CN117777263A - 小麦抗病相关蛋白TaMTase在调控小麦茎基腐病害抗性中的应用 - Google Patents
小麦抗病相关蛋白TaMTase在调控小麦茎基腐病害抗性中的应用 Download PDFInfo
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了小麦抗病相关蛋白TaMTase在调控小麦茎基腐病害抗性中的应用。本发明提供了TaMTase蛋白在调控小麦茎基腐病抗性中的应用；所述TaMTase蛋白为如下任一：（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；所述调控为：使所述TaMTase蛋白在小麦中的表达量降低，所述小麦对茎基腐病的抗性降低。本发明对于培育抗茎基腐病小麦新品种具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及小麦抗病相关蛋白TaMTase在调控小麦茎基腐病害抗性中的应用。
背景技术
作物病害是制约农业安全生产的关键因素，其严重威胁粮食产量和品质。在农业生产方面，合理安排布局作物品种抗性是提高粮食产量、促进作物稳产和优质的重要保障，最经济、有效的控制病害的手段。受各种生物和非生物胁迫，小麦产量与品质的稳定受到制约，育种家一直致力于培育兼抗生物与非生物胁迫的小麦品种。然而，常规小麦育种周期十分漫长，育成一个新品种一般需要7-8年的时间，将高产、抗逆、高品质等优良性状综合到一起则更加困难。小麦经过几百万年的驯化，丢失了许多优良的抗逆基因，品种间杂交往往只是反复利用仅有的抗逆基因。而通过远缘杂交引入新的优良基因，且不改变原有优良性状，具有一定难度和较长育种周期。转基因技术可以将其他物种的抗逆关键基因直接导入到综合性状优良的小麦品种，定向改造其抗逆性能，可以在较短时间内培育出既抗逆，综合性状又好的新品系。因此，充分发掘和利用抗逆基因，对提高作物的产量与品质提供了全新思路，对保障国家粮食安全和农业可持续发展具有重要意义。
镰刀菌茎基腐病（FCR）在全世界干旱、半干旱地区的禾本科植物上均有发生，包括小麦、燕麦和大麦。中国在2011年首次报道假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudograminearum）引起河南省小麦的茎基腐病。当气候干燥，实行免耕耕作模式和小麦连作后，小麦茎基腐病发生严重，目前已经成为小麦生产上的长期性难题。小麦茎基腐病（FCR）的症状表现为：苗期小麦受到假禾谷镰刀菌侵染后，幼苗茎基部叶鞘和茎秆变褐，严重时引起麦苗发黄、枯死；拔节期和抽穗期感病植株茎基部变为褐色田间湿度大时茎节处可见粉红色霉层；到小麦成熟期严重发病株产生失水状枯死和白穗，造成籽粒秕瘦，甚至无籽。
小麦作为世界上最重要的作物之一，维护其产量的稳定和品质的提高是保障国家粮食安全的基础。对于小麦FCR相关基因的挖掘在小麦上已经有所报道，然而，这些遗传位点或基因对防止普通小麦FCR的影响有限。因此，需要克隆和聚合更多的FCR抗性基因，以控制小麦FCR对小麦产量和品质的威胁。目前在生产上，对小麦FCR 的防治方法多种多样，包括化学拌种、合理施肥、轮作、种植抗病品种等。农业防治的基本思路是控制田间病原菌的基数，创造出有利于植物生长，而不利于病原菌繁殖发展的生长环境，并结合适宜的种植制度以及合理的水肥管理方法等方式来避免病害的发生。由于小麦茎基腐病由多基因控制，遗传效率较高，通过杂交选育或者聚合育种可以将抗性基因转移到含有优良农艺性状的背景材料中去，实现对茎基腐病的抗病育种。
发明内容
本发明的目的是提供小麦抗病相关蛋白TaMTase在调控小麦茎基腐病害抗性中的应用。
第一方面，本发明要求保护TaMTase蛋白在调控小麦茎基腐病抗性中的应用；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述调控为：使所述TaMTase蛋白在小麦中的表达量降低，所述小麦对茎基腐病的抗性降低。
在该方面中，如果因为所述TaMTase蛋白在小麦中的活性降低/升高，导致所述小麦对茎基腐病的抗性降低/升高，该应用也属于本发明的保护范围。
在（A2）中，在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签通常是为了便于纯化或检测。所述标签包括但不限于：GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、His标签蛋白（His-tag）、MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP（增强型绿色荧光蛋白）、eCFP（增强型青色荧光蛋白）、eYFP（增强型黄绿色荧光蛋白）、mCherry（单体红色荧光蛋白）或AviTag标签蛋白等。下同。
进一步地，所述TaMTase蛋白还可为将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于小麦的蛋白质；或者为与上述（A1）所限定的氨基酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且来源于小麦的具有相同功能的蛋白质。下同。
其中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。下同。
