CN114716525B

CN114716525B - 一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其应用

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Publication number: CN114716525B
Application number: CN202210403495.7A
Authority: CN
Inventors: 李景滨; 孙颖; 周慧; 张无梦; 阮成江
Original assignee: Dalian Minzu University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2022-04-18
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-04-18
Also published as: CN114716525A

Abstract

本发明属于转录因子技术领域，公开了一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其应用。一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33，是具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还提供上述文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33编码的蛋白质，是具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还提供一对扩增文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的引物。是具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明还提供一对文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的过表达载体构建引物。是具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明提供的XsWRKY33基因对培育植物抗干热品种的转基因农作物，提高农作物的抗干热具有重要意义。

Description

一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其应用

技术领域

本发明属于转录因子技术领域，本发明涉及一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其应用。具体涉及一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其在培育植物抗干热品种能力方面的应用。

背景技术

文冠果(Xanthoceras sorbifolium)是一种无患子科、文冠果属于中国特有的木本油料植物。物种为大型的落叶灌木或小型的树种，树干和树枝上的树皮为红棕色，单数羽状复叶，互生，长圆形至披针形，总状花序，顶生或为腋生，花瓣一般为5，白色，内面有红紫色斑点，蒴果深绿色，种子呈球形状，棕褐色。花期4～5月，果期7～8月。全株植物中，其叶、花及种子皆可食用，种子亦可榨油。广泛分布于我国北部地区，这些地区属于典型的温带大陆性气候，气温年较差或气温日较差很大。春季升温快，秋季降温也快，降水量少，且降水季节和地区分布不均匀，蒸发量多、日照长、大气湿度低、霜期长以及风沙严重，因此文冠果对恶劣环境有优良的抗性且具有极强生命力。文冠果树有300年的寿命，有的甚至可以达到600年，既是园林绿化的宝贵资源，又是防风沙、防水土流失的优良植物。

转录因子(TF)，是一种DNA结合蛋白，它能与顺式作用元件发生特异性相互作用，从而影响基因的转录。当植物在遇到各种环境胁迫时，会激起多种防御机制来抵御不良环境，产生一系列的信息传递，使植物细胞对胁迫做出响应，提高植物抗逆性。在植物当中，与逆境胁迫相关的转录因子有：WRKY、MYB、TCP和bZIP等。

随着近年来对文冠果的深入研究，植物中WRKY转录因子功能已被陆续报道。研究表明，WRKY转录因子参与植物的生长发育过程、参与细胞形态建成及分化、调节激素分泌、环境因子的应答和抵御环境胁迫生理活动。干热胁迫引发的植物生理缺水严重影响植物生长发育和农作物产量。干热胁迫已成为制约我国农作物生长发育的瓶颈，弄清其抗干热机理，利用其抗干热基因改善作物的抗干热性能，具有重要的理论意义和现实意义。

目前，有关文冠果抗干热基因的研究尚少，但对于WRKY转录因子的基本结构及其在拟南芥、烟草及水稻、玉米、大豆等作物抗干热基因工程中应用的研究进展，为WRKY转录因子的利用及植物抗干热遗传改良及育种提供参考。

由于物种进化的特异性和相关基因在特定物种的局限性，很难在某些物种中筛选出更多的抗干热相关基因。且现有技术并未有报道WRKY转录因子在提高文冠果抗干热性方面的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其应用，本发明提供的XsWRKY33基因对培育植物抗干热品种的转基因农作物，提高农作物的抗干热具有重要意义。

本发明的第一个目的在于提供一种来源于文冠果的与抗干热有关的WRKY类转录因子XsWRKY33及其编码基因。本发明的第二个目的在于提供XsWRKY33转录因子及其基因在培育植物抗干热品种中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33，是具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供上述文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33编码的蛋白质，是具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供一对扩增文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的引物。是具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供一对文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的过表达载体构建引物。是具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种上述的文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33以及XsWRKY33编码的蛋白质在提高植物抗干热能力方面的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

