CN116064586A - 一种番木瓜CpWRKY50基因及其提高番木瓜炭疽病抗性的用途 - Google Patents

一种番木瓜CpWRKY50基因及其提高番木瓜炭疽病抗性的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种番木瓜CpWRKY50基因，并进一步公开所述CpWRKY50基因在提高番木瓜炭疽病抗性领域中的应用。本发明方案首次克隆了番木瓜CpWRKY50基因，并通过瞬时过表达系统，在番木瓜采后果实中瞬时过表达CpWRKY50，进一步验证了该基因可显著增强番木瓜炭疽病抗性的用途及优势，同时利用转基因技术，在番茄中异源过表达CpWRKY50，进一步验证了CpWRKY50基因抗炭疽病的功能。所述番木瓜CpWRKY50基因可作为番木瓜炭疽病抗性改进的目标基因进行深入的研究，具有较高的应用及研究价值。

Description

一种番木瓜CpWRKY50基因及其提高番木瓜炭疽病抗性的用途
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种番木瓜CpWRKY50基因，并进一步公开所述CpWRKY50基因在提高番木瓜炭疽病抗性领域中的应用。
背景技术
番木瓜(Carica papaya L.)是世界第四大热带、亚热带畅销水果，也是我国岭南地区的特色水果，因其具有很高的营养价值和药用价值而被世界卫生组织列为最有价值的十大水果之首，有“百益果王”的美誉。据《OECD-FAO农业展望报告2020-2029》预测，在未来十年内，世界番木瓜产量预计将以每年2.1％的速度增长，预计到2029年将达到1660万吨，发展前景十分广阔。
但是，由于采摘后的番木瓜，其果实极不耐贮运、易腐烂且货架期短，严重影响了番木瓜的运输及销售。据报道，导致番木瓜果实腐烂的主要致病菌是炭疽菌(Colletotrichum sp.)。在发展中国家，由炭疽菌引起的炭疽病导致的番木瓜采后商品果损失率可高达到40％-100％。因此，对炭疽病的防治成为番木瓜产业发展中的重点任务之一。
目前，传统防治番木瓜采后炭疽病的主要方法包括施用杀菌剂、化学试剂清洗消毒、热处理或精油处理等理化方法。但是，由于炭疽菌在番木瓜田间果实成熟前就已经完成侵染潜伏，这些果实采摘后的防治措施无法达到标本兼治的目的，效果并不理想。因此，如何利用现有抗/耐病番木瓜资源，通过筛选抗病基因，并利用分子育种手段创制番木瓜抗炭疽病品种，提高番木瓜果实自身的抗性，进而防止炭疽菌侵染被认为是解决番木瓜炭疽病危害问题最根本的方法。
在植物中，WRKY转录因子参与植物对生物和非生物胁迫的应答，以参与对真菌、细菌和病毒病原体侵染等生物胁迫的应答为主。例如，在与真菌的应答反应中，拟南芥AtWRKY33能够通过JA信号途径调控植株对灰霉菌(Botrytis cinerea)的抗性。水稻OsWRKY31和OsWRKY22对稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病抗性反应起关键作用。苹果MdWRKY75e和MdWRKY100分别参与对链格孢菌(Alternaria alternate)和炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的防御反应。草莓FaWRKY1负向调控果实对炭疽病菌(C.acutatum)的抗性。在与细菌的应答反应中，拟南芥AtWRKY07、AtWRKY11和AtWRKY17、AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60、AtWRKY38和AtWRKY62、番茄SlWRKY39以及青蒿AaWRKY17，分别通过不同的调控途径，参与对能够引起植物广泛病害的丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的应答反应。目前，关于植物WRKY与病毒互作的研究主要集中在烟草花叶病毒TMV(Tobacco mosaic virus)上，如拟南芥AtWRKY8、辣椒CaWRKYd和CaWRKYb都参与了对TMV的应答反应。综上，WRKY转录因子与植物应答病原的相关研究很多，但类似研究在番木瓜上很少，且研究大多数仅限于病毒(PRSV和PMeV)诱导番木瓜WRKY基因的表达分析。鉴于该基因家族在其它作物抗炭疽病等真菌病害过程中的重要作用，而其在饱受炭疽病之害的番木瓜中的作用人们又知之甚少，因此，很有必要对其进行深入研究，以探明其利用价值。