CN116162645A - 诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于转录因子应用技术领域，公开了一种诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用。其中诱导转录因子CoWRKY3核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用包括诱导转录因子CoWRKY3编码的蛋白质在提高植物抗炭疽病能力的应用。CoWRKY3基因对培育抗炭疽病品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义，本发明首次提出，并验证了CoWRKY3基因在烟草中的抗炭疽病的功能，丰富了培育强抗病性作物的基因资源。
Description
技术领域
本发明属于转录因子应用技术领域，具体涉及诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用。
背景技术
油茶(Camellia oleifera Abel.)为我国特有木本油料植物，广泛分布于我国秦岭、淮河以南的14个省，与橄榄、油棕、椰子统称为世界四大木本食用油源树种，是茶油、茶壳、茶枯、茶根等多种产品的原料，其中茶油能有效改善心脑血管疾病、降低胆固醇、抑制甘油三脂的升高，是一种纯天然保健食用油，具有很高的食用和医药价值。炭疽菌属真菌是一类主要分布在在热带、亚热带地区的全球性分布的植物病原菌，能侵染并引起禾本科、果树、花卉、蔬菜等600多种植物的炭疽病，导致很大的经济损失。由炭疽菌侵染引起的油茶炭疽病的是油茶主要的病害之一，严重制约着油茶产业的发展。随着油茶产业的兴起，国内各地频繁的引种，和对化学药剂的无节制的滥用，致使该类病原菌的生理小种变异加快，已导致了严重的抗药性，而原有的抗炭疽病油茶品种也逐渐丧失了抗性，给炭疽病的防治带来了极大的难度。
转录因子(TF)，是一种DNA结合蛋白，它能与顺式作用元件发生特异性相互作用，从而影响下游一系列基因的转录。当植物在遭遇病原菌胁迫时，会激起多种防御机制来抵御不良环境，产生一系列的信息传递，使植物细胞对胁迫做出响应，提高植物抗病性。WRKY转录因子在植物中能参与许多的信号转导途径，在对生物胁迫应答中有着重要的调控作用。
WRKY转录因子自被发现以来，一直都是植物防卫反应研究的热点，在拟南芥、烟草、水稻等模式植物中，参与抗病相关信号转导途径相关的WRKY成员已被深入研究。对于油茶抗病相关的WRKY转录因子的克隆与功能研究目前还鲜有报道，尤其是油茶与炭疽病互作相关的研究还未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用，利用诱导转录因子CoWRKY3培养抗炭疽病品种的转基因农作物，对提高农作物抗病性具有重要意义。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用，其中诱导转录因子CoWRKY3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用包括诱导转录因子CoWRKY3编码的蛋白质在提高植物抗炭疽病能力的应用。
进一步的，由上述诱导转录因子CoWRKY3编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，扩增上述诱导转录因子CoWRKY3的引物其正向引物核苷酸序列如SEQID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，上述诱导转录因子CoWRKY3的过表达载体构建引物其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明与现有技术相比的有益效果是：CoWRKY3基因对培育抗炭疽病品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义；从炭疽病菌处理后植物表型可以看出，野生型植株叶片发病严重，病斑面积大于转基因植株，而转基因植株抗病性明显增强，可见在烟草种异源表达CoWRKY3基因明显提高了植株对炭疽病菌的抗性。因此，本发明首次提出，并验证了CoWRKY3基因在烟草中的抗炭疽病的功能，丰富了培育强抗病性作物的基因资源。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
图1CoWRKY3基因保守结构域示意图；
图2CoWRKY3基因的系统发育树示意图；
图3转基因烟草PCR检测图；
图4CoWRKY3在沉默植物和对照植物中的表达水平分析图；
图5植株抗病性表型分析图；
图6病原菌处理后各植株过氧化物酶(POD)活性分析图；
图7病原菌处理后各植株超氧化物歧化酶(SOD)活性分析图；
图8病原菌处理后各植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。
实施例1
油茶CoWRKY3基因的克隆
从油茶民玉2号品种树上采取新鲜叶片后在液氮下保存，进行RNA提取。总RNA提取步骤如下：
S1.在液氮预冷的研钵中研磨油茶样品，在研钵中不断续加液氮防止样品融化；
S2.将研磨好的样品加入到装有1mL TRIZOL的1.5mL无菌无酶离心管中，边加边称量，取样量为50-60mg，充分匀浆，室温静置5min；