所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94%的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89%的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84%的同一性。下同。
第二方面，本发明要求保护能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质在降低小麦茎基腐病抗性中的应用。
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
在该方面中，能够使小麦中TaMTase蛋白的活性降低的物质在降低小麦茎基腐病抗性和/或提高小麦茎基腐病病情指数和/或提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量中的应用也属于本发明的保护范围。
其中，所述“能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质”可为从基因转录水平上进行的调控，也可为在基因转录后水平上进行的调控（也就是对初级转录物的剪接或加工进行的调控），还可为对RNA转运进行的调控（也就是对mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控），也可为对翻译进行的调控，亦或是对mRNA降解进行的调控。下同。
在本发明的具体实施方式中，所述“能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质”为BSMV基因组编辑载体；所述BSMV基因组编辑载体由BSMV-α载体、BSMV-β载体和BSMVγ-TaMTase载体组成；所述BSMVγ-TaMTase载体上携带有SEQ ID No.3所示的用于沉默所述TaMTase蛋白的编码基因的沉默片段。具体地，所述BSMVγ-TaMTase载体为在BSMV-γ载体的NheⅠ酶切位点插入了SEQ ID No.3所示DNA片段后所得。
第三方面，本发明要求保护能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质在如下任一中的应用：
（I）提高小麦茎基腐病病情指数；
（II）提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量。
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
在该方面中，能够使小麦中TaMTase蛋白的活性降低的物质在降低小麦茎基腐病抗性和/或提高小麦茎基腐病病情指数和/或提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量中的应用也属于本发明的保护范围。
其中，所述“能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质”可为从基因转录水平上进行的调控，也可为在基因转录后水平上进行的调控（也就是对初级转录物的剪接或加工进行的调控），还可为对RNA转运进行的调控（也就是对mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控），也可为对翻译进行的调控，亦或是对mRNA降解进行的调控。下同。
在本发明的具体实施方式中，所述“能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质”为BSMV基因组编辑载体；所述BSMV基因组编辑载体由BSMV-α载体、BSMV-β载体和BSMVγ-TaMTase载体组成；所述BSMVγ-TaMTase载体上携带有SEQ ID No.3所示的用于沉默所述TaMTase蛋白的编码基因的沉默片段。具体地，所述BSMVγ-TaMTase载体为在BSMV-γ载体的NheⅠ酶切位点插入了SEQ ID No.3所示DNA片段后所得。
第四方面，本发明要求保护一种降低小麦茎基腐病抗性的方法。
本发明所要求保护的降低小麦茎基腐病抗性的方法，包括使受体小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的步骤。
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
第五方面，本发明要求保护一种提高小麦茎基腐病病情指数和/或提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量的方法。
本发明要求保护的提高小麦茎基腐病病情指数和/或提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量（DON）的方法，可包括使受体小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的步骤。
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
在第四方面和第五方面中，所述方法也均可包括使所述受体小麦中所述TaMTase蛋白的活性降低的步骤。
其中，所述脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）由假禾谷镰刀菌诱导产生。
