявил, что все репликоны, содержащие гены ТСВ, эффективно амплифицировались (фиг. 3А). Фиг. 3(А) представляет определение с помощью нозерн-гибридизации вирусных РНК в протопластах С. ςυίηοα, инокулированных РНК 1 и 2 вируса ΒΝΥνν только (дорожка 2) или с добавлением герО (дорожка 3), гер 42 (дорожка 4), гер13 (дорожка 5), гер 1315 (дорожка 6) и гер 15 (дорожка 7). РНК из мнимо инокулированных протопластов анализировали на дорожке 1. Протопласты собирали через 48 ч после инокуляции и определяли вирусные РНК, используя меченые ³²Р вирусные РНК-специфичные антисмысловые РНК-зонды. Репликоны показаны концами стрелок. Фиг. 3(В) представляет иммунологическое определение Р42 в тотальных белковых экстрактах протопластов С. сцнтоа, инокулированных РНК 1 и 2 вируса ΒΝΥνν (дорожка 2), транскриптом РНК1 дикого типа плюс транскриптом РНК2 мутантного рВ1-14-Н, который содержит мутацию со сдвигом рамки в гене Р42 (11) (дорожка 3), РНК1 и транскриптами рВ2-14-Н плюс гер42 (дорожка 4). Белок, экстрагированный из мнимо инокулированных протопластов, анализировали на дорожке 1. После электрофореза в ПААГ (15) и электропереноса на нитроцеллюлозу иммунологически определяли Р42, основной вирусный белок оболочки (СР), и Р14 смесью антисывороток, специфичных для каждого белка (18). Положения стандартов молекулярных весов помечены в килодальтонах слева от блота. Анализ вестерн-блотингом выявил, что уровень Р42 в протопластах, инфицированных смесью гер42 плюс транскрипты РНК1 и мутанты со сдвигом рамки рВ2-14-Н, вызванным вставкой сайта 8ре1 в ген Р42 РНК2 (см. фиг. 1), был примерно в два раза больше, чем в протопластах, инфицированных РНК1 плюс РНК2 дикого типа (фиг. 3В, дорожки 2 и 3). Отмечено, что уровни накопления двух других иммунологически определяемых продуктов гена РНК2 (основного вирусного белка оболочки и Р14; фиг. 1) не изменялись в присутствии гер42. Р13 и Р15 в таких экспериментах не могли быть определены иммунологически.

Белки ТСВ вируса ΒΝΥνν могут быть комплементированы ίη 1гап8

Способность репликонов, содержащих гены ТСВ, поддерживать функции движения в целых растениях тестировали путем совместной инокуляции листьев хозяина С. дшпеа, содержащих местные повреждения, одним из транскриптов РНК2, содержащих мутацию, исключающую функционирование гена ТСВ, плюс репликоном, содержащим соответствующий ген дикого типа. Во всех экспериментах инокулят также содержал транскрипт РНК1 дикого типа в качестве источника РНК-зависимой РНКрепликазы, хотя этот факт ниже не всегда будет подробно упомянут. Для гена Р42 протестированные мутанты РНК2 включали мутант со сдвигом рамки (рВ2-14-Н), вызванным вставкой сайта 8ре1 по нуклеотиду 2280, набор мутантов, содержащих короткие делеции в рамке в различных положениях в ОРС Р42 (мутанты рВ214-Δ312, -Α8Ν, -АВ1, -АВ2, -ΔΝ и -АНР1; фиг. 1 А; также см. ссылку 11), и делеционный мутант (рВ2-14-Р; фиг. 1), где удаление 935 нуклеотидов последовательности в 3'-5' направлении от ОРС Р42 инактивировало промотор для субгеномной РНК (РНК28иЬ_а), ответственный за синтез Р42. Инокуляты, содержащие транскрипт РНК1 плюс любой из указанных транскриптов мутантной РНК2, не продуцировали местные повреждения на С. дшпеа, и никакого потомства вирусной РНК не определялось в инокулированных листьях через 10 дней после инокуляции (фиг. 4, дорожки 3 и 5; см. ссылку 11 для других мутантов). На фиг. 4 репликон, показанный над каждой дорожкой, инокулировали в листья С. дшпеа совместно с транскриптом РНК1 дикого типа плюс либо транскриптом РНК2 дикого типа (дорожка 2), либо транскриптом мутантной РНК2, идентифицированными над каждой дорожкой. На дорожках 19 и 20 инокулят содержал гер42 и гер 15 (дорожка 19) или гер42 и гер1315 (дорожка 20), в дополнение к транскриптам РНК 1 и рВ2-14-НР1. Дорожка 1 содержит РНК из неинокулированного контрольного растения. Инокулированные листья собирали через 10 дней после инокуляции и тестировали на содержание вирусной РНК нозернгибридизацией, как описано на фиг. 3. Положения репликонов показаны стрелками. Когда транскрипт гер42 включили в инокулят, на инокулированных листьях появились многочисленные местные повреждения (20-80 на лист), за исключением инокулята, содержащего транскрипт делеционного мутанта рВ2-14-НР1 РНК2, который оставался бессимптомным. Полученные бледно-зеленые повреждения по внешнему виду были похожи на те, которые вызывались инокуляцией РНК1 плюс РНК2 дикого типа, за исключением мутанта рВ1-14-Р РНК2, где сформировались некротические местные повреждения. В этом последнем случае фенотип некротического повреждения может иметь отношение к продукции укороченной формы белка считывания (ВТ) мутантом РНК2 (7).