本发明提供的XsWRKY33基因对培育抗干热品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义。本发明从辽冠8号文冠果品种中克隆出XsWRKY33基因，成功构建植物过表达载体，成功转化烟草，从干热处理后植物表型可以看出，干热胁迫明显抑制了野生型植株的生长，且株型明显小于转化植株，而转化植株虽然老叶萎蔫，但生长状况明显优于野生型植株，可见在烟草种异源表达XsWRKY33基因明显提高了植株对干热胁迫的耐受性。因此，本发明首次提出，并验证了XsWRKY33基因在烟草中的抗干热功能，丰富了培育强耐逆性作物的基因资源。

附图说明

图1是XsWRKY33基因保守结构域示意图。

图2是XsWRKY33基因与相关树种的多重序列对比图。

图3是XsWRKY33基因的系统发育树图。

图4是转基因烟草PCR检测图。

图5是干热处理后各植株过氧化物酶(POD)活性结果图。

图6是干热处理后各植株超氧化物歧化酶(SOD)活性结果图。

图7是干热处理后各植株丙二醛(MDA)含量结果图。

图8是干热处理后转XsWRKY33基因植株和对照植株的对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1

文冠果XsWRKY33基因的克隆

文冠果cDNA文库的构建与扩增

从辽宁朝阳品种名为辽冠8号的一棵文冠果树上获取种子，种子在25±5℃的黑暗中发芽约2周，培养至生根，然后将幼苗移栽到混合土壤盆中，在温室中生长。从1个月大的幼苗上切除新鲜的组织(根、茎和叶)，在液氮下保存，进行RNA提取。文冠果总RNA提取步骤如下：

S1.在液氮预冷的研钵中研磨文冠果样品，在研钵中不断续加液氮防止样品融化；

S2.将研磨好的样品加入到装有1mL TRIZOL的1.5mL无菌无酶离心管中，边加边称量，取样量为50-60mg，充分匀浆，室温静置5min；

S3.加入200μL氯仿，混匀，4℃，12000g离心15min；

S4.取上清液500μL加入到新离心管中，加入200μL氯仿，混匀，4℃，12000g离心15min；

S5.取上清液约500μL加入到新离心管中(如果沉淀依旧过多，可以再抽提一次)，加入500μL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

S6.4℃，12000g离心10min；

S7.弃上清，加入1mL 75％的乙醇(DEPC水配置)上轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g离心5min，弃上清；

S8.将管壁液体甩到管底，用移液器将液体去干净，通风橱中晾10-20min；

S9.加入适量的DEPC H₂O溶解沉淀(65℃促溶10-15min)。

按照PrimeScript RT master(Takara,中国大连)混合液中所述方法反转录成cDNA，然后用SYBR Premix Ex Taq II TaKaRa，中国大连)扩增所得cDNA。以上述cDNA为模板设计下述表1所示引物进行扩增。

表1XsWRKY33基因的PCR引物序列(SEQ ID NO.3)

在PCR管中配制下列混合液，反应体系如下表2所示：

表2PCR反应体系

轻轻混匀后离心，将各小管置于PCR仪上，设置反应程序为：94℃ 5min，1个cycle；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，共35个循环；72℃ 10min，1个cycle；产物于-20℃保存。

实施例2

pMD 19T-XsWRKY克隆载体的构建

XsWRKY33基因PCR产物回收纯化

S1.使用北京天根生化科技公司的TIANgel Maxi Purification Kit对XsWRKY33基因的PCR产物进行回收纯化，将回收纯化的目的片段稀释成50ng/μL，参照pMD 19T使用说明，构建下列表3所述连接体系：