第六方面，本发明要求保护一种培育茎基腐病抗性降低的转基因小麦的方法。
本发明要求保护的培育茎基腐病抗性降低的转基因小麦的方法，可包括如下步骤：对受体小麦中能够表达TaMTase蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因小麦；所述转基因小麦与所述受体小麦相比，对茎基腐病的抗性降低。
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
第七方面，本发明要求保护一种培育茎基腐病病情指数提高和/或体内脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）含量提高的转基因小麦的方法。
本发明要求保护的培育茎基腐病病情指数提高和/或体内脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）含量提高的转基因小麦的方法，可包括如下步骤：对受体小麦中能够表达TaMTase蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因小麦；所述转基因小麦与所述受体小麦相比，茎基腐病病情指数提高和/或体内脱氧雪腐镰刀菌醇含量提高。
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
其中，所述脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）由假禾谷镰刀菌诱导产生。
在前文第六方面和第七方面中，对所述受体小麦中能够表达所述TaMTase蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。在本发明的具体实施方式中，具体是通过向所述受体小麦中导入BSMV基因组编辑载体实现；所述BSMV基因组编辑载体由BSMV-α载体、BSMV-β载体和BSMVγ-TaMTase载体组成；所述BSMVγ-TaMTase载体上携带有SEQ ID No.3所示的用于沉默所述TaMTase蛋白的编码基因的沉默片段。具体地，所述BSMVγ-TaMTase载体为在BSMV-γ载体的NheⅠ酶切位点插入了SEQ ID No.3所示DNA片段后所得。
在前文第六方面和第七方面中，所述转基因小麦理解为不仅包含第一代到第二代转基因小麦，也包括其子代。所述转基因小麦包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
在前文第六方面和第七方面中，能够表达所述TaMTase蛋白的核酸分子为基因组DNA或mRNA。
在前文第六方面和第七方面中，能够表达所述TaMTase蛋白的核酸分子可为SEQID No.2所示DNA分子。
在上述各方面中，所述茎基腐病的病原菌为假禾谷镰刀菌。在本发明的具体实施方式中，所述假禾谷镰刀菌具体为假禾谷镰刀菌CS3096。
在本发明的具体实施方式中，所述小麦为小麦品种普冰资300。
在上述各方面中，相关技术方案的应用范围从小麦扩展到禾本科或者小麦属或者单子叶植物或者植物都是本发明的保护范围。
本发明通过将来源于小麦（Triticum aestivum L.）的TaMTase基因导入到受体小麦（普冰资300）中，得到了沉默TaMTase基因的小麦植株。实验证明，与未沉默受体小麦对照相比，在病原菌（假禾谷镰刀菌）接种条件下，沉默TaMTase基因的植株的茎基部褐色病斑明显多于受体小麦对照，长势差于受体小麦对照；另外，与受体小麦对照相比沉默TaMTase基因的小麦病级指数显著升高，并且DON毒素含量显著升高，这表明TaMTase基因的沉默显著降低了小麦对茎基腐病的抗性。TaMTase基因正调控小麦对茎基腐病的抗性。本发明对于培育抗茎基腐病小麦新品种具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为TaMTase在BSMV:γ和BSMV: TaMTase沉默的小麦植株中的转录水平。图中，BatchⅠ和BatchⅡ为两个独立批次。
图2为BSMV: TaMTase沉默的小麦植株和BSMV:γ对照小麦植株对茎基腐的抗性分析。A为接种BSMV:γ或BSMV: TaMTase后，小麦叶片出现轻度褪绿花叶症状。B为假禾谷镰刀菌侵染茎部的病害表型。接种病原菌14天后拍照。
图3为BSMV: TaMTase沉默的小麦植株和BSMV:γ对照小麦植株在感染茎基腐病原菌后的数据分析。A为在假禾谷镰刀菌处理下，BSMV: TaMTase沉默的小麦植株和BSMV:γ对照小麦植株叶片中TaMTase转录量在0、12、24、48、72hpi（hpi表示感染后小时数）时的含量。B为BSMV: TaMTase沉默的小麦植株和BSMV:γ对照小麦植株的病级指数。C为BSMV:TaMTase沉默的小麦植株和BSMV:γ对照小麦植株的茎基中假禾谷镰刀菌诱导的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小麦品种“普冰资300”，由中国农业科学院作物科学研究所李立会教授提供。公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的BSMV病毒载体3组分（BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒）：由中国农业科学院作物科学研究所张增艳课题组提供，记载于“赵丹, 赵继荣, 黄茜, 李宁, 刘艳,黄占景, 张增艳. 