CN1800212A - 一个麻疯树冷诱导转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个麻疯树冷诱导转录因子及其编码基因与应用，其目的是提供一个麻疯树冷诱导转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。该转录因子是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。通过转基因技术，将本发明的基因导入植物宿主，可得到抗干旱、高盐等逆境胁迫能力增强的转基因植物(作物)，对于培育抗逆性提高的作物新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。

Description

一个麻疯树冷诱导转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及及一个来源于EREBP/AP2家族的麻疯树冷诱导转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。

背景技术

不良的自然环境如低温、高温、干旱、盐渍等作用于植物，将会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。各种胁迫中，干旱、盐碱、冷(冻)害对植物的影响尤为突出，是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。尽快和有效地利用基因工程来改良作物干旱、高盐及低温耐性，尽量避免或减轻不良环境因素的危害，是当前生物和现代农业技术领域的研究热点，也是当今我国以及世界农业急需解决的重大课题。植物对胁迫的抵抗或忍耐能力称为抗逆性，是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性。多年来，人们从各个角度对植物与高盐胁迫之间的关系进行了研究。从最初的生理现象的研究到生态、遗传的研究，再到生理生化、代谢的研究，已积累了丰富的资料。特别是随着分子生物学的发展，使人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐性机理，并且为利用基因工程手段改良植物抗盐胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，通过基因过程手段改良植物的抗逆性开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因子。过去，克隆和应用的主要是单一的功能基因，如甜菜碱合成酶基因和脯氨酸合成酶基因等，虽然取得了一定的效果，但植物的抗逆性没有得到全面的提高。

植物抗逆性受多基因控制，要使众多对植物抗逆性状产生影响的功能基因充分表达和发挥作用，才能有效地改良植物抗逆性。随着生物技术的不断发展，研究重点已从一般的功能基因转向各种专一性或高效性的调控因子(如启动子和转录因子)。由于一个转录因子可以调控植物中多个与抗逆性相关基因的表达，增强一个转录因子的作用，就可使植株抗逆性状获得综合改良。

发明内容

本发明的目的是提供一个受低温诱导表达的麻疯树EREBP/AP2家族的转录因子。

本发明所提供的冷诱导转录因子，名称为JcDREB，来源于麻疯树(Tatrophacurcas)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由256个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第58位-第115位氨基酸残基为保守的EREBP/AP2结构域，自氨基端第116位-第256位氨基酸残基为酸性活化区域。

编码麻疯树冷诱导转录因子JcDREB的基因(JcDREB)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃条件下杂交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由768个碱基组成，其编码序列为自5’端第1位-第768位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第174位-第345位碱基编码保守的EREBP/AP2结构域，自5’端第346位-第768位碱基编码酸性活化区域。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增JcDREB中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。

本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码所述麻疯树冷诱导转录因子JcDREB的基因导入植物组织或细胞，得到抗逆性提高的植物。

所述麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB可通过含有所述麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如p3301-BI121、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。

使用JcDREB构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

以p3301-BI121为出发载体，构建的含有所述麻疯树冷诱导转录因子JcDREB基因的植物表达载体为p3301-BI121-JcDREB。

携带有本发明基因JcDREB的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻疯树或拟南芥等植物。

本发明提供了一个来源于EREBP/AP2家族的麻疯树冷诱导转录因子JcDREB及其编码基因。实验证明，其编码基因JcDREB受低温诱导表达，可调控植物抵抗干旱、低温及盐碱等逆境胁迫的能力，从而显著提高植物的抗逆性。JcDREB及其编码基因对于培育抗逆性提高的麻疯树及其它作物新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。本发明在农业领域具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为经低温胁迫处理的麻疯树幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为3’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4为PCP扩增的JcDREB全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图5为的JcDREB全长cDNA的结构示意图