Нозерн-гибридизация инокулированных листьев через 10 дней после инокуляции выявила присутствие потомственной вирусной РНК с длиной, расчитанной для РНК 1, 2 и гер42 для всех мутантов РНК2 (фиг. 4, дорожки 2, 4, 7-11), за исключением делеционного мутанта рВ2-14НР1 (фиг. 4, дорожка 13) . Как будет показано ниже, отсутствие комплементации рВ2-14-ДНР1 с помощью гер42 существует вследствие делеции промотора для субгеномной РНК (РНК2§цЬ_Ь), который, как полагают, направляет трансляцию нижележащих белков ТСВ.

Сходные эксперименты по комплементации проводили с гер13, гер15 и дицистронной конструкцией гер1315. Как гер13, так и гер1315 обладали способностью комплементировать накопление на листьях (фиг. 4, дорожки 14 и 15) мутанта рВ2-14-1, в котором ген Р13 был выведен из строя путем вставки четырех нуклеотидов (вставка создавала сайт ХМ), хотя полученные местные повреждения были некротическими. Некротические местные повреждения получали также во время смешанных инфекций с указанными выше репликонами и РНК 1 и 2 дикого типа (см. ниже), что указывает на то, что симптоматический фенотип, относящийся к репликону, является доминантным по отношению к дикому типу. Новые симптомы могут иметь отношение к различиям в скорости синтеза или в уровне накопления Р13, когда он экспрессируется скорее из репликона, чем из полноразмерной РНК2.

В экспериментах, которые описаны выше, важно продемонстрировать, что мутация, впервые введенная в ген Р42 или Р13 на транскрипте РНК2, все еще представлена в потомственной РНК2, что означает, что дефектная копия гена ТСВ на транскрипте не превращалась в дикий тип путем рекомбинации РНК ίη р1ап!а (21) при помощи копии, представленной на репликоне. Поэтому эксперимент ВТ-РСК. проводили на потомственной вирусной РНК из растения, инфицированного РНК1, транскриптом рВ2-14-Н (ген Р42, разделенный вставкой в сайт 8ре1) и гер42. Пара праймеров, использованная в ВТРОЕ. гибридизовалась с последовательностями РНК2, фланкирующими ген Р42 и, следовательно, амплифицировала копию гена, представленного в РНК2, но не копию на репликоне, где фланкирующие последовательности отсутствуют. Анализ с помощью ферментов рестрикции выявил, что сайт 8ре1 отсутствовал в полученном амплифицированном фрагменте ДНК, что ожидалось скорее для мутантной, чем для дикой формы гена ТСВ. Сходный анализ потомственной вирусной РНК из растений, инфицированных РНК 1, рВ2-14-1 (мутация со сдвигом рамки в гене Р13, создающая сайт Х1ю1) и либо гер13, либо гер1315, сходным образом продемонстрировал, что мутация, отменяющая функцию копии гена Р13 на транскрипте РНК2, сохранялась в потомственной РНК2. Авторы делают вывод, что гер42 и гер13, в действительности, комплементируют функцию Р42 и Р13 скорее путем обеспечения продукта гена ίη 1гап8, чем просто выступая в качестве источника последовательности ТСВ дикого типа для рекомбинации.

Неожиданно было обнаружено, что репликон, экспрессирующий ген Р15 дикого типа (гер15), был не способен комплементировать дефектный по Р15 мутант РНК2 рВ2-14-1 при смешанных инокуляциях. На инокулированных листьях через 10 дней после инокуляции местные повреждения не формировались, и в листьях не смогли обнаружить вирусную РНК с помощью нозерн-блотинга (фиг. 4, дорожка 17). С другой стороны, когда транскрипт рВ2-14-1 совместно инокулировали с гер1315, появлялись местные повреждения (некротического типа) и легко определялась потомственная вирусная РНК (фиг. 4, дорожка 18). В этом последнем случае анализ продукта ВТ-РСВ, содержащего ген Р15 в потомственной РНК2, выявил, что мутация, отменяющая функцию гена, все еще присутствовала. Комплементация рВ2-14-1 все еще наблюдалась, когда ОРС Р13 в дицистронном репликоне была нарушена с помощью мутации со сдвигом рамки (гер1315-1; фиг. 1), что доказывает, что экспрессия полноразмерного Р13 с первой ОРС дицистронного репликона не требуется для комплементации с помощью нижележащей копии гена Р15.

Доказательство того, что Р15 экспрессируется с дицистронной субгеномной РНК

Субгеномную РНК, полученную из РНК2 (РНК2§цЬ_Ь), длиной примерно 1500 нуклеотидов, определяли в ткани, инфицированной вирусом ΒΝΥνν (2). 5'-конец этих РНК не был точно картирован, но предполагалось, что он находится недалеко от 5'-конца ОРС Р13. Не было обнаружено субгеномной РНК с 5'-концом в 3'5' направлении от ОРС Р15, что увеличивает вероятность того, что, как и в вирусе ΒδΜν (8), Р13 и Р15 оба экспрессируются из РНК2§цЬ_Ь.

Упомянутая выше неспособность гер42 комплементировать дефектный по Р42 мутант РНК2 рВ2-14-АНР1 может происходить из противоположных эффектов делеции РНК2 на синтез нижележащих белков ТСВ, если делеция отменяла функционирование промотора РНК2§цЬ_Ь (правая граница делеции в рВ2-14ДНР1 находится всего в 30 остатках в 5'-3' направлении от инициирующего кодона Р13). Для проверки этой гипотезы был проведен эксперимент, в котором транскрипт рВ2-14-АНР1 был комплементарен как гер42, так и гер1315. На листьях, инокулированных этой смесью, развивались местные повреждения и содержались потомственные вирусные РНК (фиг. 4, дорожка 20). Если, с одной стороны, гер13, но не гер1315, использовали совместно с гер42 для комплементации рВ2-24-НР1, симптомы не появлялись и потомственные вирусные РНК не определялись нозерн-блотингом (фиг. 4, дорожка 19). Эти наблюдения совпадают с гипотезой, что делеция рВ2-14- НР1 препятствует экспрессии нижележащих ОРС ТСВ, возможно, путем блокирования транскрипции РНК2§цЬ_Ь. Далее, тот факт, что комплементация была успешной с гер1315, но не с гер13, показывает, что Р15, как и Р13, транслируется с РНК2§цЬ_Ь.