表3PCR产物回收纯化连接体系

用移液枪轻柔混合均匀后，16℃连接12h。

XsWRKY33的序列分析

S2.使用生物信息学方法对其进行分析从NCBI数据库中检索XsWRKY33的同源序列，XsWRKY33基因含有一个1776bp开放阅读框并且编码591个氨基酸，并分析保守结构域(图1)。经ExPASy-ProtParam tool在线预测分析，XsWRKY33蛋白的相对分子质量65102.88，理论等电点(pI)为7.24，是中性蛋白。XsWRKY33蛋白的不稳定系数(Instability index)为63.65，属于不稳定蛋白质(<40，蛋白质稳定)；脂肪族系数(Aliphatic index)为47.19，总平均亲水系数(Grand average of hydropathicity)为-0.974，表明该蛋白是亲水蛋白，由19种氨基酸组成，分子式为Formula:C₂₇₉₁H₄₃₂₄N₈₃₂O₉₄₅S₁₄。利用BlastP下载与文冠果XsWRKY33蛋白序列相似的序列，利用软件BioEdit将文冠果XsWRKY33与其它植物的蛋白序列进行多序列比对(图2)。采用MEGA7软件和bootstrap构建和分析系统发育树(图3)，以评估其统计学可靠性。

实施例3

过表达载体pCAMBIA1300-XsWRKY33的构建

(1)pCAMBIA1300-mCherry质粒的提取与酶切

挑取于-80℃保存的含pCAMBIA1300-mCherry质粒的大肠杆菌DH5α并涂布于含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。挑取正常生长的单菌落溶于含有10μL无菌水200μL tube中，充分悬浮菌体，取5μL进行菌落PCR检测，将剩余的5mL菌悬液加入到含50mg/L Kan的液体LB培养基中，在37℃条件下200r/min振荡培养14～16h。

(2)目的片段与pCAMBIA1300-mCherry载体的连接

将酶切后的pCAMBIA1300-mCherry质粒与酶切后于-20℃保存的pMD 19-T-Simple切胶回收基因片段以及pCAMBIA1300-mCherry载体框架。根据表达载体酶切位点和基因的编码区序列设计下述表4所示引物(扩增引物分别带Kpn I和BamH I然后连入pMD 19-T-Simple)进行扩增。

表4XsWRKY33的过表达载体构建引物序列(SEQ ID NO.4)

说明：粗体为保护碱基，下划线为酶切位点

将回收纯化的目的片段稀释成50ng/μL，连接过表达载体pCAMBIA1300-mCherry时，用Kpn I和BamH I酶切T载和表达载体后，用T4连接酶进行目的基因与载体框架的连接，按列表5所示的反应体系反应：

表5目的基因与载体连接反应体系

用移液枪轻柔混合均匀后16℃连接14h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α在抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定。

实施例4.

农杆菌的转化

(1)农杆菌GV3101感受态的制备

①挑取于-80℃保存的农杆菌GV3101，并涂布于含100mg/L Rif和100mg/LStr的YEB固体培养基上，28℃条件下倒置培养18-20h；

②挑取正常生长的单菌落，接种至10mL含100mg/L Rif、100mg/L Str和50mg/LKan的液体YEB培养基中在28℃条件下200r/min振荡培养18h；

③取上述活化后的菌液0.5mL接种至含50mL YEB液体培养基的500mL锥形瓶中，在28℃条件下200r/min充分振荡培养至菌液OD600值为0.5；

④将菌液转移至50mL聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min，在4℃条件下4000r/min离心5min收集菌体沉淀；

⑤弃上清液，用4mL 20mmol/L新配置的CaCl₂轻柔的重悬菌体，在4℃条件下4000r/min离心5min收集菌体沉淀。

⑥弃上清液，用2mL 20mmol/L CaCl₂轻柔的重悬菌体，按每管100μL分装至冰上预冷的1.5mL tube中，菌体直接用于转化。

(2)农杆菌GV3101的转化与阳性菌株的筛选

①取1μL重组载体pCAMBIA1300-mCherry-XsWRKY加入GV3101感受态tube中，并于冰上静置30min；

②将tube置于浮漂上于液氮中速冻5min，随后立即取出并放入水浴锅中37℃热激5min；

③向热激后的感受态细胞中加入900μL预热至37℃的YEB液体培养基，在37℃条件下200r/min振荡培养2h后4000r/min离心5min；

④弃800μL上清液，将剩余液体和菌体沉淀充分重悬后涂布于含YEB固体筛选培养基上(100mg/L Rif+100mg/L Str+50mg/L Kan)，在28℃条件下倒置培养40-48h；挑取在YEB固体筛选培养基上正常生长的单菌落进行菌落PCR鉴定。