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种番木瓜CpWRKY50基因，并进一步通过瞬时过表达系统验证，在番木瓜采后果实中瞬时过表达CpWRKY50，可显著增强番木瓜炭疽病抗性；同时，利用转基因技术，在番茄中异源过表达CpWRKY50，进一步验证了CpWRKY50基因抗炭疽病的功能；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述番木瓜CpWRKY50基因在番木瓜育种改良领域，尤其是提高番木瓜炭疽病抗性领域的应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种番木瓜CpWRKY50基因，所述基因的CDS区包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还公开了一种由所述番木瓜CpWRKY50基因编码的番木瓜CpWRKY50蛋白，所述蛋白包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明还公开了一种含有所述番木瓜CpWRKY50基因的瞬时过表达载体，所述瞬时过表达载体为pRI101-AN-CpWRKY50。
本发明还公开了一种构建所述瞬时过表达载体的方法，包括克隆CpWRKY50基因的步骤，以及，将回收产物与pRI101-AN载体相连接的步骤，构建得到所需pRI101-AN-CpWRKY50瞬时过表达载体。
本发明还公开了一种含有所述番木瓜CpWRKY50基因的稳定过表达载体，所述稳定过表达载体为p2301-35SN-GFP-CpWRKY50。
本发明还公开了一种构建所述稳定过表达载体的方法，包括克隆CpWRKY50基因的步骤，以及，将回收产物与p2301-35SN-GFP载体相连接的步骤，构建得到所需p2301-35SN-GFP-CpWRKY50稳定过表达载体。
具体的，本发明还公开了一种构建所述表达载体的方法，具体包括如下步骤：
CpWRKY50基因的克隆：提取番木瓜叶片总RNA，并反转成cDNA，以此为模板，设计特异引物进行PCR扩增，回收产物连接中间载体pMD19-T，经转化、菌落PCR鉴定和测序，获得CpWRKY50基因CDS序列；
载体的构建：根据CpWRKY50编码序列，设计含Xba I和含KpnI酶切位点的特异引物，以cDNA为模板进行扩增，将回收产物与pRI101-AN载体分别经XbaⅠ、KpnⅠ酶切，回收后连接，构建得到pRI101-AN-CpWRKY50瞬时过表达载体；用XbaI和KpnI对过表达空载体p2301-35SN-GFP进行双酶切，之后利用同源重组(
Figure BDA0003919623630000031
II One Step Cloning Kit,Vazyme)法获得p2301-35SN-GFP-CpWRKY50过表达载体。
具体的，本发明提供了一种CpWRKY50基因瞬时过表达载体pRI101-AN-CpWRKY50，通过瞬时转化番木瓜采后果实，在CpWRKY50过表达的部位接种炭疽菌孢子，研究其生物学功能。首先，提取番木瓜叶片总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，设计特异引物，进行PCR扩增，将扩增产物跑胶回收，回收产物与pRI101-AN载体分别经XbaⅠ，KpnⅠ酶切，回收后连接，构建pRI101-AN-CpWRKY50瞬时过表达载体。
本发明还公开了一种含有所述番木瓜CpWRKY50基因、或者所述瞬时过表达载体、或者所述稳定过表达载体的重组菌。
本发明还公开了一种构建所述重组菌的方法，包括所述表达载体宿主菌株，以使所述载体在所述宿主中有效表达的步骤。
具体的，本发明提供了CpWRKY50基因稳定过表达载体p2301-35SN-GFP-CpWRKY50，利用农杆菌介导法，以番茄外植体为受体进行遗传转化，通过分子鉴定获得CpWRKY50稳定过表达番茄株系，然后对转基因株系番茄果实进行炭疽菌接种，研究其生物学功能。首先，提取番木瓜叶片总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，设计特异引物，进行PCR扩增，将扩增产物跑胶回收，将p2301-35SN-GFP载体分别经XbaⅠ、KpnⅠ酶切，利用同源重组试剂盒构建p2301-35SN-GFP-CpWRKY50过表达载体，将该载体转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落进行菌落PCR阳性检测，将PCR阳性菌液进行测序验证，进而将测序正确的质粒导入农杆菌感受态细胞EHA105中。
本发明还公开了一种由所述重组菌经稳定遗传表达得到的稳定作物株系。具体的，所述作物包括番木瓜株或番茄株。