图6为JcDREB与植物中其它已克隆的ERF类蛋白氨基酸序列的同源性分析结果

图7为JcDREB与植物中其它已克隆的ERF类蛋白氨基酸序列的系统进化树分析结果

图8为JcDREB的结构域及结构预测结果

图9为JcDREB基因组DNA的结构分析结果

图10为Southern杂交分析麻疯树基因组中JcDREB同源基因的结果

图11为JcDREB基因的组织特异性表达分析结果

图12为JcDREB在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析结果

图13为载体p3301-BI121-JcDREB的构建示意图

图14为载体p3301-BI121-JcDREB的酶切鉴定结果

图15为载体p3301-BI121-JcDREB的PCR鉴定结果

图16为水稻植株再生体系的建立过程

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。

实施例1、麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB cDNA全序列的获得

麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB全长cDNA序列的获得包括以下步骤：

一、麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB 3’端序列的克隆

1、植物材料处理及总RNA的提取

先以麻疯树幼苗为材料，4℃低温处理12小时后提取总RNA，对其进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，所提取的总RNA有2条明显的电泳条带，从上到下分别为28s RNA和18s RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB 3’端序列的克隆

比较现已公开的DREB的氨基酸残基序列，寻找保守区域，并根据保守区域序列设计一对简并引物，引物序列如下：

JC1：5’-GC(A/G/T)GCTCG(T/G)GC(T/G/C)CA(C/T)GACGT(G/C)GC(G/C)GC-3’

JC2：5’-GCTGCT(T/C)(T/G)AGC(T/A)(T/C)ATGATG(A/T)TGCTGC-3’

以步骤1提取的经冷处理的麻疯树幼苗RNA为模板，用Plant RNAtrip ReagentKit2试剂盒(购自北京普利来基因有限公司)并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，反应体系及条件为：oligodT(10uM)1ul，DEPC-treated Water 10ul，RNA 2ul，5×AMV缓冲液4ul，dNTP(10mM)2ul，AMV 1ul，42℃反应1小时。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

再以获得的第一链cDNA为模板，两条简并引物分别与dT-Adaptor引物配对进行套式PCR扩增，PCR反应体系为：引物1ul，dT primer 1ul，模板cDNA 2ul，10×Taq缓冲液2ul，dNTP(10mM)2ul，Taq(2.5U/ul)0.2ul，水11.8ul，反应条件为：先94℃5min；然后94℃230s，57℃30s，72℃50s，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为3’RACE产物)，经PCR扩增获得了长度约800bp的目的片段。回收并纯化3’RACE产物，连接入pMD-18T载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆提质粒，得到含有3’UTR的重组质粒，分别命名为pMD18-3’Jc-DREB，对其测序并对测序结果进行BLAST分析，结果该片段长度为813bp，具有序列表中SEQ ID№：3的核苷酸序列，与植物中已知的ERF类基因的3′端序列具有较高的同源性，表明该片段可能为麻疯树AP2类DNA结合蛋白基因的3′端序列。

二、麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB 5’端序列的克隆

根据步骤一获得的JcDREB 3’端cDNA序列设计一对巢式引物：JcDREB-5-gsp1和JcDREB-5-gsp2，序列如下：

JcDREB-5-gsp1：5’-ACCGTACACGACTCTGGCTT-3’

JcDREB-5-gsp2：5’-AACCTCCGCCACCAAGGGTC-3’

以步骤一提取的经冷处理的麻疯树幼苗RNA为模板，采用Invitrogen公司的5’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，反应体系及条件为：RNA10ul，引物JcDREB-5-gsp11ul，水4.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgCl₂2.5μl，10mM dNTP 1.0μl，DTT 2.5μl，42℃反应1小时。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

再以获得的第一链cDNA为模板，在上述巢式引物JcDREB-5-gsp2的引导下进行套式PCR扩增，PCR反应体系为：引物JcDREB-5-gsp21ul，水4.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgCl₂2.5μl，10mM dNTP 1.0μl，DTT 2.5μl，第一链cDNA 1ul，反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，57℃30s，72℃50s，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为5’RACE产物)，经PCR扩增获得了长度约600bp的目的片段。回收并纯化5’RACE产物，连接入pMD-18T载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆提质粒，得到含有5’UTR的重组质粒，分别命名为pMD-5’JcDREB，对其测序并对测序结果进行BLAST分析，结果该片段长度为507bp，具有序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列，与上述3’RACE片段有323bp的重叠区，序列分析结果显示该片段与植物中已知的DREB2类基因的5′端具有较高的同源性，表明该片段可能为麻疯树DREB类DNA结合蛋白基因的5′端序列。