Независимая экспрессия Р15 ингибирует инфекцию вирусной РНК дикого типа

Способность гер1315, но не гер15, комплементировать дефектный по Р15 мутант РНК2 рВ2-14-1 при инфицировании листьев может означать, что независимая экспрессия Р15 из моноцистронного репликона препятствует циклу вирусной инфекции путем продукции генного продукта в избыточных по отношению к Р13 количествах. Для проверки этой гипотезы провели эксперимент, в котором гер15 инокулировали в листья С. дшпоа вместе с вирусными РНК1 и 2 дикого типа. На инокулированных листьях повреждения не появлялись, даже на поздних стадиях после инфицирования (фиг. 5А), и никакой вирусной РНК не определялось с помощью нозерн-блотинга (фиг. 5В, дорожка 6). Фиг. 5 (А) представляет листья С. с.|шпоа. инокулированные РНК1 и 2 (слева) или РНК1 и 2 плюс гер15 (справа). Листья фотографировали через 20 дней после инокуляции, когда местные повреждения на листе слева рапространялись таким образом, что покрывали большую часть поверхности листа. На фиг. 5 (В) представлен анализ с помощью нозерн-блот-гибридизации (как описано на фиг. 3) содержания вирусной РНК в листьях С. дшпоа, инокулированных только РНК1 и 2 вируса ΒΝΥνν (дорожка 1) или совместно с гер0 (дорожка 2), гер42 (дорожка 3), гер13 (дорожка 4), гер1315 (дорожка 5), гер15 (дорожка 6), гер15-1 (дорожка 7), гер15-Х (дорожка 8) или герР^-Р17 (дорожка 9) . Положения репликонов показаны стрелками. (С) Анализ с помощью нозерн-гибридизации содержания вирусной РНК в инокулированных листьях (дорожки 1, 3 и 5) и корнях (дорожки 2, и 6) растения Ве1а тасгосагра, либо мнимо инокулированных (дорожки 1 и 2), либо инокулированных РНК 1, 2 и 3 вируса ΒΝΥνν (дорожки 3 и 4), либо РНК 1, 2 и 3 плюс гер15 (дорожки 5 и 6). РНК3 включили в инокулят, так как она необходима для системного движения в В. тасгосагра (22). При этих условиях листья, инокулированные только РНК 1 и 2, были сильно инфицированы (фиг. 5А; фиг. 5В, дорожка 2). Ингибирование вирусной инфекции с помощью гер15 было дозозависимым. Добавление к смеси инокулята в десять раз меньшего количества гер15 все еще приводило к почти полному ингибированию формирования повреждений, но меньшие количества репликона были прогрессивно менее эффективны при блокировании инфекции. Вер 15 также блокировал появление потомственной вирусной РНК в инокулированных листьях и корнях Ве1а тасгосагра, системном хозяине вируса ΒΝΥνν (Фиг. 5 С, дорожки и 6). С другой стороны, пустой репликон герО и репликоны, экспрессирующие два других белка ТСВ (гер42, гер13, гер1315), незначительно ингибировали инфицирование листьев С. дшпоа вирусом ΒΝΥνν (фиг. 5В, дорожки 2-5).

Поскольку гер15 не препятствовал амплификации РНК 1 и 2 в протопластах С. дшпоа (см. фиг. 3), это предполагает, что репликон препятствует движению вируса из начального места инфицирования в соседние клетки (движение от клетки к клетке) во время формирования местных повреждений на листьях. Формирование повреждений не ингибировалось совместной инокуляцией РНК 81гах 12 с репликонами гер15-1 или гер15-Х (Фиг. 5В, дорожки 7 и 8), которые кодируют укороченные формы Р15 со сдвигом рамки. Эта находка подтверждает, что скорее экспрессия Р15 из репликона, чем простое присутствие соответствующей последовательности РНК, необходима для ингибирования во время экспериментов со смешанной инфекцией. В присутствии гер15-Х, однако, полученные местные повреждения имели размер около одной трети диаметра повреждений, сформированных в результате инфекции только 81гах 12 или 81газ 12 плюс гер15-1, и содержание потомственной вирусной РНК в инфицированных листьях было значительно ниже (фиг. 5В, дорожка 8). Этот факт предполагает, что почти полноразмерная молекула Р15, продуцируемая гер15-Х, несмотря на то, что она не способна заменить Р15 дикого типа в эксперименте по комплементации, может препятствовать движению Р15 дикого типа, получаемого из РНК2, от клетки к клетке. Предположительно, полноразмерная и укороченная формы Р15 конкурируют друг с другом за сайты связывания на другом компоненте (который может иметь либо вирусное, либо клеточное происхождение), вовлеченном в процесс движения.