本发明还公开了一种培育炭疽病高抗性番木瓜作物的方法，包括将所述番木瓜CpWRKY50基因转化入目的植物的步骤。
本发明还公开了所述番木瓜CpWRKY50基因在番木瓜育种改良领域的应用。
作为可以实现的方式，本发明提供了所述番木瓜CpWRKY50基因的瞬时过表达和异源表达功能，具体研究步骤如下：
(1)CpWRKY50基因的克隆：提取番木瓜叶片总RNA，反转成cDNA，设计特异引物，克隆获得CpWRKY50基因CDS序列；
(2)载体的构建：构建CpWRKY50基因瞬时过表达载体pRI101-AN-CpWRKY50，同时构建稳定过表达载体p2301-35SN-GFP-CpWRKY50；
(3)工程菌制备：将构建好的pRI101-AN-CpWRKY50和p2301-35SN-GFP-CpWRKY50转化农杆菌EHA105，制备工程菌；
(4)CpWRKY50瞬时过表达及表型分析：将含有CpWRKY50过表达载体pRI101-AN-CpWRKY50的农杆菌注入番木瓜采后果实，3天后检测CpWRKY50的表达情况，发现CpWRKY50表达量明显升高，然后在过表达部位针刺接种炭疽菌悬浮孢子，4天后，过表达处理部位接种后与接种前相比，无明显炭疽病症状，而空载体对照部位已经明显发病，并出现腐烂，验证CpWRKY50功能；
(5)番茄遗传转化及表型(CpWRKY50稳定过表达载体)分析：将制备好的p2301-35SN-GFP-CpWRKY50工程菌，利用番茄外植体进行遗传转化，利用分子鉴定获得CpWRKY50过表达稳定株系。分别在野生型和3个过表达株系果实上利用针刺法接种炭疽菌悬浮孢子，4天后，过表达果实接种后与接种前相比无明显炭疽病症状，而野生型对照已出现明显炭疽病病斑，进一步验证CpWRKY50功能。
本发明方案基于对番木瓜WRKY家族基因对炭疽菌侵染的响应进行了初步研究，惊喜的发现了在抗性品种中诱导表达水平最高且在易感品种中表达水平基本不变的CpWRKY50基因，并进一步通过对该基因的深入研究，首次克隆了番木瓜CpWRKY50基因，并通过瞬时过表达系统，在番木瓜采后果实中瞬时过表达CpWRKY50，进一步验证了该基因可显著增强番木瓜炭疽病抗性的用途及优势，同时利用转基因技术，在番茄中异源过表达CpWRKY50，进一步验证了CpWRKY50基因抗炭疽病的功能。本发明方案有效克服了现有技术中WRKY基因家族在饱受炭疽病之害的番木瓜中研究甚少的空白，所述番木瓜CpWRKY50基因可作为番木瓜炭疽病抗性改进的目标基因进行深入的研究，具有较高的应用及研究价值。
本发明方案首次从番木瓜叶片中分离获得CpWRKY50基因，通过构建CpWRKY50瞬时过表达载体和CpWRKY50稳定过表达载体，分别瞬时转化番木瓜采后果实和转化番茄外植体，实现了CpWRKY50基因在番木瓜果实中瞬时过表达和在番茄中的异源过表达，并通过针刺接种炭疽菌进行表型分析，明确了CpWRKY50基因在番木瓜抗炭疽病过程中的作用，为番木瓜抗病调控网络提供了新的基因资源，为番木瓜抗病分子遗传育种研究提供了理论依据。
本发明方案通过分离并获得了番木瓜CpWRKY50基因CDS序列，首次利用农杆菌介导法，成功地将CpWRKY50基因在番木瓜采后果实中瞬时过表达，同时将该基因在番茄中过表达，获得了CpWRKY50稳定过表达番茄转基因株系，进而利用两种材料进行炭疽菌接种，通过表型分析，明确了CpWRKY50基因过表达可显著增强番木瓜和番茄果实对炭疽病的抗性，揭示了CpWRKY50在番木瓜抗炭疽病中的功能。本发明方案进一步为利用瞬时表达和转基因异源表达技术研究番木瓜基因功能提供了依据，为研究和丰富番木瓜抗病途径提供了新的基因资源。
本发明所述构建方法中，应用的基因瞬时表达技术步骤简单，方法有效，可有效缩短研究基因功能的时间，而基因异源表达可以在不容易实现转基因的物种基因功能研究中发挥重要作用，对揭示番木瓜基因的功能、分子育种等具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为CpWRKY50的克隆及其编码蛋白的结构；其中，A：PCR扩增CpWRKY50的琼脂糖凝胶电泳图；B：CpWRKY50蛋白结构示意图；C：CpWRKY50与其他8个物种WRKY50蛋白序列的同源比较和结构域分析；绿色框为七肽(WRKYGQK)结构域，橙色框内为C2H2锌指结构域；
图2为CpWRKY50与其他11个物种中同源WRKY蛋白的进化树分析；
图3为CpWRKY50瞬时过表达载体的构建及鉴定；其中，A：转化DH5α感受态细胞后的菌落PCR鉴定；B：pRI101-CpWRKY50质粒双酶切鉴定；C：转化EHA105感受态细胞后的菌落PCR鉴定；