利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能. 作物学报. 2011(11) ”一文，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的BSMV:γ-PDS载体记载于“王昊龙等. 小麦SBEⅡb 基因的克隆及其与PDS 基因串联VIGS 载体的构建. 石河子大学学报(自然科学版)，2014-02-06”一文，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudograminearum）CS3096：记载于文献“Jiang Y, Habib A, et al. Development of tightly linked markers andidentification of candidate genes for Fusarium crown rot resistance in barleyby exploiting a near-isogenic line-derived population. Theor Appl Genet. 2019Jan;132(1):217-225. doi: 10.1007/s00122-018-3209-0. Epub 2018 Oct 16. PMID:30327844.”中，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
pEASY-Blunt平末端克隆载体（TransGen Biotech，CB101-01）和Trans1-T1大肠杆菌感受态（TransGen Biotech，CD501-02）：主要用于基因克隆与测序。
下述实施例采用GraphPad Prism统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Two-way ANOVA检验，P＜0.05（*）表示具有显著性差异，P＜0.01（**）表示具有极显著性差异。
实施例1、TaMTase蛋白及其编码基因的获得
以Ensembl网站公布的中国春TaMTase基因序列（TraesCS5D02G488400）为参考，通过Primer Premier 5设计引物，引物序列如下：
TaMTase-F：5'-ATGGCGCCCACCCAAGGCAA-3'；
TaMTase-R：5'-TTTTTCATCGAGTGTTCAAGGG-3'。
并用NCBI和WheatOmics网站验证引物的特异性，随后以普通小麦普冰资300（中国农业科学院种质资源库保存，由中国农业科学院作物科学研究所李立会教授提供）的cDNA为模板进行基因克隆，再将克隆片段连接到中间克隆载体pEASY-Blunt上，并通过测序验证TaMTase基因序列。
正常条件下生长7d左右的小麦幼苗，取叶片用液氮速冻，-80℃保存备用。
采用植物总RNA快速提取试剂盒（ZOMANBIO，ZP405-1）提取小麦叶片总RNA，用全式金公司的一步去除gDNA和合成cDNA混液（AT311-02）合成cDNA。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
通过PCR方法获得含有SEQ ID No.2的DNA片段。SEQ ID No.2为TaMTase基因的编码框，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。SEQ ID No.1所示的蛋白质为TaMTase蛋白。
实施例2、VIGS沉默TaMTase小麦的获得
一、重组VIGS载体的构建
1、提取普冰资300小麦叶片的总RNA，反转录得到cDNA。
2、以Ensembl网站公布的中国春TaMTase基因序列（TraesCS5D02G488400）为参考，使用SGN VIGS tool网站设计最优沉默片段（SEQ ID No.3）。然后用上述步骤1中的cDNA作为模板，在TaMTase基因最优沉默片段两端设计特异性的引物对该基因进行扩增，并回收PCR产物。扩增引物如下：
BSMV-TaMTase-F：5'-CACCATCCA-ACACCATGGTGGGGCTAT-3'；
BSMV-TaMTase-R：5'-TTTGAACAGGGAC-GTGGAATGCTCATCT-3'。
3、将上述扩增并回收的PCR产物与pEASY-Blunt载体连接（全式金，北京），并转化大肠杆菌 Trans1-T1感受态细胞（TransGen Biotech，CD501-02），并涂于含有50μg/L卡那霉素的固体LB培养基平板上，37℃过夜培养。对大肠杆菌的克隆菌落进行菌液PCR检测，将阳性的克隆送入公司进行测序，将测序正确的菌液进行保存，并得到pEASY-Blunt-TaMTase质粒。
4、以步骤3得到的质粒为模板，采用γ-TaMTase-F和γ-TaMTase-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并进行PCR产物胶回收。
γ-TaMTase-F：5'-GATTCTTCTTCCGTTGCTAGC-CACCATCCAACACCATGGTGGGGCTAT-3'；
γ-TaMTase-R：5'-TTTTTTTTTTTTTTAGCTAGC-TTTGAACAGGGACGTGGAATGCTCATC T-3'。