实施例5

烟草转化

S1.烟草苗消毒

在超净工作台上，先将烟草种子置于75％的乙醇中漂洗30s，然后移入含3％次氯酸钠溶液的烧杯中浸泡10分钟，浸泡结束后立即倒掉溶液并用无菌水充分漂洗种子4次，随后播种于含MS固体培养基的无菌培养皿上，用封口膜密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养2周；待烟草出苗后，单株移入含MS固体培养基的无菌组培瓶中培养3周。

S2.烟草苗预培养

在超净工作台上，将烟草叶片去叶柄，划伤边缘及叶表面并剪成1cm×1cm大小后置于含MS预培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH 6.0)的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养2d。

S3.农杆菌侵染液的制备

分别将含有XsWRKY33基因重组表达载体的农杆菌GV3101菌液加入到的YEB液体筛选培养基中，在28℃条件下200r/min摇床充分振荡培养18h用于活化菌种。随后取1mL活化后的农杆菌菌液转入50mL无抗生素的YEB液体培养基中，在28℃条件下200r/min摇床充分振荡培养至OD600值为0.5时用于侵染烟草叶片。

S4.共培养

将预培养后的叶片放入侵染液中，在100r/min条件下摇床振荡培养5min后立即取出并除净残液，然后置于含MS预培养基的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下黑暗共培养2-3d，在叶片切口处有微小菌斑出现即可。

S5.转化苗的筛选

将共培养烟草叶片置入含500mg/L Car的无菌水的烧杯中轻柔漂洗直至无絮状菌丝出现，随后用无菌滤纸吸干叶表面残余液体并置于含筛选培养基(MS培养基+500mg/LCar+50mg/L Kan，pH 6.0)的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养至分化出苗。

S6.继代和生根培养

选择生长点完好且在抗生素培养基上生长状态良好的芽，将其完整切下后移入1/2MS培养基中(1/2MS培养基+300mg/L Car+50mg/L Kan，pH 5.8)进行生根培养，3周后重新剪切生长点进行继代培养。

S7.转化烟草的分子检测

参照天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒方法提取未转化的野生型烟草(WT)和Kan筛选后的转化烟草的叶片基因组DNA，以上述基因组DNA为模板，利用文冠果XsWRKY33基因特异性引物进行扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳验证目的条带大小，有3个转基因株系扩增出与目的基因大小相同的条带，而WT植株无扩增条带，如图4所示，表明XsWRKY33基因已成功地转入烟草。

应用实验研究

实施例获得的转XsWRKY33基因烟草的生理分析；

转基因烟草抗干热性的生理鉴定；

以长势相同的转基因烟草和野生型对照组为材料，设置干热胁迫组和对照组，每组设置三个重复。干热胁迫组和对照组均浇水三天后做干热处理，在第8天时取烟草叶片测定POD、SOD活性及MDA含量。

转基因烟草的生理指标的测定；

在烟草叶片干热处理前后分别测定WT和转基因烟草植株中的生理指标。

(1)POD活性的测定

①选择干热处理前后的烟草叶片，用ddH₂O冲洗叶片；将同一部位的叶片组织剪成0.1g并置于液氮预冷研钵中，加入1mL的磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)，冰浴研磨成匀浆；

②将匀浆全部转移到转移至1.5mL的tube中，4℃条件下12000r/min离心10min；

③取20μL上清酶液移至新的tube中，依次加入200μL 2％H₂O₂、580μL磷酸缓冲液和200μL愈创木酚，在酶标仪上470nm处测定OD值，每次测量间隔30s，以每min内△OD₄₇₀值为0.01为一个酶活单位表示。按照POD活性(U/g FW)＝(△OD₄₇₀×V)/(W×a×0.01×t)，△OD₄₇₀为反应时间内OD值的变化，V为上清酶液体积，W为样品重量，t为反应时间。以接种前WT为1值，其它组的相对POD活性＝POD_其它组/POD_WT。