图4为CpWRKY50瞬时过表达表型分析及CpWRKY50表达量变化；其中，A：CpWRKY50瞬时过表达果实接菌0d(pRI101-CpWRKY50瞬转后3d)和接菌4d(pRI101-CpWRKY50瞬转后7d)后的表型，每个果实两个处理：空载体对照和pRI101-CpWRKY50(CpWRKY50过表达)侵染，每个处理的中间3个小孔为空载体对照侵染液或CpWRKY50过表达转化载体侵染液注射点，外侧6个孔为炭疽菌孢子接种点；B.CpWRKY50过表达载体、空载体瞬转3d后的CpWRKY50表达量变化；
图5为CpWRKY50稳定过表达载体的构建及鉴定；其中，A：转化DH5α感受态细胞后的菌落PCR鉴定；B：p2301-35SN-GFP-CpWRKY50质粒双酶切鉴定；C：转化EHA105感受态细胞后的菌落PCR鉴定；
图6为番茄CpWRKY50过表达稳定植株获得过程；其中，A：番茄外植体；B：外植体预培养：C：共培养；D.再生抗性芽，E.生根形成抗性苗；
图7为番茄稳定过表达CpWRKY50植株的鉴定及接种炭疽菌后的表型分析；其中，A.RT-PCR方法检测5个过表达株系中CpWRKY50的表达情况，M：D2000；B.非转基因番茄和CpWRKY50过表达OE1、OE2和OE3转基因番茄针刺法接种后的表型分析；每个基因型番茄果实左侧接种ddH2O作对照，右侧接种炭疽菌孢子，白色箭头指示炭疽病菌斑，Bar＝5mm。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明。
本发明下述实施例中，涉及的材料包括：
番木瓜实验材料采用常规种植与田间管理，番茄材料为Micro-TOM；
试验所用引物及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；
XbaⅠ，KpnⅠ购置于NEB公司；
高保真酶、T4 DNA ligase购置于TaKaRa工程有限公司；
大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α、重组试剂盒EasyGenoDNA重组体系购置于天根生物科技(北京)有限公司；
其余分子试剂主要购置于天根生化科技(北京)有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司；
农杆菌感受态细胞EHA105购自北京华越洋生物有限公司。
实施例1CpWRKY50基因CDS区的克隆及生物信息学分析
参考NCBI网站番木瓜CpWRKY50序列，利用Primer Premier 5.0设计引物CpWRKY50-F/CpWRKY50-R(见下表1)。利用Trizol法提取番木瓜叶片总RNA，并用DNaseI(Takara，日本)去除总RNA中基因组DNA污染，用PrimeScripffM II 1st Strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒(Takara，日本)将提取的总RNA反转录成单链的cDNA。
以cDNA为模板，以CpWRKY50-F/CpWRKY50-R为引物，进行编码序列CDS克隆，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统(Bio-Rad)检测和记录结果(见附图1中A)。将PCR产物回收连pMD19-T，转化DH5α感受态细胞，挑单菌落进行菌落PCR，将阳性菌送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得CpWRKY50的CDS序列，序列大小为540bp，确定CpWRKY50基因CDS序列，详见SEQ ID No.1所示序列。
表1实验所用的克隆、鉴定及荧光实时定量(qRT-PCR)引物
引物名(Primers) 引物序列(Sequence)
CpWRKY50-F 5'-ATGTCTAGTTCTACTGAT-3'
CpWRKY50-R 5'-CTAACAAGTGGTTCGATG-3'
CpWRKY50-F1 <![CDATA[5'-GC<u>TCTAGA</u>ATGTCTAGTTCTACTGAT-3']]>
CpWRKY50-R1 <![CDATA[5'-GG<u>GGTACC</u>CTAACAAGTGGTTCGATG-3']]>
M13F 5'-TGTAAAACGACGGCCAG-3'
M13R 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'
CpWRKY50-F2 <![CDATA[5'-GAGAACACGGGGGAC<u>TCTAGA</u>ATGTCTAGTTCTACTGATAG-3']]>
