CN106967729A

CN106967729A - Wrky转录因子在制备抗逆转基因甜橙中的应用

Info

Publication number: CN106967729A
Application number: CN201710246942.1A
Authority: CN
Inventors: 陈帅; 解栋梁
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhang Chi
Priority date: 2017-04-16
Filing date: 2017-04-16
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2037-04-16
Also published as: CN106967729B

Abstract

本发明提供一种WRKY‑N基因，并针对该基因的表达蛋白进行了大约300多种突变，筛选并获得了其中11个具有提高活性的正向突变筛选。将所述的序列构建表达载体并转化甜橙中，获得了转基因植物，通过检测发现，与空白对照相比，具有提高的溃疡病、黄龙病以及炭疽病的效果，同时在耐旱和耐盐方面也具有较好的效果。

Description

WRKY转录因子在制备抗逆转基因甜橙中的应用

技术领域

本发明涉及一种抗逆蛋白质的编码基因及用途，特别是涉及一种改造的转基因甜橙。

背景技术

甜橙(学名：Citrus sinensis(L.)Osbeck)，乔木，枝少刺或近于无刺。叶通常比柚叶略小，翼叶狭长，叶片卵形或卵状椭圆形，很少披针形，长6-10厘米，宽3-5厘米，或有较大的。花白色，总状花序有花少数；花萼5-3浅裂，花瓣长1.2-1.5厘米；雄蕊20-25枚；花柱粗壮，柱头增大。果圆球形，扁圆形或椭圆形，橙黄至橙红色，果皮难或稍易剥离，瓢囊9-12瓣，果心实或半充实，果肉淡黄、橙红或紫红色，味甜或稍偏酸；种子少或无，子叶乳白色，多胚。花期3-5月，果期10-12月，迟熟品种至次年2-4月。橙子中含量丰富的维生素C、P，能增加机体抵抗力，增加毛细血管的弹性，降低血中胆固醇。高血脂症、高血压、动脉硬化者常食橙子有益。橙子所含纤维素和果胶物质，可促进肠道蠕动，有利于清肠通便，排除体内有害物质。

植物病虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失。溃疡病是甜橙较易发生、为害性较大的一种细菌性病害，为国内外植物检疫对象。溃疡病能为害幼嫩叶片、枝梢和果实。叶片发病初期在叶背出现淡黄色针尖大小的油浸状斑点，尔后病斑逐渐扩大，转为米黄色至暗黄色，并在同一病斑处穿透叶片正反两面同时隆起，一般背面隆起比正面更加明显。继而病斑中央呈火山口状裂开。最后病斑呈木栓化，灰褐色，近圆形，周围有油渍状晕环。枝梢和果实的症状与叶片相似。叶片感病严重时造成大量落叶，枝梢枯死；果实感病严重时会造成落果、裂果。

黄龙病是一种极微小的细菌引起的病害，初期病树表现为黄梢和叶片斑驳型黄化两种类型。感病植株枝梢老熟后，从叶片基部、边缘逐渐退绿，不均匀黄化、变硬，形成黄绿相间的斑驳状，最后全叶黄化脱落。在具均匀黄化叶或斑驳黄化叶的枝条上抽生的新梢，叶片一般呈缺素状花叶。被害植株长势衰弱，枝梢变细、变短，后期病树出现烂根，开花多而早，落花落果严重；果形小，色青或畸形，成熟时着色不均匀，产量锐减，严重者丧失结果能力。

炭疽病也是甜橙通常会致病的一种。甜橙发生炭疽病后，容易造成落叶、落果、枯梢、裂果和果实滞育，使树势衰弱，产量降低，甚至整株死亡。贮藏期间还会引起果实腐烂。叶片多在叶尖和边缘发病，病斑近圆形或不规则形，中央灰白色或淡褐色，密生黑色小点，边缘黄褐色。枝梢病部淡褐色，发病后由上而下逐渐枯死。病斑上也有黑色小点。天气潮湿时，会出现粉红色霉状物。果实发病多在蒂部，形态不一，有暗褐色斑块。干燥时病部黄褐色，稍稍凹陷，病斑分界明显，湿度大时则往往全果腐烂。

为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制剂，但二者在实际应用中都具有局限性：化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，经过研究发现将编码抗逆蛋白的基因转入植物中，可获得一些转基因植物以防治植物病害。