三、麻疯树冷诱导转录因子基因JcDREB全长cDNA序列的获得及PCR检测

利用步骤一和步骤一获得的长度为813bp和507bp片段之间的重叠区，借助DNA软件DNAMAM拼接得到JcDREB的全长cDNA序列。该序列具有序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №：2由768个碱基组成，其编码序列为自5’端第1位-第768位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №：1由256个氨基酸残基组成。根据全长cDNA序列读码框(open reading frame，ORF)的两端序列设计全长引物，引物序列如下：

JcDREBW-1：5’-GGACTCAGATAGTTGCTCCA-3’

JcDREBW-2：5’-TGATTGGGCTTCTCTTTTATCTTCTTAG-3’

以步骤一经冷处理的麻疯树幼苗RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，在引物JcDREBW-1和JcDREBW-2的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为PCR扩增产物)，结果PCR扩增出长度约为768bp的特异片段，对其进行测序，测序结果和上述拼接结果在扩增部分完全相同，其全长为768bp，表明所克隆的3′RACE片段和5′RACE片段属于同一基因，将该基因命名为JcDREB，将其编码蛋白命名为JcDREB。

实施例2、JcDREB及其编码蛋白的生物信息学分析

一、JcDREB基因的序列分析及其编码蛋白的结构功能预测

利用DNAMAN软件对实施例1获得的JcDREB的全长cDNA序列进行生物信息学分析，其结构示意图如图5所示(单线表示3’-UTR；方框表示开放阅读框，含有2个功能基序，黑色方框表示AP2结构域，右侧阴影线表示酸性活化区域)，该序列全长768bp，自5’端第1位-第768位碱基为ORF，编码由256个氨基酸残基组成的蛋白质，推测其分子量为31.731kDa，等电点pI值9.37。利用SMART工具对推断的氨基酸残基序列进行功能预测，结果该蛋白含有一个典型的EREBP/AP2结构域，即序列表中SEQ ID №：1自氨基端(N端)第58位-第115位氨基酸残基，该结构域由58个氨基酸残基组成。另外，该蛋白的C-端存在一个典型的酸性活化区域(acidicactivation region；AAR)，序列表中SEQ ID №：1自氨基端第116位-第256位氨基酸残基，该区域可能有利于该基因转录。上述分析结果表明JcDREB是一种转录因子，属于AP2蛋白家族。

二、JcDREB与植物中其它已克隆的DREB2类蛋白编码氨基酸序列的同源性及系统进化树分析

利用DNAMAN软件对JcDREB与植物中其它已克隆的ERF类蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为：AAF76898菠菜；AA013360西红柿；NP 177931拟南芥；ABB89755构树；AAT39542陆地棉；AAZ03388大豆；AAQ57226大豆；ABB89754芦笋；AAM80486玉米；AAZ08560小麦；XP_467836水稻；AAZ14831麻疯树)进行同源性分析和系统进化树分析，同源性分析结果如图6所示，JcDREB与单子叶植物水稻、小麦DREB类蛋白的同源性分别为：28.07％、27.01％，其与双子叶植物菠菜、西红柿、拟南芥、棉花蛋白的同源性分别为：56.13％、45.07％、37.14％和35.62％，表明JcDREB与单子叶植物DREB类蛋白的同源性非常低，而与双子叶植物中的蛋白同源性较高。系统进化树分析结果如图7所示，从单子叶植物中分离的DREB2类蛋白与从单子叶植物中的分离的该类蛋白的同源性非常低，约为27％，表明DREB类蛋白在进化过程中出现了较大的差异，但在每一类植物中该蛋白相对比较保守。

三、JcDREB的结构域及结构预测

用SMART服务器(http：//coot.embl-heidelberg.de/SMART/)分析JcDREB的结构域，分析结果如图8中图A所示，在由256个氨基酸残基组成的蛋白质序列中，自氨基端第58位-第115位氨基酸残基为典型的EREBP/AP2结麻疯域，表明它是EREBP/AP2家族中的一员。用CPHmodels-2.0服务器(http：//genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2_0Server-3D.htm)预测JcDREB的蛋白质结构，结果如图8中的图B所示，结果JcDREB含有一个典型的α螺旋和三个β折叠结构。