Как указано выше, сравнения последовательностей различных вирусов, обладающих ТСВ, выявили небольшое сходство последовательностей между различными генами ТСВ3. Например, белок ТСВ3 размером 17 кДа (Р17) фуровируса кустистости арахиса (РСУ) не имеет значительного сходства последовательности с Р15 вируса ВКУУУ (4), даже несмотря на то, что оба вируса могут инфицировать С. дшпоа. Чтобы определить, может ли независимая экспрессия белка ТСВ3 вируса РСУ препятствовать инфицированию вирусом В№УУУ путем, аналогичным тому, который наблюдается с гер15, был сконструирован репликон, полученный из РНК4 вируса ВКГУУ, содержащий ТСВ3 вируса РСУ (герРСУ-Р17; фиг. 1). На листьях С. дшпоа, инокулированных РНК 1 и 2 вируса ВКУУУ плюс герРСХ-РН, симптомы не развивались, и потомственные РНК вируса В№УУУ не определялись с помощью нозернблотинга (фиг. 5А, дорожка 9). Это наблюдение предполагает, что пути, с помощью которых вирусы В№УУУ и РСУ перемещаются от клетки к клетке в С. дшпоа, имеют, по меньшей мере, один общий элемент, который, несмотря на их различие в последовательности, взаимодействует с продуктами ТСВ3 обоих вирусов.

Изобретатели показали, что репликоны, несущие Р42 и Р13, могут комплементировать РНК2 вируса ΒΝΥνν, несущую соответствующий дефектный ген, а репликон, несущий Р15, нет. Однако в последнем случае комплементация может иметь место в том случае, если ген Р15 выступает в качестве второго гена на дицистронной РНК (гер1315), несущей ген Р13 в первом положении. Следует отметить, что относительное расположение генов Р13 и Р15 на гер1315 идентично их расположению на РНК28иЬ_ь, субгеномной РНК, которая, как полагают, направляет синтез обоих белков в инфекциях дикого типа. Предполагают, что успешное движение ΒΝΥνν от клетки к клетке требует присутствия Р13 и Р15 в соответствующих относительных количествах и что продукция обоих белков из одной и той же субгеномной РНК представляет механизм для координации их синтеза. Неспособность гер15 комплементировать Р15 мутантного транскрипта ρΒ2-14-1 РНК2 и его способность ингибировать инфицирование вирусом дикого типа, могла бы иметь место вследствие сверхпродукции Р15 относительно Р13, когда первый из названных белков транслируется из репликона, а последний - из РНК2. С другой стороны, когда Р15 экспрессируется из дицистронного репликона гер1315, могут быть получены соответствующие относительные количества Р13-Р15, делающие возможным движение от клетки к клетке. Правильные относительные уровни накопления Р13 и Р15 при инфекции вирусом дикого типа неизвестны. Трансляция гер1315 в экстракте зародышей пшеницы давала превышение количества Р13 относительно количества Р15 от трех до пяти раз, но такие эксперименты не обязательно отражают ситуацию ίη р1ап1а. так как скорости метаболизма двух белков могут значительно различаться. Эти результаты показывают, что ΤΟΒ-опосредо ванное движение от клетки к клетке является менее чувствительным к сверхэкспрессии Р42 и Р13 относительно правильных уровней, характерных для нормальной инфекции, поскольку совместная инокуляция гер42, гер13 или гер1315 с вирусом дикого типа не ингибировала инфекцию (фиг. 5, дорожки 35), хотя повреждения, формирующиеся в присутствии гер13 и гер1315, были некротическими. Данные эксперименты, таким образом, показывают, что экспрессия Р15 в трансгенных растениях могла бы обеспечить механизм придания этим растениям устойчивости к вирусу ΒΝΥνν (патоген-опосредованной устойчивости;

ссылка 23) при условии, что могут достигаться достаточные уровни экспрессии Р15.

Для лучшего понимания того, как относительные уровни Р13 и Р15 регулируются в процессе трансляции, необходимо знать, как цистрон Р15 становится доступным для рибосом на РНК2§цЬ_ь. Инициация трансляции на внутреннем цистроне эукариотической матричной РНК может происходить несколькими путями, включая (ί) 1еаку сканирование, когда фракция рибосомальных субъединиц, которые начинают сканирование РНК на 5'-конце, проскакивает через первый (неоптимальный) вышележащий АИС без инициации (24), и (ίί) внутренняя инициация, когда рибосомные субъединицы связываются непосредственно со специфической последовательностью на РНК вблизи внутреннего инициирующего кодона (25). Маловероятно, что третий возможный механизм терминацииреинициации (24) может наблюдаться в любом из ΤΟΒ -содержащих вирусов, поскольку частичное перекрывание между цистронами ΤΟΒ2 и ΤΟΒ3 потребует от рибосом обратного сканирования после терминации ΤΟΒ2 для достижения инициирующего кодона ΤΟΒ3. Предложили, что белки ΤΟΒ3 вирусов Β8ΜΥ и РУХ транслируются с помощью механизма 1еаку сканирования (8, 9). Ген Р15 вируса ΒΝΥνν может быть также получен 1еаку сканированием, хотя следует отметить, что контекст инициирующего кодона Р13 вируса ΒΝΥνν (Аиллиои) является почти оптимальным, и существуют также два нижележащих кодона АИС, которые сканирующие субъединицы должны пропустить для достижения инициирующего кодона Р15.

Примеры

Следующие примеры представляют трансформацию растений, проведенную способом, описанным в международной заявке XV О 95/10178, которая включена здесь путем ссылки.

Растительный материал и условия выращивания были такими, как описано у На11 с соавт. (Р1ап1 Се11 КероПъ 12, рр.339-342, 1993), Ребегаеп с соавт. (Р1аШ 8с1епсе 95, рр.89-97, 1993), и На11 с соавт. (№11иге Ью1есйпо1оду 14, 1996, в печати).