S3.加入200μL氯仿，混匀，4℃，12000g离心15min；
S4.取上清液500μL加入到新离心管中，加入200μL氯仿，混匀，4℃，12000g离心15min；
S5.取上清液约500μL加入到新离心管中(如果沉淀依旧过多，可以再抽提一次)，加入500μL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；
S6.4℃，12000g离心10min；
S7.弃上清，加入1mL 75％的乙醇(DEPC水配置)上轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g离心5min，弃上清；
S8.将管壁液体甩到管底，用移液器将液体去干净，通风橱中晾10-20min；
S9.加入适量的DEPC H2O溶解沉淀(65℃促溶10-15min)。
按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara,中国大连)中所述方法反转录成cDNA，以上述cDNA为模板设计设计下述表1引物进行扩增。
表1CoWRKY3基因的PCR引物序列(SEQ ID NO.3)
在PCR管中配制下列混合液，反应体系如下表2所示：
表2PCR反应体系
轻轻混匀后离心，将各小管置于PCR仪上，设置反应程序为：94℃5min，1个cycle；94℃30s，55℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃10min，1个cycle；产物于-20℃保存。
实施例2
pMD 19T-CoWRKY3克隆载体的构建
CoWRKY3基因PCR产物回收纯化
S1.使用北京天根生化科技公司的TIANgel Maxi Purification Kit对CoWRKY3基因的PCR产物进行回收纯化，将回收纯化的目的片段稀释成50ng/μL，参照pMD 19T使用说明，构建下列表3所述连接体系：
表3PCR产物回收纯化连接体系
用移液枪轻柔混合均匀后，16℃连接12h。
CoWRKY3的序列分析
S2.使用生物信息学方法对其进行分析从NCBI数据库中检索CoWRKY3的同源序列，CoWRKY3基因含有一个1566bp开放阅读框并且编码522个氨基酸，并分析保守结构域(图1)。CoWRKY3分子式为C2478H3915N723O809S17，分子量为57.3247(kDa)，预测的等电点理论值6.53，是酸性蛋白；在组成该蛋白的所有氨基酸中，Ser所占比例最高，占总数的11.9％；总带正电残基(Arg+Lys)的数量为55，总的带负电残基(Asp+Glu)的数量为59；不稳定系数为57.87，表明CoWRKY3为不稳定蛋白(不稳定蛋白:系数>40；稳定蛋白:系数<40)。利用BlastP下载与油茶CoWRKY3蛋白序列相似的序列，利用软件BioEdit将油茶CoWRKY3与其它植物的蛋白序列进行多序列比对，采用MEGA7软件和bootstrap构建和分析系统发育树(图2)，以评估其统计学可靠性。
实施例3
过表达载体pCAMBIA1300-CoWRKY3的构建
(1)pCAMBIA1300-mCherry质粒的提取与酶切
挑取于-80℃保存的含pCAMBIA1300-mCherry质粒的大肠杆菌DH5α并涂布于含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。挑取正常生长的单菌落溶于含有10μL无菌水200μL tube中，充分悬浮菌体，取5μL进行菌落PCR检测，将剩余的5mL菌悬液加入到含50mg/L Kan的液体LB培养基中，在37℃条件下200r/min振荡培养14～16h。
(2)目的片段与pCAMBIA1300-mCherry载体的连接
将酶切后的pCAMBIA1300-mCherry质粒与酶切后于-20℃保存的pMD 19T-CoWRKY3切胶回收基因片段以及pCAMBIA1300-mCherry载体框架。根据表达载体酶切位点和基因的编码区序列设计下述表4引物(扩增引物分别带SacⅠ和BamHⅠ然后连入pMD 19-T-Simple)进行扩增。
表4CoWRKY3的过表达载体构建引物序列(SEQ ID NO.4)
说明：粗体为保护碱基，下划线分别为Sac I和BamH I酶切位点
将回收纯化的目的片段稀释成50ng/μL，连接过表达载体pCAMBIA1300-mCherry时，用Sac I和BamH I酶切T载和表达载体后，用T4连接酶进行目的基因与载体框架的连接，按列表5所述反应体系反应：
表5目的基因与载体连接反应体系
用移液枪轻柔混合均匀后16℃连接14h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α在抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定。
实施例4
农杆菌的转化
(1)农杆菌GV3101感受态的制备
①挑取于-80℃保存的农杆菌GV3101，并涂布于含100mg/L Rif和100mg/LStr的YEB固体培养基上，28℃条件下倒置培养18-20h；
②挑取正常生长的单菌落，接种至10mL含100mg/L Rif、100mg/L Str和50mg/LKan的液体YEB培养基中在28℃条件下200r/min振荡培养18h；