下划线部分为NheⅠ识别序列。
5、用限制性内切酶NheⅠ酶切载体BSMV-γ，回收载体骨架。
6、将步骤4的PCR产物和步骤5的载体骨架利用Takara公司的In-Fusion技术进行连接，得到重组质粒BSMVγ-TaMTase。根据测序结果，对重组质粒BSMVγ-TaMTase进行结构描述如下：在载体BSMV-γ的NheⅠ酶切位点插入了SEQ ID No.3所示DNA片段的重组载体。
二、TaMTase沉默小麦的获得
1、VIGS各载体线性化：
用限制性内切酶MluⅠ酶切载体BSMV-α，回收载体骨架。
用限制性内切酶SpeⅠ酶切载体BSMV-β，回收载体骨架。
用限制性内切酶NheⅠ酶切载体BSMV-γ，回收载体骨架。
用限制性内切酶BssHⅡ酶切载体BSMV:γ-PDS，回收载体骨架。
用限制性内切酶MluⅠ酶切载体BSMVγ-TaMTase，回收载体骨架。
2、完成步骤1后，根据Promega公司的RiboMAX™ Large Scale RNA ProductionSystems-T7试剂盒将回收的各载体进行体外转录。
3、配制FES缓冲液
母液5×GPbuffer：甘氨酸1.877 g，磷酸氢二钾2.613 g，RNase-Free ddH2O定容到50 mL，灭菌锅灭菌20 min 备用。
配制FES缓冲液：100 mL1×GP Buffer，焦磷酸钠5 g，斑脱土5 g，硅藻土5 g，RNase-Free ddH2O定容到500 mL，灭菌锅灭菌20 min 备用。
不同处理摩擦液组成：取提前完成体外转录的产物，α、β、γ/γ-PDS/γ- TaMTase各2.5 μL，按照1：1：1 （体积比）的比例进行均匀混合，用RNase-Free ddH2O等体积稀释，吸取5 μL稀释后的混合液，与90 μL FES 缓冲液吸打混匀，得到FES混合液。本试验每次设置4组，分别为：完全空白对照组（WT），病毒空白对照组（α+β+γ），白化阳性对照组（α+β+γ-PDS）和基因沉默组（α+β+γ-TaMTase）。
4、完成步骤3后，在要侵染的小麦叶片（普冰资300）表面先喷上少量RNase-FreeddH2O，取8-10 μL FES缓冲液点于干净手套上，对幼苗第二叶叶片进行3次摩擦，摩擦时控制好力度，摩擦完后从上往下喷少许RNase-Free ddH2O保持湿度，每个处理均需换干净手套操作。病毒接种完后置于23±2℃培养箱中保温保湿避光培养24 h，后调为16h/8h光暗周期培养，定期观察并记录表型变化。
5、完成步骤4后，待γ-PDS阳性对照表型出现后，对小麦植株进行基因沉默效率测定。取小麦“普冰资300”和BSMV病毒侵染的小麦叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA模板进行qRT-PCR，采用Actin基因作为内参基因，检测TaMTase基因的相对表达量。
用于检测TaMTase基因的引物如下：
RT-TaMTase-F：5'-CTCTTTCTGAGCTGGCCACA-3'；
RT-TaMTase-R：5'-CGTGCTTGGGGTAAGTCCAT-3'。
用于检测Actin基因的引物如下：
RT-Actin-F：5'-CCTCTCTGCGCCAATCGT-3'；
RT-Actin-R：5'-TCAGCCGAGCGGGAAATTGT-3'。
结果如图1所示。通过qPCR检测TaMTase基因相对表达量, 选Actin作为内参基因。每个数据点为三个实验的平均值（±SD）。与感染了BSMV：γ的小麦植株（对应前文的“病毒空白对照组(α+β+γ)”）相比，感染了BSMV:TaMTase的小麦植株（对应前文的“基因沉默组(α+β+γ-TaMTase)”）的转录本水平显著降低，说明TaMTase基因成功沉默。
实施例3、小麦对假禾谷镰刀菌的敏感性分析
对实施例2获得的TaMTase基因沉默成功的植株接种小麦茎基腐病菌——假禾谷镰刀菌CS3096，在感染后0-72小时取样进行组织学观察和RNA分离，采用实时逆转录PCR（qRT-PCR）分析基因的沉默效率（具体方法参见实施例2）。在感染后14天时对茎基部进行采样，用于脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）的产量分析，同时在感染后14天时拍摄对植株感染的状况。
接种方法如下：
1、培养基制备
选用新鲜的土豆去皮，切成较小的薄块，称取200 g土豆薄块放入锅中并加入蒸馏水进行煮沸。约20 min后，当土豆块可以用玻璃棒轻易捣烂时，用纱布进行过滤。对滤液重新加热，依次向锅内加入琼脂粉15 g和葡萄糖20 g并搅拌均匀后，定容在1 L烧杯中，待稍微冷却后进行分装，可以分装到小容量锥形瓶中，在121℃，0.1 Mpa条件下进行再次湿热灭菌20 min备用。选取大小均匀一致的小米放入沸水中煮沸3 min，倒出用冷水冲洗干净，并平铺在干净纱布上于通风处晾至表面无水，晾好后分装到150 mL三角瓶中并扎好瓶口，灭菌锅121℃，0.1 Mpa条件下进行湿热灭菌30 min备用。
2、菌种扩繁
从新活化菌的PDA培养板边缘挑取健康旺盛带菌丝的假禾谷镰刀菌CS3096菌块，接入灭菌的小米培养基（步骤1制备）中于25℃的温度培养7天，每天摇晃2次使病原菌分布均匀，以用于材料接种。
3、小麦植株接菌