Плазмидные вектора и получение ДНК

Плазмиду рЕТ-Р15, несущую нуклеотидную последовательность Р15, обрабатывали рестриктазой по ее единственному сайту для ΒатΗI и затупляли с помощью ДНКполимеразы фага Т4. После очистки путем электрофореза в 0,8% агарозном геле линеаризованную плазмиду обрабатывали рестриктазой по ее единственному сайту для №оГ Фрагмент гена Р15 размером 400 п.о. очищали электрофорезом и встраивали в рМТОХ-ИЬ, несущую полиубиквитиновый промотор из АгаЬ16орщ8 (Могп5 е1 а1., Р1ап1 Мо1еси1аг Βίθ^^ 21, рр. 895-906, 1993), энхансерную последовательность вируса ΤΜν и 3'-терминатор №5, и обрабатывали рестриктазами №о1 и 8таГ В полученной таким образом плазмиде рМ.ШХ-иЬ-РГЗ нуклеотидная последовательность гена Р15 поставлена под контроль полиубиквитинового промотора из АгаЬ16ор818, за которым следует энхансерная последовательность вируса ΤΜν.

ЕсоК1-фрагмент из плазмиды ρΒ235Аск содержит ген рак использующийся в качестве селективного маркера, кодирующего фосфинотрицинацетилтрансферазу (полученный от Адгеуо, Берлин, Германия). В этом ЕсоК1фрагменте нуклеотидная последовательность гена ра! находится под контролем 5' и 3' сигналов экспрессии вируса мозаики цветной капусты. Плазмида рМ1Б86, полученная в результате комбинации этого ЕсоК1-ра!-фрагмента и частичного гидролиза плазмиды рМ.ШХ-иЬ-РЕэ рестриктазой ЕсоШ, содержит и ген ра!, и ген Р15. Эта плазмида рМ.ШБ6 представляет собой высококопийную плазмиду на основе вектора риС18 и содержит также ген β-лактамазы (атр^г). В плазмиде рЮРИ7, несущей тот же фрагмент гена ра!, что и рΒ235Аск, ген βлактамазы был заменен на ген 1дрб (имидазолглицеролфосфатдегидратазы) из Бассйаготусек сегеуыае (Б(гиЫ е! а1., Ргосеебшдк о! (Не №1йопа1 Асабету о! Бс1епсе ИБА 73, рр. 1471-1475, 1976). Селекцию и поддержание плазмиды в клетках ЕксйепсЫа сой осуществляли путем комплементации ауксотрофного по ΗίκΒ штамма БΒ3930 на минимальной среде в отсутствие антибиотиков. Фрагмент гена Р15 с его убиквитиновым промотором и терминаторной последовательностью очищали в виде фрагмента размером 2500 п.о., полученного из плазмиды рМТОХ-ИЬ-Р^ после ее гидролиза по единственному сайту для рестриктазы НшбШ, с последующим частичным гидролизом рестриктазой ЕсоКб. Этот фрагмент затупляли и встраивали в плазмиду рЮРЭ7 с тупыми концами, разрезанную по единственному сайту ΝοοΙ. Полученная плазмида рЮРЭБ4 содержит как ген ра!, так и ген Р15 в составе вектора без гена βлактамазы.

Растительный материал

Растущие 1л ш νίίτο культуры получали из проростков сахарной свеклы для обеспечения постоянного и однородного источника стерильного исходного материала и поддерживали с 4недельным периодом субкультивирования, как описано у На11 с соавт. (Р1ап! Се11 КероПк 12, рр. 339-342, 1993).

Препаративное выделение эпидермиса сахарной свеклы

Использовали модифицированную версию способа смешивания по К гике с соавт. (Р1ап! РНук1о1оду 690, рр. 1382-1386, 1989). Для каждого выделения перемешивали 2 г листьев (с удаленными главными жилками) от 4-недельных проростков в смесителе ^аппд при максимальной скорости (23000 об/мин) в течение 60 с в металлическом лабораторном стакане на 250 мл, содержащем 50 мл холодной (4°С) среды Г1со11 (100 г/л Исо11, 735 мг/л СаС1₂-2Н₂0, 1 г/л РУР40, автоклавированной). Фрагменты эпидермиса затем собирали на 297 мкм нейлоновом фильтре и промывали 500 мл стерильной водопроводной воды. Их отмывали с фильтра в чашку Петри диаметром 9 см, используя 10 мл СР^9М, содержащего 3,8% (масса/объем) СаС1₂-2Н₂0 (Кгепк е! а1., Τйеο^еΐ^са1 апб АррНеб Сепебск 79, рр. 390-396, 1990). Оставшиеся фрагменты листьев удаляли, и чашки предварительно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.

Выделение протопластов замыкающих клеток (из устьиц) из обогащенных эпидермисом фракций

Для получения фракции эпидермиса суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 55 х д, после чего удаляли супернатант. Осадок ресуспендировали в 50 мл ферментной смеси и аликвоты объемом 5 мл переносили на каждую из 10 чашек Петри диаметром 6 см (Сгетег, качество ТС), закрывали парафильмом и инкубировали в течение ночи при 25°С в темноте, осторожно перемешивая. Среда для гидролиза субстрата содержала СР^9М, с добавлением 0,5% (масса/объем) целлюлазы КБ и 3% (масса/объем) мацерозима К10 (УакиН НопкНа, Τοкуо, 1арап), рН 5.8. На следующее утро протопласты, в основном, плавали около поверхности гидролизной смеси. После осторожного перемешивания суспензий стерильной пипеткой для высвобождения протопластов, все еще прилипающих к фрагментам кутикулы, гидролизаты объединяли и пропускали через нейлоновые фильтры 297 и 55 мкм. Фильтрат смешивали с равным объемом изоосмотического Регсо11, содержащего 15% (масса/объем) сахарозы (Регсо1115Б), и разделяли на 12 х 12 мл центрифужных пробирок. В каждой пробирке первый 1 мл СР^15Б (Кгепк е! а1., 1990) и затем 0,5 мл 9% (масса/объем) маннитола, содержащего 1 мМ СаС12 (9М), осторожно наслаивали на суспензию протопластов. После центрифугирования при 55 х д в течение 10 мин живые замыкающие клетки были видны в слоях на поверхности раздела СР^15Б/9М. Для концентрирования протопластов эти слои собирали и смешивали с Регсо1115Б для получения конечного объема 16 мл. Затем он был распределен в 2 пробирки для центрифугирования, нанесен слоями, как указано выше, и снова центрифугирован. Осторожное удаление слоев 9М давало выход обогащенной фракции протопластов замыкающих клеток для последующего подсчета с использованием гемоцитометра.