实施例3、JcDREB基因组DNA的结构分析

提取实施例1中经冷处理的麻疯树幼苗的基因组DNA并以此为模板，在引物JcDREBW-1和和JcDREBW-2的引导下，进行PCR扩增分析JcDREB基因的结构，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9所示(泳道M为分子量标准Marker III，泳道1为PCR扩增产物)，结果PCR扩增出长度约800bp的特异条带。再以JcDREB的cDNA为模板，用上述相同的引物进行PCR扩增，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9所示(泳道M为分子量标准Marker III，泳道2为PCR扩增产物)，同样扩增出长度约800bp的特异条带。进一步对上述两种特异片段进行克隆和测序，测序结果表明JcDREB的基因组序列和对应的cDNA序列完全相同，表明在该基因内部不含有内含子。

实施例4、JcDREB同源基因分析

提取实施例1中经冷处理的麻疯树幼苗的基因组DNA，分别用XbaI、BamHI、Hind III和EcoRI四种限制性内切酶酶解，以Digoxigenin标记的JcDREB cDNA为探针进行Southern杂交检测，检测结果如图10所示，表明JcDREB是一个单拷贝基因。

实施例5、JcDREB基因的组织特异性表达分析

分析JcDREB的组织特异性表达模式，具体实验方法为：分别提取实施例1中经冷处理的麻疯树幼苗的根、茎、叶三种组织的总RNA，利用全长引物JcDREBW-1和JcDREBW-2进行RT-PCR分析。以Actin基因作为内标，对所有cDNA模板进行半定量。反应结束后，对RT-PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示(泳道M为分子量标准Marker III，R：根，S：茎，L：叶)，表明JcDREB在三种组织中的表达存在差异，以根中的表达量为最低，在茎和叶中的表达量较高。

实施例6、JcDREB在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

分析JcDREB在转录水平与一些不同非生物胁迫因子的关系，具体实验方法为：将正常生长2周的麻疯树幼苗分别进行不同时间(0、0.5、3.0、6.0、12.0、24h)的低温(4℃)、高盐(200mM NaCl)、干旱(20％PEG)及脱落酸ABA(100μM)胁迫处理。分批取材后，提取总RNA，先用Nortern Blot方法分析JcDREB在各种胁迫条件下的表达模式，结果如图12所示(EB染色的rRNA表示每条泳道的上样量相同；Actin基因作为内标，对cDNA模板进行半定量)，该基因在不同胁迫条件下表达丰度有差异，仅在低温胁迫条件下杂交信号比较明显(图12中A图)，其它处理均无杂交信号。为分析JcDREB在其它逆境条件下的表达模式，再用RT-PCR方法分析其它几种胁迫条件下JcDREB的表达模式(见图12中的B-D图)，RT-PCR结果表明JcDREB在转录水平明显受低温诱导，低温处理0.5h后就出现杂交信号，随着处理时间的加长，表达量迅速增加，到12h达到最大值，之后表达水平逐渐降低，到24h又恢复到原初的表达水平。在PEG的诱导下，该基因一开始呈现出微弱的上升趋势，12h后呈下降趋势(见图12中的图B)。ABA的处理不影响JcDREB在转录水平的表达(见图12中的图C)。而在高盐诱导条件下，该基因的表达一直呈现出下降趋势。

