CN115992153A - 小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS、其编码蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS、其编码蛋白及应用，旨在解决小麦茎基腐病抗性基因缺乏的技术问题。本发明申请首次公开并确认了一个新的小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS，如序列表SEQ ID NO.3所示，其长度为2193bp；其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，其长度为730；构建了基因表达载体和制备了重组菌。通过转基因技术证实TaP5CS的小麦茎基腐病抗性功能。该性状基因TaP5CS能够应用于小麦抗病育种及基腐病防治；该基因的研究发现有助于揭示小麦茎腐病的分子遗传基础，为小麦抗病育种提供了重要而独特的基因资源。

Description

小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS、其编码蛋白及应用

技术领域

本申请涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS、其编码蛋白及应用。

背景技术

小麦是全球广泛种植的最重要粮食作物之一，是世界上40%人口的主食来源。然而，近年来，由于各种极端天气的频繁出现，及耕地面积的不断减少，小麦的高产稳产遭到了重大影响；其中，小麦茎基腐病（Fusarium crown rot，FCR）发生广泛，在世界范围内造成了严重的小麦产量和品质损失。小麦茎基腐病是一种典型的真菌土传病害，由多种病原菌引起，会造成种子、幼苗、根冠、地下茎和茎基部组织腐烂，其表现症状主要为小麦茎基部变褐、变黑甚至腐烂枯死。发生过程中不但给小麦造成严重的产量损失和经济损失，还会产生严重影响食品安全和危害人畜健康的DON、NIV 等毒素和次级代谢物。

目前尚未鉴定出对此类病害高抗或者免疫的小麦品种，已发现的抗病品种大多只在某一个生育期表现抗病，且抗性普便较低。小麦茎基腐病是由微效多基因控制的一种潜在土传病害；当前，对小麦茎基腐病的研究多集中在育种材料的抗性鉴定和基因的初步定位上。首次报道的茎基腐病QTL来源于Kukri/Janz的DH群体，位于4B染色体上一个矮秆基因 Rht1附近。Poole等（2012）利用Sunco/Macon和Sunco/Otis群体进行了一系列温室和田间的实验，在多条染色体上检测到显著QTLs，如2B、3B、4B、4D和7A。目前，小麦A、B、D染色体上的QTL数量分别是7、25和11个，其中B、D染色体上较多。在这些QTLs位点中，能重复检测到的位点分别位于2DL、3BL、4B和5DS染色体上，其中3BL上效应最大。Yang等利用一套偃展1号导入系群体和一个DH双亲群体在4B染色体上定位并克隆了第一个小麦茎基腐病基因 TaDIR，此基因能显著负调控小麦茎基腐病抗性。

迄今为止，关于有重要应用价值的小麦茎基腐病抗性基因的报道不多见，因而进一步的抗病基因挖掘及有效利用迫在眉睫。通过借助组学技术发掘优良抗病基因，进而探究抗病基因的功能，能够促进小麦抗病分子机制的研究，对实现小麦茎基腐病的抗性育种具有重要的实际意义。

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本申请提供一种小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS、其编码蛋白及应用，旨在解决小麦茎基腐病抗性基因缺乏的技术问题，以为小麦抗病育种及茎基腐病防治提供更多的选择。

根据本公开的一个方面，筛选得到一种小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其长度为6238bp，含有20个外显子和19个内含子； TaP5CS基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其长度为2557bp； TaP5CS基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，为序列SEQ ID NO.2中自5'末端第152～2344位的脱氧核糖核苷酸，并编码如序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，氨基酸的个数为730。

根据本公开的另一个方面，提供了一种扩增上述基因的引物对，其全核苷酸序列如下所示：

TaP5CS-1F：5’- CCACTTGTTATCCCACGGTT -3’；

TaP5CS-1R：5’- TCACGGAACTAGATAGCGACA -3’；或

TaP5CS-2F：5’- ATGGGCAGGGGAGGCATCGG -3’；

TaP5CS-2R：5’- TCATTGCAAAGGAAGATCCT -3’。

根据本公开的另一个方面，提供了一种含有小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS的重组载体，例如将上述小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS插入LGY-OE3植物过表达载体中而成的；提供了所述表达载体构建的重组菌。使用上述基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记（GUS 基因、萤光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素、卡那霉素等）。

根据本公开的再一个方面，提供了一种含有如SEQ ID NO.3所示的DNA片段的过表达载体。

根据本公开的又一个方面，将所述小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS或所述重组菌应用在小麦抗病育种当中。

根据本公开的再一个方面，将所述小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS应用于促进小麦脯氨酸合成当中。