CpWRKY50-R2 <![CDATA[5'-GCCCTTGCTCACCAT<u>GGTACC</u>ACAAGTGGTTCGATGATTGTG-3']]>
qCpWRKY50-F 5'-GAAGATGAATGGGTTAGGGTAGAA-3'
qCpWRKY50-R 5'-GGTTGAGTTGGGATGTGAAGA-3'
实施例2CpWRKY50基因CDS区的生物信息学分析
利用ExPaSy(http://web.expasy.org/protparam/)分析CpWRKY50保守结构域及蛋白理化性质：CpWRKY50基因编码179个氨基酸，CpWRKY50理论分子量为20.77kD，理论等电点为5.98，不稳定指数为55.34，该蛋白含有27个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和25个碱性氨基酸残基(Lys+Arg)，脂肪族指数为57.65，平均亲水性(GRAVY)为-0.872，说明CpWRKY50蛋白是一个亲水不稳定蛋白。根据SMART网站(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)蛋白结构预测显示，CpWRKY50含有一个典型的WRKY结构域(包含七肽WRKYGQK保守域和C2H2锌指结构)，位于氨基酸序列的第118-177位，属于ⅡC类WRKY家族转录因子(见图1中B)。
通过NCBI中BLASTP工具查找CpWRKY50蛋白的同源氨基酸序列，发现CpWRKY50与拟南芥(拟南芥Arabidopsis thaliana(NP_197989.2)、麻风树(Jatropha curcas，XP_012077228.1)、猕猴桃(Actinidia rufa，GFY95533.1)、榴莲(Durio zibethinus，XP_022729973.1)、陆地棉(Gossypium hirsutum，XP_016754871.1)、木槿(Hibiscussyriacus，XP_039017063.1)、番樱桃(Syzygium oleosum，XP_030448549.1)和酸枣(Ziziphus jujuba，XP_015884439.1)的WRKY50的同源性较高，通过多重序列比对发现(见图1中C)，这些蛋白的WRKY结构域是高度保守的，其中(WRKYGQK)保守域氨基酸序列完全一致，C2H2型锌指结构也只存在个别氨基酸差异，说明CpWRKY50蛋白在不同植物中具有较高的保守性。
为进一步研究CpWRKY50在进化过程中与其他物种间的亲缘关系，从NCBI数据库下载与CpWRKY50同源的11个物种的WRKY蛋白氨基酸序列，进行进化树分析，结果如图2所示。由图2结果可知，CpWRKY50蛋白与麻风树JcWRKY50(XP_012077228.1)蛋白在同一分支上，亲缘关系最近。
实施例3CpWRKY50瞬时表达载体的构建及表型分析
CpWRKY50瞬时过表达载体的构建
根据CpWRKY50编码序列，设计含Xba I酶切位点的正向引物CpWRKY50-F1和含KpnI酶切位点的反向引物CpWRKY50-R1，以cDNA为模板进行扩增，跑胶回收，将回收产物和瞬时过表达载体pRI101分别利用限制性核酸内切酶Xba I和KpnI(TaKaRa)进行酶切并回收，之后连接，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落利用载体通用引物M13F/M13R进行菌落PCR(如图3中A所示)，将阳性菌落摇菌，送公司测序，测序正确后提取质粒，酶切鉴定(如图3中B)，获得瞬时过表达载体pRI101-CpWRKY50。
CpWRKY50瞬时过表达后的分子鉴定及表型分析
将含有CpWRKY50过表达载体(pRI101-CpWRKY50)和空载体(pRI101)质粒分别转农杆菌EHA105，并进行菌落PCR鉴定(见图3中C)，挑取阳性单菌落制备工程菌，分别将含有CpWRKY50过表达载体(pRI101-CpWRKY50)和空载体(pRI101)的工程菌注入番木瓜采后果实，设计荧光实时定量引物qCpWRKY50-F/qCpWRKY50-R，3天后利用qRT-PCR检测CpWRKY50的表达情况，发现注射了过表达载体pRI101-CpWRKY50的果实部位CpWRKY50表达量明显升高(见图4中A)，然后在空载体和过表达部位分别针刺接种炭疽菌悬浮孢子，观察表型，发现4天后，过表达处理部位接种后与接种前相比，无明显炭疽病症状，而空载体对照部位已经明显发病，并出现腐烂(见图4中B)。
实施例4CpWRKY50异源过表达载体的构建及表型分析