(2)SOD活性的测定

③分别取1.5mL tube作为测试管与对照管，按顺序加入500μL 0.05mol/L磷酸缓冲溶液、100μL 130mmol/L甲硫氨酸溶液、100μL 750μmol/L NBT溶液、100μL 100μmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液、100μL 20μmol/L核黄素溶液、80μL ddH₂O，向测定管中加入20μL酶提取液，而对照管用配置所用缓冲溶液代替。

④于日光灯下静置20min，然后立即避光，以对照管为0值，在酶标仪上测定560nm处的OD值；以抑制NBT光还原的50％为一个酶活单位，表示，按照SOD活性(U/g FW)＝(△OD₄₇₀CK-△OD₄₇₀)×V/(△OD₄₇₀CK×W×a×0.05)计算；△OD₄₇₀CK为对照管变化值，△OD₄₇₀为测定管变化值，V为上清酶液体积，a为取用酶体积，W为样品重量。以接种前WT为1值，其它组的相对SOD活性＝SOD_其它组/SOD_WT。

(3)丙二醛(MDA)的测定

①选择干热处理前后的烟草叶片，分别将两克冷冻组织用6.0mL的10％(v/v)三氯乙酸(TCA)匀浆，并在4℃下以12,000×g离心10分钟。

②将2mL上清液与2mL 0.67g/100mL硫代巴比妥酸(TBA)混合，在100℃下加热20分钟，然后立即在冰上冷却。

③以3000×g离心10分钟后，测量上清液在532nm处的吸光度，并从450nm和600nm处的非特异性吸光度中减去。MDA含量(nmol/gFW)＝[6.45×(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56×OD₄₅₀]×V_t×V_r/(V_s×m)，其中V_t、V_r和V_s分别为提取液的总体积、反应混合物溶液的总体积和所含提取液的体积在反应混合物溶液中，m是样品的质量。

通过上述实验，进一步了解相关的生理调控机制，进一步检测并分析了干热处理前后WT与转基因烟草植株中的POD、SOD和MDA的活性变化(图5、图6、图7)以及植株生长状况变化(图8)。POD、SOD是植物抗氧化系统中重要的保护酶，可以清除过多的ROS减少对细胞的损害。丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。在干热处理后，两种防御酶的活性均高于野生株系，而丙二醛含量则相反，均低于野生株系。根据干热处理前后的生理值的变化，两种防御酶活性的与烟草抗干热能力有着密切关系，说明XsWRKY33可通过改变POD、SOD的活性和MDA含量从而调控烟草植株对干热胁迫的抗性。从干热处理后植物表型可以看出，胁迫明显抑制了野生型植株的生长，且株型明显小于转化植株，而转化植株虽然老叶萎蔫，但生长状况明显优于野生型植株，可见在烟草种异源表达XsWRKY33明显提高了植株对干热胁迫的耐受性。

其中涉及到的简写说明如下：WT:wild type野生型；OE:overexpression过表达。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 大连民族大学

<120> 一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1776

<212> DNA/RNA

<213> 文冠果干热诱导转录因子(XsWRKY33)