在种植小麦（即实施例2获得的TaMTase基因沉默成功的小麦植株）的7 cm × 7cm小方盒中接入0.4 g带菌小米（步骤2制备所得），均匀铺满小盒铺在土壤基质上层），并确保每株麦苗基部有一粒小米菌，培养条件同步骤2，每3天浇水一次。实验同时设置BSMV:γ对照小麦和未经任何处理的普冰资300小麦植株。
结果如图2和图3所示。图2显示假禾谷镰刀菌侵染后，BSMV:TaMTase沉默小麦植株茎部褐变显著强于对照小麦植株。这表明沉默TaMTase基因的小麦植株对茎基腐病的抗性更低。图3中A显示在假禾谷镰刀菌处理下，BSMV:TaMTase诱导的小麦叶片中TaMTase基因转录量在0、24、48 hpi时减少了42%-63%。图3中B显示BSMV:TaMTase诱导的小麦植株病害指数高于BSMV:γ对照植株。图3中C显示BSMV: TaMTase诱导的小麦植株的茎基中假禾谷镰刀菌诱导的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）含量高于BSMV:γ对照植株。图3中每个数据点为三个平行实验的平均值（±SD）。这表明沉默TaMTase基因的小麦植株病级指数更高，DON含量更高。
上述结果表明TaMTase基因的沉默可以降低小麦对茎基腐病的抗性。这意味着TaMTase基因正调控小麦对茎基腐病的抗性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.TaMTase蛋白在调控小麦茎基腐病抗性中的应用；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述调控为：使所述TaMTase蛋白在小麦中的表达量降低，所述小麦对茎基腐病的抗性降低。
2.能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质在降低小麦茎基腐病抗性中的应用：
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述物质为BSMV基因组编辑载体；所述BSMV基因组编辑载体由BSMV-α载体、BSMV-β载体和BSMVγ-TaMTase载体组成；所述BSMVγ-TaMTase载体上携带有SEQ ID No.3所示的用于沉默所述TaMTase蛋白的编码基因的沉默片段。
3.能够使小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的物质在如下任一中的应用：
（I）提高小麦茎基腐病病情指数；
（II）提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述物质为BSMV基因组编辑载体；所述BSMV基因组编辑载体由BSMV-α载体、BSMV-β载体和BSMVγ-TaMTase载体组成；所述BSMVγ-TaMTase载体上携带有SEQ ID No.3所示的用于沉默所述TaMTase蛋白的编码基因的沉默片段。
4.一种降低小麦茎基腐病抗性的方法，包括使受体小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的步骤；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
5.一种提高小麦茎基腐病病情指数和/或提高小麦中脱氧雪腐镰刀菌醇含量的方法，包括使受体小麦中TaMTase蛋白的表达量降低的步骤；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
6.一种培育茎基腐病抗性降低的转基因小麦的方法，包括如下步骤：对受体小麦中能够表达TaMTase蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因小麦；所述转基因小麦与所述受体小麦相比，对茎基腐病的抗性降低；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
7.一种培育茎基腐病病情指数提高和/或体内脱氧雪腐镰刀菌醇含量提高的转基因小麦的方法，包括如下步骤：对受体小麦中能够表达TaMTase蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因小麦；所述转基因小麦与所述受体小麦相比，茎基腐病病情指数提高和/或体内脱氧雪腐镰刀菌醇含量提高；
所述TaMTase蛋白为如下任一：
（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：对所述受体小麦中能够表达所述TaMTase蛋白的核酸分子进行抑制表达通过向所述受体小麦中导入BSMV基因组编辑载体实现；所述BSMV基因组编辑载体由BSMV-α载体、BSMV-β载体和BSMVγ-TaMTase载体组成；所述BSMVγ-TaMTase载体上携带有SEQ ID No.3所示的用于沉默所述TaMTase蛋白的编码基因的沉默片段。
9. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：能够表达所述TaMTase蛋白的核酸分子为SEQ ID No.2所示DNA分子。
10.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述茎基腐病的病原菌为假禾谷镰刀菌。
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