至今为止，已有大量的研究表明WRKY蛋白在不同生理生化过程中起着关键作用，像信号传导，代谢，木质化等。此外，越来越多的证据表明WRKY转录因子参与了植物对生物及非生物逆境的响应过程。例如，拟南芥II族a亚族的三个成员，AtWRYK18、AtWRKY40和AtWRKY60,在结构上与功能上形成冗余、拮抗而又互不相同的复杂作用模式，应对不同的真菌及细菌病害。水稻中也有关于一对WRKY转录因子的等位基因在白叶枯病、细菌性条斑病以及干旱、盐等逆境下作用截然相反的研究报道。鉴于WRKY转录因子在植物逆境胁迫过程所起的重要作用，该类基因可作为有效的基因资源，通过转基因模式创造出抗性增强的转基因植物。目前为止，已有大量研宄表明，过量表达类似基因能够显著增强植物的抗逆性。

在甜橙中目前共发现有WRKY转录因子50多个种类，其功能也各不相同。目前针对WRKY在甜橙中表达的情况没有报道，特别是在甜橙中抗逆的情形也没有相应的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种WRKY基因，该特异性的基因具体序列如:SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种抗逆蛋白质，包括：

(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有抗逆活性的由(a)衍生的蛋白质。

所述的取代具体为在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基础上，在S62E，A83R，T105C，K121R，R125S，L142P，A155D，R161P，N170K，S183Q，G200H，T222P进行相应的取代。S62E表示在第62位，将S取代为E。

为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述抗逆基因。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述抗逆基因或所述表达盒的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述抗逆基因或所述表达盒的转基因宿主生物，包括植物细胞。

进一步地，所述植物为甜橙或柑橘。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生抗逆植物的方法，包括：将所述抗逆基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。

优选地，所述植物为甜橙或柑橘。

将所述的抗逆基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

本发明具有以下技术效果

本发明提供一种WRKY-N基因，该基因首次克隆得到，在现有技术中也没有相应的序列记录。针对该基因的表达蛋白进行了大约300多种突变，筛选并获得了其中11个具有提高活性的正向突变筛选。将所述的序列构建表达载体并转化甜橙中，获得了转基因植物，通过检测发现，与空白对照相比，具有提高的溃疡病、黄龙病以及炭疽病的效果，同时在耐旱和耐盐方面也具有较好的效果。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为转基因植物鉴定结果PCR图；1为野生型植物，2-13分别对应于序列2蛋白转基因植株、S62E突变的转基因植株、A83R突变的转基因植株、K121R突变的转基因植株、R125S突变的转基因植株、L142P突变的转基因植株、A155D突变的转基因植株、R161P突变的转基因植株、N170K突变的转基因植株、S183Q突变的转基因植株、G200H突变的转基因植株、T222P突变的转基因植株；14为T222P突变的转基因植株重复。

图2病情指数图。

图3发病率统计图。

图4存活率统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明编码基因及用途的技术方案。

实施例1表达载体以及农杆菌的构建

全基因合成SEQ ID NO：1所示的序列，通过采用本领域常用PCR引入突变位点的方法，分别设计并合成相应的突变序列，分别编码在SEQ ID NO：2所示序列的基础上在S62E，A83R，T105C，K121R，R125S，L142P，A155D，R161P，N170K，S183Q，G200H或T222P的突变。

将所述的基因序列进行T克隆，与PGEM-T载体连接并转化大肠杆菌进行蓝白斑筛选，分别获得含有目的基因的大肠杆菌PGEM-WRKY-N，采用测序，进行鉴定，结果表明构建正确。

植物表达载体pBI121-WRKY-N的构建

1,酶切质粒PGEM-WRKY-N

酶切反应体系:

加ddH20至20μl。37℃酶切30min后，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，与同样酶切质粒pB1121进行连接，连接条件为本领域常规的连接条件。将连接好的载体通过电激法转化农杆菌，通过鉴定，成功的获得了目的农杆菌。

实施例2转基因植物的获得

甜橙胚性愈伤组织在MT基本培养基上每25天继代一次，继代4次后用于农杆菌介导的遗传转化。本实验所使用的农杆菌菌株EHA105，此菌株包含pBI121载体，载体上已连接WRKY-N基因，均由CaMV35S启动子控制。愈伤系，抗性愈伤经胚状体诱导和芽再生获得转化子。再生抗性芽转到生根培养基(1/2MT+IBA 0.15mg/L十NAA 0.35mg/L+蔗糖25g/L+琼脂10g/L)上进行生根，获得的生根试管苗经驯化后移栽到温室。

转基因植物的分子鉴定：采小块叶片，采用DNA提取试剂盒，提取相应的DNA，分别采用引物F：ATGAGAGATAGTAGCAAAGAGA；R：TCATCTATTGCGCATCCCAGG，采用如下表1的PCR扩增体系进行扩增：