Трансформация протопластов

Трансформации осуществляли в центрифужных пробирках объемом 12 мл, каждая из которых содержала 1х10⁶ протопластов, суспендированных в 0,75 мл среды 9М. Сначала добавляли плазмидную ДНК (50 мкг рМШХ-ЦЬР15 и рЮРЭБ4) и сразу после перемешивания по каплям добавляли 0,75 мл среды с ПЭГ (40% ПЭГ 6000, растворенный в среде Г (Кгепк е! а1., №1Ц1ге 296, рр. 72-74, 1982). После тщательного перемешивания суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Затем с интер валом 5 мин добавляли 4x2 мл среды Р. После центрифугирования в течение 5 мин при 55 х д супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде 9М, и снова центрифугировали. Наконец, клетки ресуспендировали в 1 мл среды 9М для подсчета.

Культура протопластов и селекция

Протопласты помещали в альгинат Са и культивировали в модифицированной жидкой среде К8Р (На11 с1 а1., 1990). Через 7 дней для селекции стабильно трансформированных клеток добавляли активное соединение (гербицид) биалафос (Метц 8е1ка Иб. 1арап) до получения конечной концентрации 200 мкг/л. На 18-й день альгинатные диски разрезали на кусочки размером 3 мм и переносили на среду РСо (Эе С гее Г апб 1асоЬ5. Р1аШ 8с1епсе Бейегк 17, рр. 55-61, 1979), с добавлением 1 мкМ ВАР (РС1В) и 250 мкг/л биалафоса, и придавали твердую форму с помощью 0,8% агарозы.

Каллусная культура и регенерация

Через 21 день кусочки альгината, содержащие невидимые микрокаллусы, переносили на чашки Петри диаметром 9 см, содержащие 20 мл среды К (3% сахарозы, 0,8% агарозы, 1 мкМ ВАР, среда РСо, рН 5,8, автоклавированная). Культивирование проводили в темноте, как описано выше.

Рыхлые, водянистые каллусы, достигшие размера примерно 1-2 мм в диаметре, переносили по отдельности на свежую среду К и культивировали группами по 20 каллусов. На этой стадии ПЦР-анализ подтвердил присутствие трансформантов.

С интервалом в две недели все каллусы были перенесены на свежую среду.

Регенеранты появлялись в течение первых 8 недель культивирования отдельных каллусов. Когда первые растущие культуры становились заметными и достигали размера примерно 2 мм, чашку переносили на свет (3000 люкс), 25°С, с продолжительностью дня 15 ч.

Проростки длиной около 4 мм переносили в отдельные культуральные пробирки, содержащие 15 мл среды К, и затем пересевали на свету, как описано выше.

Укоренение и перенос в почву

Когда проростки достигали стадии четырех листьев (обычно через 5-6 недель с одним пересевом через 3 недели), их переносили в культуральные пробирки, содержащие 15 мл среды Ь (3% сахарозы, 0,8% агарозы, 25 мкМ индолмасляной кислоты (ИМК), среда РСо, рН 5,8, автоклавированная), (среда РСо описана у Эе СгееГ с соавт., Р1апй 8с1епсе Бейегк 17, рр. 55-61 (1979)) и далее культивировали, как описано выше.

Когда, по меньшей мере, один корень достигал длины 1 см, проростки удаляли из культуральных пробирок и промывали проточной водопроводной водой для удаления всех фрагмен тов агара, и переносили в почву в теплице в горшки диаметром 9 см.

Проростки покрывали прозрачной пластиковой чашкой для обеспечения влажной окружающей среды в течение 7 дней, после чего они могли расти без защиты.

Растение, трансформированное последовательностью 8ЕО ΙΌ N0.1 в соответствии с изобретением, выжило и экспрессировало Р15.

Анализ ДНК

Геномную ДНК, выделенную из первичных трансформантов, подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле после обработки рестриктазами и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, используя стандартные методики в соответствии с рекомендациями производителя. Гибридизацию проводят с ДНК, в виде а³²РбАТР-меченых зондов, чье присутствие желательно устанавливать. Мембраны промывали до конечной чистоты 0,1% х 88С, 0,1% 8Ό8 при 60°С. Гибридизованную ДНК визуализировали в темноте при помощи рентгеновской пленки от 24 до 48 ч.

Анализ с помощью ПЦР

Использовали стандартные методы ПЦР для определения ряда интактных плазмидных последовательностей. Реакции проводили, используя 25 циклов денатурации в течение 1 мин при 94°С, отжига в течение 1 мин; удлинения в течение 2 мин при 72°С с конечным периодом удлинения 5 мин. Температуры отжига оптимизировали для каждой комбинации праймеров. Присутствие кодирующего района гена Р15 вируса ΒΝΥνν в геноме сахарной свеклы подтверждали с помощью ПЦР, используя пару олигонуклеотидов в качестве праймеров: Μ0ν1, смысловой праймер [5'-сСтССТТС ТССТТАААСТАСАТТТАТС-3' (нуклеотиды с 3 по 29 на 8ЕО ΙΌ N01)] и Μ0ν2, антисмысловой праймер [5'-СТАТСАТАССААААССАА АСТАТАСАС-3' (комплементарный нуклеотидам с 369 по 395 на 8ЕО ΙΌ ν01) ]. Этот фрагмент длиной 393 п.о. содержит полный кодирующий район гена Р15 вируса ΒΝΥνν (см. фиг. 7).