<400> 2

atggcttctt cttcttcagg cagcttggac actttatcag ccaacaactt cactttctca 60

gcacaccctt tcatgcccac ttcttcttct tcagcatcct ccttcaccga cctcctcaat 120

caggaacccg acaccaccaa cacaacacgt ggtgggctat cggatcgtgt cgcggagaga 180

accaggtcag gtgtgcccaa gttcaagtcc atccaaccac cttcactgcc catctctcct 240

ccttctctct tctctccttc ctcttacttc tccatccctc ctggcctcag cccagctgag 300

ctcctcgact ctcctgtcct cctcagctca tccaacattt taccatctcc aacaactggg 360

tcatttccag cacaagcttt caattggagg aacaatccaa gcaatatttc acaacaacag 420

ctgcagcagc aacagagagt caaacaggaa gagaagaatt tctctgattt ctctttccag 480

acacagacaa ggccgaacac gatatcatca tcggctatgt ttcaaactgc acagcaacag 540

caaccatgga gctaccagga gtccacgaag caagattcaa taaagagctt ttctcctgag 600

atttcaacta tacaatcgaa caacaatcaa agcaataatg ggttccaatc agattttgga 660

aactacactc agcagactca gactcagact cagcctcaga cacaaacagt tagagagagc 720

aggaaatctg atgatgggta caattggaga aaatatggac aaaaacaagt gaaaggaagt 780

gaaaatccaa ggagttatta caagtgcaca ttcccaaatt gtccaaccaa gaagaaagtt 840

gagaggtcac tggatggaca gattacagag attgtttaca agggaagcca caaccatccc 900

aagcctcaat ccactaggcg atcatcgtct tcctcggttt gttctaatgc aattcagggg 960

tctagtcatc agactactac tattactaca ggggaggtcc cggatcagtc ctttgctagt 1020

agtactcatg gaagtgggca gatggactct gttgctaccc ccgaaaactc ctcgatctca 1080

gttggagacg atgactttga tcgcggatcg cagagaagta aatcgggtgg agatgattat 1140

gatgaagatg agcctgaggc caaaagatgg aaaattgagg gtgaaaatga aggaatttca 1200

gctcctggaa gtagaacagt gagagaacca agagttgtgg ttcaaaccac aagtgatatt 1260

gatattctag atgatggtta caggtggagg aagtatgggc agaaagtggt caaaggaaat 1320

ccaaatccaa ggagctacta caagtgtaca catccagggt gtccagtgag gaagcatgtt 1380

gagagagcat ctcatgatct aagagcagtg atcacaacct atgagggaaa acacaaccat 1440

gatgttccgg cagctcgcgg tagtggtagc cgatctatac cgctgcccga caaccacaac 1500

aatagcaaca acaacaacaa taacaatgca agcatggcga ttagggcaac ggctatgtct 1560

caatctcatc actcgaacaa cccccccacg gtcaatcctc atcgaaacgt gaggctacca 1620

tcatcggacg ggcaagcacc ctttacccta gagatgttgc aaagtccagg gggatttggt 1680

ttctcaggat tattggcaag tcctttggga tcatacatga atgaagccaa ggaagagcca 1740

agagatgaca tgttcttcga gtctctgcta tactga 1776

<210> 2

<211> 591

<212> PRT

<213> XsWRKY33氨基酸序列(XsWRKY33 氨基酸序列)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Ser Ser Gly Ser Leu Asp Thr Leu Ser Ala Asn Asn

1 5 10 15

Phe Thr Phe Ser Ala His Pro Phe Met Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Ser Phe Thr Asp Leu Leu Asn Gln Glu Pro Asp Thr Thr Asn Thr

35 40 45

Thr Arg Gly Gly Leu Ser Asp Arg Val Ala Glu Arg Thr Arg Ser Gly

50 55 60

Val Pro Lys Phe Lys Ser Ile Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Ser Pro

65 70 75 80

Pro Ser Leu Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Phe Ser Ile Pro Pro Gly Leu

85 90 95

Ser Pro Ala Glu Leu Leu Asp Ser Pro Val Leu Leu Ser Ser Ser Asn

100 105 110

Ile Leu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Ser Phe Pro Ala Gln Ala Phe Asn

115 120 125

Trp Arg Asn Asn Pro Ser Asn Ile Ser Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln

130 135 140

Gln Arg Val Lys Gln Glu Glu Lys Asn Phe Ser Asp Phe Ser Phe Gln

145 150 155 160

Thr Gln Thr Arg Pro Asn Thr Ile Ser Ser Ser Ala Met Phe Gln Thr

165 170 175

Ala Gln Gln Gln Gln Pro Trp Ser Tyr Gln Glu Ser Thr Lys Gln Asp

180 185 190

Ser Ile Lys Ser Phe Ser Pro Glu Ile Ser Thr Ile Gln Ser Asn Asn

195 200 205

Asn Gln Ser Asn Asn Gly Phe Gln Ser Asp Phe Gly Asn Tyr Thr Gln

210 215 220

Gln Thr Gln Thr Gln Thr Gln Pro Gln Thr Gln Thr Val Arg Glu Ser

225 230 235 240

Arg Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln

245 250 255

Val Lys Gly Ser Glu Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Phe Pro

260 265 270

Asn Cys Pro Thr Lys Lys Lys Val Glu Arg Ser Leu Asp Gly Gln Ile

275 280 285

Thr Glu Ile Val Tyr Lys Gly Ser His Asn His Pro Lys Pro Gln Ser

290 295 300

Thr Arg Arg Ser Ser Ser Ser Ser Val Cys Ser Asn Ala Ile Gln Gly

305 310 315 320

Ser Ser His Gln Thr Thr Thr Ile Thr Thr Gly Glu Val Pro Asp Gln

325 330 335

Ser Phe Ala Ser Ser Thr His Gly Ser Gly Gln Met Asp Ser Val Ala

340 345 350

Thr Pro Glu Asn Ser Ser Ile Ser Val Gly Asp Asp Asp Phe Asp Arg

355 360 365

Gly Ser Gln Arg Ser Lys Ser Gly Gly Asp Asp Tyr Asp Glu Asp Glu

370 375 380

Pro Glu Ala Lys Arg Trp Lys Ile Glu Gly Glu Asn Glu Gly Ile Ser

385 390 395 400

Ala Pro Gly Ser Arg Thr Val Arg Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr

405 410 415

Thr Ser Asp Ile Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr

420 425 430

Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys

435 440 445

Cys Thr His Pro Gly Cys Pro Val Arg Lys His Val Glu Arg Ala Ser

450 455 460

His Asp Leu Arg Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His

465 470 475 480

Asp Val Pro Ala Ala Arg Gly Ser Gly Ser Arg Ser Ile Pro Leu Pro

485 490 495

Asp Asn His Asn Asn Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ala Ser Met

500 505 510

Ala Ile Arg Ala Thr Ala Met Ser Gln Ser His His Ser Asn Asn Pro

515 520 525

Pro Thr Val Asn Pro His Arg Asn Val Arg Leu Pro Ser Ser Asp Gly

530 535 540

Gln Ala Pro Phe Thr Leu Glu Met Leu Gln Ser Pro Gly Gly Phe Gly

545 550 555 560

Phe Ser Gly Leu Leu Ala Ser Pro Leu Gly Ser Tyr Met Asn Glu Ala

565 570 575

Lys Glu Glu Pro Arg Asp Asp Met Phe Phe Glu Ser Leu Leu Tyr

580 585 590

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 扩增文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33 正向引物(扩增文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33 FP )

<400> 3

Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr

1 5 10 15

Cys Ala Gly Gly Cys

20

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 扩增文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33 反向引物(扩增文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33 RP )

<400> 4

Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys

1 5 10 15

Thr Cys Gly Ala Ala Gly

20

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的过表达载体构建正向引物(文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的过表达载体构建引物 FP )

<400> 5

Cys Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys

1 5 10 15

Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys

20 25

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> 文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的过表达载体构建反向引物(文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的过表达载体构建引物 RP )

<400> 6

Cys Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala

1 5 10 15

Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Gly Ala

20 25

Claims

1.一种文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33，其特征是，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2. 一种如权利要求1所述的文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33编码的蛋白质，其特征是，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1-2任一项所述的文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33在提高植物抗干热能力方面的应用。

4. 一种用于扩增如权利要求1-3所述的文冠果干热诱导转录因子XsWRKY33的引物，其特征是，引物序列具体如下所示：

FP：CGGGTACCATGGCTTCTTCTTCTTCAGGC

RP：CGGGATCCTCAGTATAGCAGAGACTCGA 。