实施例7、JcDREB转基因水稻的获得

一、JcDREB植物表达载体的构建

将实施例1获得的JcDREB克隆入载体pMD18-T(TaKaRa公司)的EcoRV酶切位点之间，得到携带有JcDREB的重组载体，命名为pMD18-JcDREB。对pMD18-JcDREB用限制性内切酶Xba I进行单酶切，补平，然后自连，从而去掉pMD18-JcDREB上的XbaI酶切位点，再用Sal I和Sac I双酶切该载体，获得一条长度约为800bp的含有JcDREB的小片断。用Sal I和Sac I双酶切质粒pGEX-KG(购自北京泛基诺基因组生物公司)，由于pGEX-KG上有限制性内切酶Sal I和Sac I识别位点，且只相距6bp，故切下的小片断在琼脂糖凝胶电泳中显现不出来，所以只有一条和原来大小几乎相等的条带，将其与从上述pMD18-JcDREB切下的长度约为800bp的小片断相连，获得一重组质粒，命名为pGEX-KG-JcDREB。用Xba I和Sac I双酶切质粒pGEX-KG-JcDREB和植物表达载体p3301-BI121(购自CAMBIA)，将从质粒pGEX-KG-JcDREB上切下的800bp含有JcDREB的小片段与从质粒p3301-BI121上切下的11.4kb的大片断相连，即构建成含有JcDREB完整读码框架的高效植物双元表达载体，命名为p3301-BI121-JcDREB，其构建过程如图13所示。对构建好的植物表达载体p3301-BI121-JcDREB用Xba I和SacI进行双酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图14所示(泳道M为MarkerIII，泳道1为酶切产物)，经酶切获得一条800bp的条带，表明目的片段已正确连接入植物表达载体中。再以p3301-BI121-JcDREB质粒为模板，利用JcDREB特异性引物JcDREBW-1和JcDREBW-2进行PCR检测，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图15所示(泳道M为MarkerIII，泳道1为PCR产物)，PCR扩增出一条800bp的条带，进一步证明JcDREB基因片段已正确连接到载体中，获得了插入序列及位置正确的JcDREB植物表达载体。

二、水稻植株再生体系的建立及筛选剂和筛选浓度的确定

消毒后的水稻种子在N₆D培养基(Chu，C.C，C.S.Wang，C.C.Sun，C.Hsu，K.C.Yin，C.Y.Chu.1975.Establishment of an efficient medium ofr anther culture of ricethrough comparative experiments on the nitrogen sources.Sci.Sinica，18：659-668)上黑暗培养2天后开始发芽(见图16中的图A和图A1)，5天后开始有愈伤组织出现，2周后，将愈伤组织切下，挑选其中白色或淡黄色的致密而没有水化的小块(见图16中的图B和图B1)，将其分成直径为3-5mm的小颗粒置于分化培养基(Hiei，Y.S.Ohta，T.Komari and T.Kumashiro.1994.Efficient transformationof rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA.Plan J.6：271-282)上进行分化培养，15天继代一次，30-40天后，个别状态好的愈伤组织块上出现绿色细胞团，并由此发育为完整植株(见图16中的图C和图C1)。

将水稻水稻愈伤组织分别接种含100mg/L卡那霉素、(25mg/L、50mg/L)潮霉素、(5mg/L、10mg/L)ppt的分化培养基中进行抗生素敏感性实验，结果三种筛选剂中，卡那霉素对水稻愈伤组织生长的抑制作用较弱，在卡那霉素浓度为100mg/L的培养基上，没有明显观察到水稻愈伤组织的生长受到抑制，也没有出现褐化现象。然而，水稻愈伤组织对潮霉素比较敏感，在含有潮霉素的培养基上培养，10天后观察，其中的愈伤组织块明显比对照没有加抗生素的要小，而且在潮霉素浓度为50mg/L的培养基上，一些愈伤组织开始褐化，2周后，在潮霉素浓度为25mg/L的培养基上也出现褐化的愈伤组织，而在潮霉素浓度为50mg/L的培养基上，褐化的愈伤组织达到40％。水稻愈伤组织对ppt也比较敏感，在ppt浓度为10mg/L的培养基上，10天后，愈伤组织开始褐化，20天后，褐化愈伤组织达到50％，在ppt浓度为5mg/L的培养基上，15天后，愈伤组织开始褐化，20天后，褐化愈伤组织达到30％。上述实验结果表明水稻抗性愈伤组织的筛选采用含25-50mg/L的潮霉素或5-10mg/L的ppt比较合适。