PCR反应程序为:95℃3min；94℃40s,57℃45s,72℃1.2min共35个循环；72℃再延伸10min；4℃forever PCR结束后，PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行扩增检测，结果如图1所示。通过检测发现，本发明提供的转基因植株具有含有目的基因，说明转基因构建成功。

实施例3抗逆性检测

1、溃疡病抗性检测

将溃疡病病菌活化扩增培养用于叶片离体接种。采集生长一致的WT和转基因叶片，自来水清洗干净后用接种针(直径约0.2mm)在叶片背面刺孔。每个叶片共刺8个接种点，叶脉两边各4个，每个接种点刺5-7个孔(总面积约1.5mm²)。取10μl菌液(取菌液之前充分摇匀，菌液浓度为2.0*10⁸个/mL左右)滴在每个接种点上，接种完成后将叶片平放在铺有滤纸的培养皿中，并且在滤纸上加4ml灭菌水以保证湿度，用封口膜封好后置于28℃生化培养箱暗培养。培养期间每天进行观察，转基因叶片在接种后0,3,5,7d拍照，每张照片均加上比例尺。照片拍好后用Image J(Version 1.4.3.67)软件计算病斑大小。病情指数(DI)参照Shiotani等(2008)的方法进行计算略有修改，分别随机选择发病后3，5，7天叶片20个病斑，用Image J软件统计每个病斑大小，根据病斑大小将病情分为0级(病斑大小<1.5mm2，即大约针刺的接种部位的面积大小)，1级((1.5mm2<病斑大小<2mm2)，3级(2mm2<病斑大小<3mm2)，5级(3mm2<病斑大小<5mm2)，7级(病斑大小>5mm2)，统计每级包含的病斑数目，DI＝∑[各级病斑数*相应级数值]/(20*7)*100。结果如图2所示。表2的具体数值结果，如下：

病情指数(％)\天数	0	3	5	7
					WT	0	13.56	33.06	55.01
序列2蛋白转基因植株	0	0.1	8.2	20.1
					S62E突变的转基因植株	0	0.2	8.3	16.5
A83R突变的转基因植株	0	0.3	7.6	13.8
					K121R突变的转基因植株	0	0.1	6.3	17
R125S突变的转基因植株	0	0.2	5.6	16.5
					L142P突变的转基因植株	0	0.3	9	15.3
A155D突变的转基因植株	0	0.2	4.6	13.4
					R161P突变的转基因植株	0	0.1	5.6	16
N170K突变的转基因植株	0	0.2	6.6	15.4
					S183Q突变的转基因植株	0	0.3	7.4	14.2
G200H突变的转基因植株	0	0.2	5.8	14
					T222P突变的转基因植株	0	0.1	7	13.5

从图2和表2的结果表明，接种后3、5、7天WT的病情指数分别达到13.56％33.06％和55.01％，分别为比转基因甜橙均较高。接种后5天，WT叶片的背面和正面均产生较大的海绵状脓疤，而对于转基因叶片只在其正面产生少量较小或者基本看不着的病斑。接种后7天虽然WT和转基因甜橙均产生了病斑，但是转基因植物的病斑面积要显著小于对照，这些数据表明，转基因植株显著增强了溃疡病抗性。

2、黄龙病抗性检测

将黄龙病菌活化培养，菌液浓度培养至2*10⁸个接种方法，步骤如下:

选取转基因植株新鲜叶片，无菌水洗净，平铺于培养皿中，叶柄处压一块

湿润棉花，防止叶片失水。将菌液稀释500倍，用固定大小针头蘸取黄龙病病菌液，针刺叶片，叶脉左右两边各刺12个针孔，每个样品重复四次，光照培养箱中28℃培养。发病率统计分析：接种第10d时，统计发病病斑数，以肉眼可见病斑为准，计算发病率，发病率(％)＝病斑数/接菌总数X 100％。

结果如图3所示，在没有转基因的甜橙中，发病率较高，而转基因的包括突变的几种甜橙中菌具有较低的发病率，具有较好的抗病效果。

3、耐盐性检测

将实施例2中通过PCR鉴定的转基因株系在成苗期进行耐盐性检测。具体方法:将野生型和转基因的苗，培养在正常的光照条件下生长28天，然后每隔3天用300mM的NaCl溶液浇灌，15天后统计成苗的存活率(存活率＝生长点坏死的成苗数/成苗的总数)。试验结果如图4所示，转基因苗在成苗期的耐盐性较野生型苗有显著的提高，这说明本发明的基因不仅具有抗菌活性，同时在耐盐性上也有较好的效果。