③取上述活化后的菌液0.5mL接种至含50mL YEB液体培养基的500mL锥形瓶中，在28℃条件下200r/min充分振荡培养至菌液OD600值为0.5；
④将菌液转移至50mL聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min，在4℃条件下4000r/min离心5min收集菌体沉淀；
⑤弃上清液，用4mL 20mmol/L新配置的CaCl2轻柔的重悬菌体，在4℃条件下4000r/min离心5min收集菌体沉淀。
⑥弃上清液，用2mL 20mmol/L CaCl2轻柔的重悬菌体，按每管100μL分装至冰上预冷的1.5mL tube中，菌体直接用于转化。
(2)农杆菌GV3101的转化与阳性菌株的筛选
①取1μL重组载体pCAMBIA1300-mCherry-CoWRKY3加入GV3101感受态tube中，并于冰上静置30min；
②将tube置于浮漂上于液氮中速冻5min，随后立即取出并放入水浴锅中37℃热激5min；
③向热激后的感受态细胞中加入900μL预热至37℃的YEB液体培养基，在37℃条件下200r/min振荡培养2h后4000r/min离心5min；
④弃800μL上清液，将剩余液体和菌体沉淀充分重悬后涂布于含YEB固体筛选培养基上(100mg/L Rif+100mg/L Str+50mg/L Kan)，在28℃条件下倒置培养40-48h；挑取在YEB固体筛选培养基上正常生长的单菌落进行菌落PCR鉴定。
实施例5
烟草转化
S1.烟草苗脱毒
在超净工作台上，先将烟草种子置于75％的乙醇中漂洗30s，然后移入含3％次氯酸钠溶液的烧杯中浸泡10分钟，浸泡结束后立即倒掉溶液并用无菌水充分漂洗种子4次，随后播种于含MS固体培养基的无菌培养皿上，用封口膜密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养2周；待烟草出苗后，单株移入含MS固体培养基的无菌组培瓶中培养3周。
S2.烟草苗预培养
在超净工作台上，将烟草叶片去叶柄，划伤边缘及叶表面并剪成1cm×1cm大小后置于含MS预培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH6.0)的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养2d。
S3.农杆菌侵染液的制备
分别将含有CoWRKY3基因重组表达载体的农杆菌GV3101菌液加入到的YEB液体筛选培养基中，在28℃条件下200r/min摇床充分振荡培养18h用于活化菌种。随后取1mL活化后的农杆菌菌液转入50mL无抗生素的YEB液体培养基中，在28℃条件下200r/min摇床充分振荡培养至OD600值为0.5时用于侵染烟草叶片。
S4.共培养
将预培养后的叶片放入侵染液中，在100r/min条件下摇床振荡培养5min后立即取出并除净残液，然后置于含MS预培养基的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下黑暗共培养2-3d，在叶片切口处有微小菌斑出现即可。
S5.转化苗的筛选
将共培养烟草叶片置入含500mg/L Car的无菌水的烧杯中轻柔漂洗直至无絮状菌丝出现，随后用无菌滤纸吸干叶表面残余液体并置于含筛选培养基(MS培养基+500mg/LCar+50mg/L Kan，Ph6.0)的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养至分化出苗。
S6.继代和生根培养
选择生长点完好且在抗生素培养基上生长状态良好的芽，将其完整切下后移入1/2MS培养基中(1/2MS培养基+300mg/L Car+50mg/L Kan，pH5.8)进行生根培养，3周后重新剪切生长点进行继代培养。
S7.转化烟草的分子检测
参照天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒方法提取未转化的野生型烟草(WT)和Kan筛选后的转化烟草的叶片基因组DNA，以上述基因组DNA为模板，利用油茶CoWRKY3基因特异性引物进行扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳验证目的条带大小，有3个转基因株系扩增出与目的基因大小相同的条带，而WT植株无扩增条带，如图3所示，表明CoWRKY3基因已成功地转入烟草。根据图4表达量选择表达量高的2个株系进行抗性分析。
上述实施例获得的转CoWRKY3基因烟草的生理分析；
转基因烟草抗病性鉴定；
选取生长状态基本一致，健康、无伤的烟草植株进行喷施接种，接种孢子浓度为106个/mL，喷施后移至相对湿度为100％人工气候箱，在28℃条件下黑暗培养2d，随后8h光照/16h黑暗培养5d，期间每隔12h喷水保湿1次；接种7d后剪取叶片，根据总病斑面积大小统计病情。
在烟草叶片侵染前后分别测定野生型和转基因烟草植株中的过氧化物酶(POD)，超氧化物歧化酶(SOD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。
(1)POD活性测定：
①选择病原菌侵染前后的烟草叶片，用ddH2O冲洗叶片；将同一部位的叶片组织剪成0.1g并置于液氮预冷研钵中，加入1mL的磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)，冰浴研磨成匀浆；