Фиг. 7: Анализ продуктов ПЦР, полученных с ДНК из Р15-трансформантов сахарной свеклы (дорожки 5-7) и нетрансформированного растения (дорожка 4). В качестве маркера размера (дорожка 1) использовали лестницу из фрагментов ДНК с низкой массой Боте ΟΝΛ Ма55 Баббег® (Б1Ге Тесйпо1од1е8). Дорожки 2 и 3 соответствуют положительным контролям (рМ1В86/р1СРЭ84). Стрелка слева показывает положение ожидаемого продукта ПЦР.

Анализ с помощью блот-гибридизации по Саузерну

Интеграцию гена Р15 вируса ΒΝΥνν в геном сахарной свеклы анализировали с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Выделяли общую ДНК из первичных трансгенных регенерантов, переваривали рестриктазами (РчЕ Крп1,

Ναοί. 8ас1), подвергали электрофорезу, блотингу и гибридизовали с Р 15-специфичными (ΒΝΥνν) Р³²-мечеными зондами, используя амплифицированный с помощью ПЦР фрагмент М0У1-М0У2 (см. фиг. 8).

Фиг. 8. Анализ с помощью блотинга по Саузерну. Лямбда ДНК, гидролизованную рестриктазой Ηίηάίίί, использовали в качестве маркера размера (дорожка 1). Дорожки с 2 по 16, ДНК трансгенных растений: с 2 по 4 - гидролизованная рестриктазой 8ас1, с 6 по 8 - гидролизованная рестриктазой Рз!1, с 10 по 12 - гидролизованная рестриктазой №οΙ, с 14 по 16 - гидролизованная рестриктазой ΚρηΙ. Дорожки 5, 9, 13 и 17 соответствуют ^трансформированному растению.

Источники информации

1. Ктсбагбз Κ.Ε. & Татаба Т., Аппи. Ису. Рбу!ора!бо1. 30, ρρ. 291-313 (1992).

2. Сбтег Ό. е1 а1., ^го1о§у 189, рр. 40-47 (1992).

3. ВоихоиЬаа 8. е1 а1., 1. Сеп. νίτοί. 68, рр. 615-626 (1987).

4. Нег/од Ε. е1 а1., 1. Сеп. Уио1. 18, рр. 3147-3155 (1994).

5. 8со!! Κ. Р. е1 а1., 1. Сеп. Упо1. 75, рр. 3561-3568 (1994).

6. Коошп Ε.ν. & Эо1)а ν.ν., Сп!. Кеу. Вюсбет. апб Мо1. Вю1. 28, рр. 375-430 (1993).

7. 8сбтй! С. е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А. 89, рр. 5715-5719 (1992).

8. Могохоу 8.Υ. е1 а1., 1. Сеп. Уйо1. 72, рр. 2039-2042 (1991).

9. ΖΙμι.! Н. & 1аскзоп А.0., Уйо1оду 216, рр. 367-379 (1996).

10. ЦиШе! Ь. е1 а1., У|го1оду 172, рр. 293301 (1989).

11. Е1еука§1еп е1 а1., 1. Сеп. Упо1. 77, рр. 889-897 (1996).

12. 1ирт I. е1 а1., У1го1оду 178, рр. 273-280 (1990).

13. 8апдег Е. е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8ск и8А 74, рр. 5463-5467 (1977).

14. Егйзсб С. е1 а1., 1. Сеп. У1го1. 46, рр. 381-389 (1980).

15. Ьаеттб и.К., №11иге 227, рр. 680-685 (1972).

16. Бсбаддег Н. & уоп 1адо\у С., Апа1. Вюсбет. 166, рр. 368-379 (1987).

17. Ьетапе 0. е1 а1., У1го1о§у 162, рр. 232235 (1988).

18. №езЬас11-К1бздеп и. е1 а1., Уйо1о§у 178, рр. 52-61 (1990).

19. Небп. А. е1 а1., Упо1о§у 210, рр. 73-81 (1995).

20. Татаба Т. е1 а1. , 1. Сеп. Упо1. 70, рр. 3399-3409 (1989).

21. Кохак Μ., 1. Се11. Вю1. 108, рр. 299-341 (1989).

22. Ребебег 1. & 8опепЬегд Ν, №11иге 334, рр. 320-325 (1989).

23. Татаба Т. & ВаЬа Т., Аппа1з ог !1е Р11у1ора11ю1од1са1 8ос1е1у ок 1арап 39, рр. 325-332 (1973).

24. Киз/а1а М. & Рик С., Аппак ок РНу1ора!бо1оду 9, рр. 435-446 (1977).

25. Кезкш В., АгсЫу киг М1кгоЬю1оду 49, рр. 348-374 (1964).

26. Азбег М.1.С., Кбкоташа 1п Тбе зидаг Ьее1 сгор, еб. И.А. Сооке апб К.К. 8соб, Сбартап & На11, Ьопбоп, рр. 312-338 (1993).

27. К1сбагб-Мо1агб М., Кбкоташе 1п ΙπκΙί1и1 кгапсак бе 1а Ьебегауе 1пбиз1пе11е. Сотр!егепби без 1гауаих еккес!иез еп 1994, 1ТВ, Рагк рр. 225-229 (1995).

23. Непгу С.М. е1 а1., Р1ап1 Ра11ю1оду 41, рр. 483-489 (1992).

29. Сгазз1 С. е1 а1., Рбу!ора!б. Мебй. 28, рр. 131-139 (1989).

30. Мегбшод1и Ό. е1 а1., Асаб. Адлс. Ег. 79, п° 6, рр. 85-93 (1993).