另外，在炭疽病抗性检测中，结果也与黄龙病结果基本相同，序列2蛋白对应的转基因植株的发病率仅为9.2％，其余突变结果也基本相似在此不一一赘述。

上面通过具体实施例详细说明本发明。本领域技术人员应清楚，本发明并不限于此处所列出的实施例，其保护范围由所附权利要求书限定，下面的实施例仅仅是以示例的方式说明本发明，以使本发明更易于理解。

序列表

〈110〉陈帅

〈120〉WRKY转录因子在制备抗逆转基因甜橙中的应用

〈160〉2

〈210〉1

〈211〉876

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉WRKY-N

1 ATGAGAGATA GTAGCAAAGA GAAATCGGAT CGAGGCCAGT CGAGCTGGAA GCTAGGGGAG

61 CCACCGGACG CGGGCTGCGT GAGTTATATT TTGAGCGAGT TTGGATGGAA TCTGGAAGAG

121 AGAGAGAGTT CGACCAGCTA CTTCGCTGCT GATCATGAAA GATCCGATTT GGCGGGAAAT

181 ATCAGCAGCA GTTTTCCGGC CGAAACTACT ACTGACGGTG GCGGTTTGAC AAATCCTGGA

241 AGGTCTGCTG ACGTGTCGAC TTCGAATCCG TCGGTTTCGT CGAGCTCCAG CGAGGATCCG

301 ACGGAGAAGT CTACGGGCTC CGGCGGTAAA CCTCCTGAGA TACCAAGCAA AGCAAGAGGA

361 AAAGGACAAA AGCGAATTCG GCAGCCACGT TTTGCATTTA TGACCAAGAG TGAAGTTGAT

421 CACCTTGAAG ATGGATACAG ATGGCGAAAG TATGGTCAGA AGGCTGTAAA AAATAGTCCG

481 AGACCTAGGA GCTACTACCG CTGCACAAAC AGTAAATGTA CAGTGAAGAA GAGGGAAGAA

541 CGATCATCTG AAGATCCCAC CATTGTAATT ACTACGTATG AAGGTCAACA CTGCCATGGA

601 ACCGTTGGAT TTCCTCGTGG TGGACTAATT AATCATGAAG CAGCTGCTTT TGCTGAACAT

661 TTGACTCACG CAATCCCACC ATATTATTAT CATCAAGGAG TTCAGATAAC CCAAGAAAGA

721 CCCGGTATCA AGCAGCAGTC ACATGAAGAA GAATTAATCC CAGTTGAAGC AAGAGAAGGA

781 GAACCAAATG CGTTGCCCGA ACCACCAGCC TTACCACCCC CCACGGATGA AGGAAGACTA

841 GGAGATATTG TGCCTCCTGG GATGCGCAAT AGATGA

〈210〉2

〈211〉291

〈212〉PRT

〈213〉人工序列

〈400〉WRKY-N

1 MRDSSKEKSD RGQSSWKLGE

21 PPDAGCVSYI LSEFGWNLEE

41 RESSTSYFAA DHERSDLAGN

61 ISSSFPAETT TDGGGLTNPG

81 RSADVSTSNP SVSSSSSEDP

101 TEKSTGSGGK PPEIPSKARG

121 KGQKRIRQPR FAFMTKSEVD

141 HLEDGYRWRK YGQKAVKNSP

161 RPRSYYRCTN SKCTVKKREE

181 RSSEDPTIVI TTYEGQHCHG

201 TVGFPRGGLI NHEAAAFAEH

221 LTHAIPPYYY HQGVQITQER

241 PGIKQQSHEE ELIPVEAREG

261 EPNALPEPPA LPPPTDEGRL

281 GDIVPPGMRN R*

Claims

1.一种基因，其序列包括SEQ ID NO:1。

2.一种蛋白，其序列如SEQ ID NO：2所示。

3. 如权利要求2所述的蛋白，其特征在于，在SEQ ID NO：2所示序列的基础上在S62E有唯一的突变。

4. 如权利要求2所述的蛋白，其特征在于，在SEQ ID NO：2所示序列的基础上在A83R，T105C，K121R，R125S，L142P，A155D，R161P，N170K，S183Q，G200H或T222P有唯一的突变。

5.一种植物表达载体，其用于表达权利要求2-4任一所述的蛋白。

6.一种产生抗逆转基因甜橙的方法，包括：将权利要求2-4任一所述蛋白的编码基因或权利要求5所述的重组载体导入甜橙中进行表达。

7.如权利要求6所述的方法，其中抗逆为溃疡病、黄龙病和耐盐性。

8.权利要求1所述的基因或权利要求2-4任一项所述的蛋白在生产抗逆转基因甜橙中的应用。