根据本公开的再一个方面，将所述小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS或所述蛋白应用在防治小麦茎基腐病当中。

根据本公开的再一个方面，提供一种提高小麦抗茎基腐病的方法，使所述小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS在小麦植株中过表达。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

对接种假禾谷镰刀菌 WZ-8A不同时间段（0h、24h、48h、72h、96h）的小麦茎基部的进行差异转录组研究，对响应小麦茎基腐的关键基因进行挖掘，克隆了一个多个时间点均响应小麦茎基腐的关键基因： TaP5CS；利用农杆菌介导的转化系统将携带有 TaP5CS的植物表达载体转化小麦幼胚，与对照相比，植株病情指数 (disease index, DI) 和菌丝量在过表达转基因株系显著下降，表明  TaP5CS 为小麦茎基腐病抗性基因。

本申请 TaP5CS基因有助于揭示小麦抗茎腐病的分子遗传基础，能够为小麦抗病育种提供重要而独特的基因资源，对小麦品种遗传改良具有重要意义。

附图说明

图1为本申请一实施例中 TaP5CS在小麦品种农优9号中接菌后不同时间段的茎基部的相对表达。

图2为本申请一实施例中LGY-OE3载体质粒图谱。

图3为本申请一实施例中 TaP5CS在其过表达株系（OE#5、OE#7和OE#8）与对照Fielder中的相对表达量图。

图4为本申请一实施例中 TaP5CS在其过表达株系（OE#5、OE#7和OE#8）与对照Fielder中的脯氨酸含量图。

图 5为本申请一实施例中过表达株系（OE#5、OE#7和OE#8）与对照Fielder接种假禾谷镰刀菌 WZ-8A后的表型图。

图6为本申请一实施例中过表达株系（OE#5、OE#7和OE#8）与对照Fielder接种假禾谷镰刀菌 WZ-8A后的病情指数和菌丝量图。

具体实施方式

为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂、载体等试验材料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的试验方法、检测方法等，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物合成及测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例一：小麦茎基腐病抗性基因 TaP5CS的获取

通过转录组测序进行小麦茎基腐病抗性基因的挖掘，具体如下：

1. 病原菌扩繁

试验所用菌株为假禾谷镰刀菌 WZ-8A（由河南农业大学植物保护学院病害研究室提供），是黄淮麦区当前流行的优势病原菌，具有侵染范围广和致病力强等显著特点。将保存的假禾谷镰刀菌取出，活化到 PDA 培养基上。扩繁时从新活化的假禾谷镰刀菌 PDA 培养板边缘挑取健康旺盛带菌丝的菌块接入灭菌的小米培养基中培养，培养条件为 25℃，7天。

2. 材料接种、培养及取样

参照Yang（2019）的方法。在 7cm× 7cm 小方盒中称入 150g 无菌土，表面均匀摆放 12 粒小麦品种农优9号，覆土 20g，每个处理三次重复，放入托盘，底部浇水浸透，置于16h/8h，25℃/15℃，湿度 60～80%的培养箱中培养。苗后 3 天，剔除弱势苗，在盒中接入0.4g 带菌小米，均匀铺满小盒并确保每株麦苗基部有一粒小米菌，培养条件同前，每 2d浇水一次。分别对接菌后0h、24h、48h、72h、96h的茎基部进行快速取样，液氮速冻，放入-80℃备用。-80℃保存的茎基部材料用于RNA的提取。

3. 小麦茎基腐病抗性基因挖掘

利用Illumina DNBSEQ-T7平台对不同接菌时间点的小麦茎基部进行转录组研究。转录水平共鉴定到132,570转录本，涉及到11，2964个基因。依据|log₂FC|>1 和FDR <0.05标准，以0h为对照，对24h、48h、72h、96h四个接菌时间点均响应的差异基因进行分析，共鉴定到53个基因。

本申请前期研究表明，外源喷施脯氨酸可以显著增强小麦茎基腐的抗性。利用转录组学中鉴定出一个四个接菌时间点均响应的差异基因：脯氨酸途径关键合成酶基因△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶 (Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase,  TaP5CS，中国春登录号：TraesCS3B02G395900)。荧光定量（qRT-PCR）结果显示，该基因在24h、48h、72h、96h四个接菌时间点的RNA水平表达量均上调，故将其作为目标基因。