三、JcDREB转基因水稻的获得

将步骤一构建的植物表达载体p3301-BI121-JcDREB通过冻融法导入农杆菌EHA105中，筛选阳性重组子。水稻种子在N₆D培养基上黑暗培养2周后，切下愈伤组织，挑选其中白色或淡黄色的致密而没有水化的小块，用转化有质粒p3301-BI121-JcDREB的农杆菌EHA105阳性重组菌菌液侵染，将侵染后的愈伤组织接种于N₆D培养基上25-28℃下暗培养，3天后，愈伤组织周围出现菌落，洗净愈伤组织，然后转接到ppt浓度为5mg/L的分化培养基上筛选，15天后，少量愈伤组织开始褐化，然后再将愈伤组织转接到ppt浓度为10mg/L的分化培养基上筛选，直到褐化愈伤组织死亡，取出未褐化的具有抗性的愈伤组织，置于无菌滤纸上，25-28℃干燥培养2天，经干燥后的愈伤组织脱水皱缩，再将其转入分化培养基，2天后，皱缩的愈伤组织恢复，15天后，愈伤组织表面出现绿色芽点，待小芽长至5cm时转入生根培养基MS₀上生根。待幼苗长至8-10cm左右时，其根系已比较发达，打开三角瓶封口膜进行温室移栽前的驯化练苗，3天后，将这些苗移栽到温室，对转基因植株进行检测，结果共获得阳性转基因植株15株。

实施例8、JcDREB转基因水稻的抗逆性实验

将野生型水稻种子(对照)和实施例7获得的JcDREB转基因水稻种子分别播种于1/4MS和含10mg/L ppt的抗性平板上，使其萌发，在抗性平板上生长两周后，将幼苗载入土中，在室温中培养两周后进行4℃胁迫处理。两周后观察表型，并将上述供测植株从培养土中取出，取地上部分测鲜重、干重，同时，取上述植物材料在70℃烘烤至恒重后称干重。

结果转基因水稻幼苗经4℃处理四天都没有冻害现象，而对照出现了黄叶。两周后转基因水稻的鲜重和干重均比对照重，呈显著关系。上述实验结果表明本发明的JcDREB可以增强植物的耐低温能力，从而可作为植物耐冷基因工程的侯选基因加以应用，用来改良植物的抗冷性状。

                                序列表

<160>4

<210>1

<211>256

<212>PRT

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>1

Met Ser Tyr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Leu

1               5                   10                  15

Pro Glu Ser Lys Trp Ile Gln Phe Pro Glu Phe Pro His Pro Lys Pro

            20                  25                  30

Thr Trp Leu Asn Phe Leu Gly Pro Lys Pro Val Pro Met Lys Gln Val

        35                  40                  45

Gly Ser Pro Pro Lys Pro Thr Lys Leu Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg

    50                  55                  60

His Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Pro Lys Ash Arg Thr

65                  70                  75                  80

Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala

                85                  90                  95

Tyr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Leu Arg Gly Asp Phe Ala Arg Leu Asn