31. 8со11еп 0.Е. е1 а1., АгсЫуез ок ^го^ду 136, рр. 349-361 (1994).

32. Вибепг С. & Вигску К., Ргосеебтдз ок Не Е1гз1 8утроз1ит ок Не 1п1егпабопа1 \Уог1бпд Сгоир оп Р1ап1 νίπ.^3 \\Й11 Еипда1 Vес!ο^з, Вгаипзсбете1д Сегтапу, Аидиз! 21-24 (1990).

33. \У1Шпеу Ε.Ό., Р1ап! Икеазе 73, рр. 287289 (1989).

34. Ро\уе11 А.Р. е! а1., 8с1епсе 232, рр. 738743 (1986).

35. Егйсбеп ЕН. & Веасбу Κ.Ν., Апп. Кеу. МкгоЬюк 47, рр. 739-763 (1993).

36. \Убзоп Т.М.А., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 90, рр. 3134-3141 (1993).

37. Сопза1уез Ό. & 8бдб!от 1.Б., Бетшагз 1п V^^ο1οду 4, рр. 397-405 (1993).

38. О'НаПшп К. е! а1. , Вю!есбпо1оду 10, рр. 309-314 (1992).

39. Кабегбок 1. е! а1., Р1ап! Се11 Керогк 9, рр. 224-228 (1990).

40. ΕΙιΕιέ и. е! а1., Тбеогебса1 апб Аррбеб Сепебс 81, рр. 777-782 (1991).

41. Кгаиз 1. е! а1., Е1е1б регкогтапсе ок !гапздешс зидаг Ьее! р1ап!з ехргезшд ΒNΥVV соа! рго!еш р1ап!з, Еоибб 1п!етабопа1 Сопдгезз ок Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, 1п!. 8ос. ког Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, Атз!егбат (1994).

42. Макз Ε. е! а1., Ргосеебшдз ок Не ТЫгб 1п!етабопа1 Бутрозшт оп !1е Вюзаке1у Кези1!з ок Е1е1б Тез!з ок Сепебсабу МобШеб Р1ап!з апб Мкгоогдапктз, Моп!егеу, рр. 129-139 (1994).

43. Угпз е! а1. , Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду 21, рр. 895-906 (1993).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ придания растительной клетке или растению устойчивости к вирусу, содержащему последовательность 3 из тройного блока генов (ТСВ3), с условием, что это не вирус X картофеля, состоящий из следующих этапов:

получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность ТСВ3 указанного вируса или соответствующую ей кДНК или их варианты, основанные на вырожденности генетического кода, связанные с одной или более регуляторными последовательностями, активными в растении, трансформации растительной клетки, полученной конструкцией нуклеиновой кислоты и, при необходимости, регенерации трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вирус выбирают из группы, состоящей из вируса ямчатости ствола яблони, вируса ожога черники, вируса М картофеля, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики орхидеи СутЫб1ит, вируса полосатой мозаики ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости арахиса и вируса свеклы, передающегося через почву.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что растительной клеткой является устьичная клетка.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что растение выбирают из группы, состоящей из яблони, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя или арахиса.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный вирус представляет собой вирус некротических желтых жилок свеклы ^ΝΥνν) с последовательностью ТСВ3 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ. 1, приведенной на фиг. 6, которая заключена между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК2 вируса ВКГУУ, а растение является свеклой, предпочтительно сахарной свеклой (Вс1а уц1дап8).
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что регуляторная последовательность представляет собой промоторную последовательность или терминаторную последовательность, активную в растении.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что промоторная последовательность является конститутивной или чужеродной растительной промоторной последовательностью.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что промоторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промотора 358 вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора АгаЫборЦк ФаНапа.
9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что промоторной последовательностью является промотор, который активен, в основном, в корневых тканях, например, промотор раг гена гемоглобина из Рсгозроша апбсг8оШ1.
10. Трансгенное растение, устойчивое к вирусу, полученное способом, охарактеризованным в п.1.
11. Трансгенное растение по п.10, отличающееся тем, что вирус выбирают из группы, состоящей из вируса ямчатости ствола яблони, вируса ожога черники, вируса М картофеля, вируса мозаики белого клевера, вируса мозаики орхидеи СутЫбшт, вируса X картофеля, вируса полосатой мозаики ячменя, вируса курчавости верхушки картофеля, вируса кустистости арахиса и вируса свеклы, передающегося через почву.
12. Трансгенное растение по пп.10 и 11, являющееся растением, выбранным из группы, состоящей из яблони, черники, картофеля, клевера, орхидеи, ячменя или арахиса.
13. Трансгенное растение по п.10, отличающееся тем, что оно является свеклой, предпочтительно сахарной свеклой (Вс1а уц1дап8), а вирус представляет собой вирус ВКГУУ с последовательностью ТСВ3 8ЕЦ ГО ΝΟ. 1, приведенной на фиг. 6, которая заключена между нуклеотидами 3627 и 4025 5'-цепи геномной или субгеномной РНК2 вируса ВКГУУ.
14. Трансгенное растение по любому из пп.10-13, отличающееся тем, что регуляторная последовательность представляет собой промоторную последовательность или терминаторную последовательность, активную в растении.
15. Трансгенное растение по любому из пп.10-14, отличающееся тем, что промоторная последовательность является конститутивной или чужеродной растительной промоторной последовательностью.
16. Трансгенное растение по п.15, отличающееся тем, что промоторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промотора 358 вируса мозаики цветной капусты и полиубиквитинового промотора АгаЫ6ор818 ФаНапа.
17. Трансгенное растение по п.15 или 16, отличающееся тем, что промоторной последовательностью является промотор, который активен, в основном, в корневых тканях, например промотор раг гена гемоглобина из Рсгозроша апбсгзопп.