在已公布的中国春参考序列基础上，对小麦农优9号中的 TaP5CS进行克隆，最终得到一个完整的开放阅读框。

具体步骤如下：

① DNA的提取：利用SLS法提取农优9号苗期的DNA。

② 总RNA提取及cDNA第一条链的合成：利用TRIZOL法分别提取小麦品种农优9号的总RNA。取2μLRNA在2%琼脂糖上电泳，检测RNA的完整性，发现提取的总RNA具有基本清晰的28S和18S的主带；紫外分光光度计检测OD260/OD280比值在1.80～2.00之间，OD260/OD230>2.0。取质量符合要求的总RNA，参照PrimeScript^TM RT Reagent Kit (perfect Realtime) 说明书进行cDNA第一条链的合成。

③  TaP5CS基因的克隆及序列分析

设计巢式PCR引物， TaP5CS-1F和 TaP5CS-1R分别设计在起始密码子ATG和终止密码子TGA两端； TaP5CS-2F和 TaP5CS-2R分别设计在起始密码子ATG和终止密码子TGA的位置，分别如下：

TaP5CS-1F：5’- CCACTTGTTATCCCACGGTT -3’；

TaP5CS-1R：5’- TCACGGAACTAGATAGCGACA -3’；

TaP5CS-2F：5’- ATGGGCAGGGGAGGCATCGG -3’；

TaP5CS-2R：5’- TCATTGCAAAGGAAGATCCT -3’。

以农优9号的DNA为模板，用 TaP5CS-1F和 TaP5CS-1R组成的引物对进行PCR扩增。PCR 反应液（50 μl 体系）：10×PCR Buffer （25 μl），ddH₂O (9 μl），dNTP（10μl）， TaP5CS-1F（1.5μl）， TaP5CS -1R（1.5μl），DNA（2μl）， TaKaRa LA Taq酶（1μl）；PCR参数：95℃5min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 5 min，共35个循环；再72℃ 10 min。PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳，回收后连接到PMD18-T载体（TAKARA），送生工进行测序。

用上述类似的方法再以农优9号的cDNA为模板，用 TaP5CS-1F和 TaP5CS-1R组成的引物对进行PCR扩增；以PCR产物为模板，用 TaP5CS-2F和 TaP5CS-2R组成的引物进行巢式PCR扩增，电泳，回收后连接到PMD18载体（TAKARA），送生工进行测序。 PCR 反应体系同上述方法。PCR参数：95℃ 5min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2.5 min，35个循环。

测序结果表明，以农优9号的DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段为 TaP5CS基因的基因组水平序列，如序列表SEQ ID NO.1所示，其基因全部长度为6238bp，含有20个外显子和19个内含子。以农优9号的cDNA为模板PCR扩增得到的DNA片段为 TaP5CS基因的cDNA序列，如序列表中SEQ ID NO.2所示，其长度为2557bp；用 TaP5CS-2F和 TaP5CS-2R组成的引物进行巢式PCR扩增得到的DNA片段为 TaP5CS基因的CDS序列，如序列表中的SEQ ID NO.3所示，其长度为2193bp，为序列表SEQ ID NO.2中自5'末端第152~2344位的脱氧核糖核苷酸序列，并编码如序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，氨基酸的个数为730。

实施例二： TaP5CS的荧光定量分析

对农优9号苗期接菌后不同时间段（0h、24h、48h、96h）的茎基部进行荧光定量分析：总 RNA 的提取及 cDNA 的反转同实施例一。

针对  TaP5CS基因序列设计荧光定量特异性引物如下：

TaP5CS-3F：5’-TGCGGCACAAGATTCAGGTT-3’；

TaP5CS-3R：5’-AATTGCGGACATGGAGGACC-3’。

内参基因选用 β-actin（GenBank accession no. AB181991），引物序列如下：

β-actin-F：GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC；

β-actin-R：GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC。

荧光定量用美国伯乐Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR Detection System进行。20μL的反应体系，上下游引物各0.4μL，Go Taq® qPCR Master Mix (Perfect Real Time;Promega)10μL，nuclease-free water 7.2μL。PCR程序：95℃ for 3 min，95℃ for 5 s，60℃ for 30 s，72℃ for 30 s，40个循环数。以接菌0h的 TaP5CS基因表达量为对照，利用 TaP5CS-3F和 TaP5CS-3R为引物，采用2^-△△CT法计算 TaP5CS基因的相对表达量，结果如图1所示；由该图可知，与接菌0h比较，接菌处理不同时间段后， TaP5CS基因的表达均上调，且在48h达到最高，为0h的12倍，符合转录组数据的表达模式。

实施例三： TaP5CS转基因小麦的获取

1.  TaP5CS植物过表达载体的构建

根据实施例一中克隆得到的 TaP5CS的全长cDNA序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶BamHI 和 SacI识别位点及保护碱基，引物序列如下：