            100                 105                 110

Phe Pro Asn Leu Arg His Gln Gly Ser His Ile Glu Gly Ser Phe Gly

        115                 120                 125

Glu Tyr Lys Pro Leu His Ser Ser Val Asp Ala Lys Leu Gin Ala Ile

    130                 135                 140

Cys Gln Ser Leu Ala Glu Ser Gln Lys Gln Gly Gly Lys Ala Glu Lys

145                 150                 155                 160

Gln Ser Asn Ser Ser Ala Lys Lys Lys Thr Ser Val Gly Thr Thr Pro

                165                 170                 175

Ala Thr Ala Glu Lys Val Lys Glu Ala Lys Ala Pro Gln Gln Val Val

            180                 185                 190

Pro Asp Lys Cys Cys Lys Val Glu Thr Pro Ser Ser Val Leu Thr Glu

       195                 200                 205

Ser Glu Ala Ser Gly Gly Ser Ser Pro Leu Ser Asp Leu Thr Phe Pro

    210                 215                 220

Asp Leu Glu Glu Ala Pro Leu Asp Val Asp Ser Gly Asn Phe Asn Leu

225                 230                 235                 240

Glu Lys Tyr Pro Ser Tyr Glu Ile Asp Trp Ala Ser Leu Leu Ser Ser

                245                 250                 255

<210>2

<211>768

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>2

atgtcttact ccaacccaga tccaccagat ccagacccaa atccattacc agaatcaaaa         60

tggattcaat ttccagaatt tccacaccca aaaccaacat ggcttaactt tttaggtccg        120

aaacccgtgc ccatgaagca ggtgggttca ccaccaaaac ccactaagct ctacagagga        180

gtaaggcagc gacattgggg caaatgggtt gccgagatcc gactacccaa gaaccgtaca        240

cgactctggc ttggtacttt tgacacagca gaagaagccg ctttagctta tgacaaagcg        300

gcgtacaaac tccgtggcga cttcgcgaga cttaacttcc ctaacctccg ccaccaaggg        360

tcccacattg aaggcagctt cggcgagtat aagcctctcc attcctcggt cgatgcgaaa        420

ctgcaagcta tttgtcaaag cttagcagaa tcgcagaaac aaggaggaaa agcagagaag        480

caatcaaact cgtcagcgaa aaagaagact tcggtgggga ctactccagc gacggcggag        540

aaggttaagg aagctaaggc accgcaacag gttgttccgg acaagtgttg caaggtcgag        600

acaccatcgt cagtgttgac agaaagtgaa gcctctggcg gatcttcacc gttgtcggat        660

cttacgtttc cggatctaga agaggcacca ttggatgttg attctggaaa ttttaatttg        720

gagaagtacc catcttatga aattgattgg gcttctcttt tatcttct                     768

<210>3

<211>813

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>3

tttccacacc caaaaccaac atggcttaac tttttaggtc cgaaacccgt gcccatgaag         60

caggtgggtt caccaccaaa acccactaag ctctacagag gagtaaggca gcgacattgg        120

ggcaaatggg ttgccgagat ccgactaccc aagaaccgta cacgactctg gcttggtact        180

tttgacacag cagaagaagc cgctttagct tatgacaaag cggcgtacaa actccgtggc        240

gacttcgcga gacttaactt ccctaacctc cgccaccaag ggtcccacat tgaaggcagc        300

ttcggcgagt ataagcctct ccattcctcg gtcgatgcga aactgcaagc tatttgtcaa        360

agcttagcag aatcgcagaa acaaggagga aaagcagaga agcaatcaaa ctcgtcagcg        420

aaaaagaaga cttcggtggg gactactcca gcgacggcgg agaaggttaa ggaagctaag        480

gcaccgcaac aggttgttcc ggacaagtgt tgcaaggtcg agacaccatc gtcagtgttg        540

acagaaagtg aagcctctgg cggatcttca ccgttgtcgg atcttacgtt tccggatcta        600

gaagaggcac cattggatgt tgattctgga aattttaatt tggagaagta cccatcttat        660

gaaattgatt gggcttctct tttatcttct tagatttggt tatgttatgt tatttatctt        720

ttatctttat tttgcagtta tgtttagttc ttaggcgtgt ggttgctgca atgagttttt        780

ggcagttgca gagccaaaaa aaaaaaaaaa aaa                                     813

<210>4

<211>507

<212>DNA

<213>麻疯树(Jatropha curcas)

<400>4

tctgatctag aggtaccgga tccttttttt tttttttttt atcatcttac tccaacccag         60

atccaccaga tccagaccca aatccattac cagaatcaaa atggattcaa tttccagaat        120

ttccacaccc aaaaccaaca tggccttaac tttttaggtc cgaaacccgt gcccatgaag        180

caggtgggtt caccaccaaa acccactaag ctctacagag gagtaaggca gcgacattgg        240

ggcaaatggg ttgccgagat ccgactaccc aagaaccgta cacgactctg gcttggtact        300

tttgacacag cagaagaagc cgctttagct tatgacaaag cggcgtacaa actccgtggc        360

gacttcgcgt gacttaactt ccctaacctc cgccaccaag ggtcccacat tgaaggcagc        420

ttcggcgagt ataagcctct ccattcctcg gtcgatgcga aactgcaagc tatttgtcaa        480

agcttagcag aatcgcagaa acaagga                                            507

Claims (10)

1、麻疯树冷诱导转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的麻疯树冷诱导转录因子，其特征在于：所述蛋白具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

3、编码权利要求1所述的麻疯树冷诱导转录因子的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、根据权利要求3所述的麻疯树冷诱导转录因子的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

6、一种提高植物耐逆性的方法，是将权利要求3所述的麻疯树冷诱导转录因子基因导入植物组织或细胞，得到耐逆性提高的植物。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述麻疯树冷诱导转录因子基因通过含有所述麻疯树冷诱导转录因子基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建所述植物表达载体的出发载体为p3301-BI121、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为p3301-BI121-JcDREB。

10、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物宿主为水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻疯树或拟南芥。

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