CpWRKY50异源过表达载体的构建
根据CpWRKY50编码序列，设计含XbaI酶切位点的正向引物CpWRKY50-F2和含KpnI酶切位点的反向引物CpWRKY50-R2，用限制性核酸内切酶XbaI和KpnI(TaKaRa)对过表达空载体p2301-35SN-GFP进行双酶切，之后进行同源重组(
Figure BDA0003919623630000111
II One StepCloning Kit,Vazyme)，转化Top10大肠杆菌感受态，利用特异引物CpWRKY50-F/CpWRKY50-R进行菌落PCR鉴定(见图5中A)，挑选阳性克隆提取质粒，酶切鉴定(见图5中B)后，获得重组的过表达载体p2301-35SN-GFP-CpWRKY50。
CpWRKY50异源过表达株系的分子鉴定
将番茄(Micro-TOM)真叶切去叶尖、叶柄，其余部分切成0.5cm×0.5cm大小的叶块水平放置于预培养基上，每皿15-20片，预培养1天。同时，将获得的测序正确的p2301-35SN-GFP-CpWRKY50质粒转化农杆菌EHA105，利用特异引物CpWRKY50-F/CpWRKY50-R进行菌落PCR鉴定(见图5中C)挑取阳性菌落过夜培养，调节菌液OD600＝0.5。
将外植体取出，在农杆菌中转化30min，取出外植体在无菌纸上吸干，重新放入预培养基中，共培养1-2天。之后，将经共培养的外植体转接入筛选培养基中进行筛选，获得抗性愈伤组织和不定芽，将带有芽原基的愈伤切成小片，并转移到茎伸长培养基上进行继代，不定芽长至1cm左右时，选择生长健康的再生幼芽，转接到生根培养基上培养，获得抗性再生植株(见图6)。
分别将获得的5株抗性再生植株和未转化的野生型番茄植株提取RNA，并反转录为cDNA，使用引物CpWRKY50-F/CpWRKY50-R进行扩增，野生型为对照，利用RT-PCR方法检测5株抗性再生植株中CpWRKY50的表达。能扩增出目的片段条带的植株即为CpWRKY50异源过表达稳定植株。结果如图7中A所示，5个株系都能检测到目的条带，其中OE1和OE3中的表达量更强。
CpWRKY50异源过表达株系的表型分析
制备浓度为106/L的炭疽菌悬浮孢子，分别在野生型和3个过表达番茄株系(OE1、OE2和OE3)果实上利用针刺法接种炭疽菌孢子，同时已接种ddH2O为对照，观察表型，结果如图7中B所示，接菌4天后，过表达果实接种后与接种前相比无明显炭疽病症状，而对照已经出现明显炭疽病病斑，证明本发明基于番木瓜CpWRKY50基因进行番木瓜炭疽病抗性改进的方式，可以显著提高番木瓜果实的炭疽病抗性，具有较高的应用及研究价值。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种番木瓜CpWRKY50基因，其特征在于，所述基因的CDS区包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种由权利要求1所述番木瓜CpWRKY50基因编码的番木瓜CpWRKY50蛋白，其特征在于，所述蛋白包括如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述番木瓜CpWRKY50基因的瞬时过表达载体，其特征在于，所述瞬时过表达载体为pRI101-AN-CpWRKY50。
4.一种构建权利要求3所述瞬时过表达载体的方法，其特征在于，包括克隆CpWRKY50基因的步骤，以及，将回收产物与pRI101-AN载体相连接的步骤，构建得到所需pRI101-AN-CpWRKY50瞬时过表达载体。
5.一种含有权利要求1所述番木瓜CpWRKY50基因的稳定过表达载体，其特征在于，所述稳定过表达载体为p2301-35SN-GFP-CpWRKY50。
6.一种构建权利要求5所述稳定过表达载体的方法，其特征在于，包括克隆CpWRKY50基因的步骤，以及，将回收产物与p2301-35SN-GFP载体相连接的步骤，构建得到所需p2301-35SN-GFP-CpWRKY50稳定过表达载体。
7.一种含有权利要求1所述番木瓜CpWRKY50基因、或者权利要求3所述瞬时过表达载体、或者权利要求5所述稳定过表达载体的重组菌。
8.一种由权利要求7所述重组菌经稳定遗传表达得到的稳定作物株系。
9.一种培育炭疽病高抗性番木瓜作物的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述番木瓜CpWRKY50基因转化入目的植物的步骤。
10.权利要求1所述番木瓜CpWRKY50基因在番木瓜育种改良领域的应用。
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