TaP5CS-4F：5’- GGATTCATGGGCAGGGGAGGCATCGG -3’；

TaP5CS-4R：5’- GAGCTCTCATTGCAAAGGAAGATCCT -3’。

表达载体选择LGY-OE3，其载体图谱如图2所示。

将上述2193bp的DNA片段克隆入植物表达载体pLGY-02的酶切位点BamHI 和SacI之间，得到含有小麦 TaP5CS基因的重组表达载体，命名为LGY-OE3- TaP5CS。

2.  TaP5CS转基因小麦的获得

将LGY-OE3- TaP5CS用农杆菌浸染法转化小麦Fielder的幼胚愈伤组织，经过筛选、预分化、分化得到转基因小麦植株。

3. 转基因小麦的阳性鉴定

利用潮酶素标签（Hyg）引物Hyg-F和Hyg-R引物对T₁代转基因植株进行阳性鉴定，引物序列如下：

Hyg-F：5’-TCTGCACCATCGTCAACCAC-3’；

Hyg-R：5’-AAACCCACGTCATGCCAGTT -3’。

共获得10个阳性转基因植株，经过加代，获得T₂代纯合转基因株系OE#5、OE#7和OE#8。

4. 转基因小麦的 TaP5CS表达鉴定

利用 TaP5CS-3F和 TaP5CS-3R引物，荧光实时定量检测 TaP5CS在T₂代阳性转基因株系中的表达量，结果如图3所示。从图3可知， TaP5CS在T₂代阳性转基因株系OE#5、OE#7和OE#8叶片中的表达量显著高于受体对照，分别为对照的4.5倍，3.3倍和4.1倍。

实施例四： TaP5CS转基因小麦的脯氨酸含量测定

利用茚三酮显色法对T₂代过表达转基因株系 (OE#5、OE#7和OE#8) 与对照Fielder的幼苗进行脯氨酸含量测定。用磺基水杨酸提取小麦蛋白，加热处理后，蛋白与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度，结果如图4所示。从图4可知，脯氨酸在T₂代过表达转基因株系 (OE#5、OE#7和OE#8) 叶片中的含量显著高于受体对照Fielder。证实 TaP5CS在小麦脯氨酸合成途径中发挥重要作用。

实施例五： TaP5CS转基因小麦的茎基腐抗性鉴定

参照实施例一中的步骤1进行病原菌扩繁，对T₂代过表达转基因株系 (OE#5、OE#7和OE#8) 与对照Fielder参照实施例一中的步骤2进行材料接种和培养。接菌4 周后调查植株表型。将麦苗从培养盒中取出，用水清洗植株基部，参考 Smiley等（2005b）的病级划分方法统计植株病害发生程度，计算其病情指数，并对茎基部进行菌丝侵染观察，结果如图5、图6所示。

从图5中可知，与受体对照相比，T₂代过表达转基因株系 (OE#5、OE#7和OE#8) 茎基部褐化减弱，抗性增强。

从图6A中可知，与受体对照相比，病情指数 (DI) 在T₂代过表达转基因株系 (OE#5、OE#7和OE#8) 显著下降，分别为42，47，46。

从图6B中可知，与受体对照相比，菌丝量在T₂代过表达转基因株系 (OE#5)减少。

综述所述，本申请所述小麦茎基腐响应基因 TaP5CS可以增强小麦茎基腐病抗性。可用于研究小麦茎基腐病抗性的分子机制，在小麦抗病育种方面具有重要的应用价值。

尽管已描述了本申请的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请之发明精神和范围。这样，倘若这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或其全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或其CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

3.扩增权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS的引物，包括以下引物对：

TaP5CS-1F：5’- CCACTTGTTATCCCACGGTT -3’；

TaP5CS-1R：5’- TCACGGAACTAGATAGCGACA -3’；或

TaP5CS-2F：5’- ATGGGCAGGGGAGGCATCGG -3’；

TaP5CS-2R：5’- TCATTGCAAAGGAAGATCCT -3’。

4.一种由权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS构建的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，其为含有如SEQ ID NO.3所示的DNA片段的过表达载体。

6.一种由权利要求4所述重组表达载体所构建的重组菌。

7.权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS或权利要求6所述重组菌在小麦抗茎基腐病品种/品系选育中的应用。

8.权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS在促进小麦脯氨酸合成中的应用。

9.权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS或权利要求2所述蛋白在防治小麦茎基腐病中的应用。

10.一种提高小麦抗茎基腐病的方法，其特征在于，过表达权利要求1所述小麦茎基腐病抗性基因TaP5CS。

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