②将匀浆全部转移到转移至1.5mL的tube中，4℃条件下12000r/min离心10min；
③取20μL上清酶液移至新的tube中，依次加入200μL 2％H2O2、580μL磷酸缓冲液和200μL愈创木酚，在酶标仪上470nm处测定OD值，每次测量间隔30s，以每min内△OD470值为0.01为一个酶活单位表示。按照POD活性(U/g FW)＝(△OD470×V)/(W×a×0.01×t)，△OD470为反应时间内OD值的变化，V为上清酶液体积，W为样品重量，t为反应时间。以接种前WT为1值，其它组的相对POD活性＝POD其它组/PODWT。
(2)SOD活性测定：
①选择C.destructivum侵染前后的烟草叶片，用ddH2O冲洗叶片；将同一部位的叶片组织剪成0.1g并置于液氮预冷研钵中，加入1mL的磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)，冰浴研磨成匀浆；
②将匀浆全部转移到转移至1.5mL的tube中，4℃条件下12000r/min离心10min；
③分别取1.5mLtube作为测试管与对照管，按顺序加入500μL 0.05mol/L磷酸缓冲溶液、100μL 130mmol/L甲硫氨酸溶液、100μL 750μmol/LNBT溶液、100μL 100μmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液、100μL20μmol/L核黄素溶液、80μLddH2O，向测定管中加入20μL酶提取液，而对照管用配置所用缓冲溶液代替。
④于日光灯下静置20min，然后立即避光，以对照管为0值，在酶标仪上测定560nm处的OD值；以抑制NBT光还原的50％为一个酶活单位，表示，按照SOD活性(U/g FW)＝(△OD470CK-△OD470)×V/(△OD470CK×W×a×0.05)计算；△OD470CK为对照管变化值，△OD470为测定管变化值，V为上清酶液体积，a为取用酶体积，W为样品重量。以接种前WT为1值，其它组的相对SOD活性＝SOD其它组/SODWT。
(3)PAL活性测定：
①剪取烟草炭疽菌处理前后烟草植株的同一部位的叶片，用ddH2O洗净叶表面；将同一部位的叶片组织剪成0.1g并置于液氮预冷研钵中，加入1mL的巯基乙醇(2mmol/L)-硼酸(0.1mol/L，pH8.8)缓冲液和少量聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成匀浆；
②将匀浆全部转移到转移至1.5mL的tube中，4℃条件下12000r/min离心10min；
③取250μL上清酶液移至新的tube中，依次加入250μL0.02 mol/L苯丙氨酸溶液和500μL蒸馏水并均匀混合，30℃条件下水浴1h后测定290nm处OD值；以每1h△OD290值为0.01为一个酶活单位，PAL活性(U/g FW)＝(△OD290×V)/(W×a×0.01×t)，△OD290为反应时间内OD值的变化，V为上清酶液体积，W为样品重量，t为反应时间。以接种前WT为1值，其它组的相对PAL活性＝PAL其它组/PALWT。
活体喷撒接种7d后，根据病斑面积结果表明，WT烟草叶片发病严重，多为扩展性病斑，病健交界处明显变黄，叶片轻微皱缩，其相对病斑面积较大，转CoWRKY3株系发病较轻，多为局限性病斑，病斑面积较小(图5)。
POD、SOD是植物抗氧化系统中重要的保护酶，可以清除过多的ROS减少对细胞的损害。PAL与木质素、植保素以及酚类化合物的合成密切相关，对于植物抗病具有重要意义。分析结果表明：处理前，WT与转基因株系之间的POD、SOD和PAL无明显差异。处理后三种防御酶活性均有不同程度的提高，且存在明显差异。转基因植株在处理后，三种防御酶的活性均高于其它株系(图6，7，8)。根据病原菌处理前后的生理值的变化并结合发病情况可以看出，三种防御酶活性的与烟草抗病能力有着密切关系，CoWRKY3可能通过改变POD、SOD和PAL的活性从而调控烟草对炭疽病的抗性。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (5)
1.诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用，其特征在于，诱导转录因子CoWRKY3核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的诱导转录因子CoWRKY3在植物抗炭疽病中的应用，其特征在于，包括诱导转录因子CoWRKY3编码的蛋白质在提高植物抗炭疽病能力的应用。
3.如权利要求2所述的诱导转录因子CoWRKY3编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的诱导转录因子CoWRKY3的引物，其特征在于，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.如权利要求1所述的诱导转录因子CoWRKY3的过表达载体构建引物，其特征在于，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
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