CN102094005B - 一种源于普通小麦ap2/erf家族的抗冻转录因子及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子及其制备方法与应用。所述普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子为TaERF-B3基因，其碱基序列为SEQ ID No 1，其蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No 2。本发明利用聚合酶扩增技术从普通小麦幼苗中克隆普通小麦AP2/ERF家族转录因子基因序列，所获得的转录因子基因用于植物转化，培育提高植物抗逆性。

Description

一种源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及作物遗传育种领域，具体涉及一种源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子及其制备方法与应用。 

背景技术

小麦是我国重要的粮食作物之一，改良其产量和品质对确保我国农业持续稳定的发展具有十分重要的战略意义。小麦的一生处于多种非生物胁迫之中，如干旱、高盐和极端温度等逆境，这些胁迫都对植物生长发育产生不利的影响而最终影响其产量和品质【杨献光等，麦类作物学报，2006，26(6)：158-161】。通过提高单产或扩大种植面积等途径增加小麦产量都面临克服逆境限制或减轻逆境危害的问题。因此，认识小麦对逆境的反应机制，提高小麦的抗逆性，已成为小麦进一步增产增收的重要基础。 

转录因子(Transcription factor)又称反式作用因子，是和专一性DNA序列结合并激活或抑制其他功能基因转录的蛋白质分子。近年来，相继分离出大量不同类型的转录因子，根据转录因子保守DNA结合域的不同，可分为十几类家族，如：AP2/ERF、bZIP、WRKY和MYB等【Allen等，The EMBOJournal，1998，17(18)：5484-5496】。很多转录因子涉及到植物逆境抗性，AP2/ERF是其中重要的一个家族。AP2/ERF家族转录因子通过参与乙烯、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等信号转导途径，调控下游基因的表达，从而提高植物的抗性和耐受性。自从在拟南芥分离克隆AP2/ERF家族成员APETALA2以来，已经从水稻、玉米、葡萄和油菜等多种植物中分离了一批AP2/ERF家族转录因子，并对它们与逆境胁迫抗性的相关功能进行了研究。根据AP2结构域的数量和序列结构，AP2/ERF家族转录因子分为五个亚族：ERF(Ethylene-Responsive-Element-Binding-Factor)、DREB/CBF(Dehydration-Responsive-Element-Binding/CRT-Binding-Factor)、AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP)和单独(Soloist)。根据氨基 酸同源性关系，其中ERF亚族又进一步分为B1、B2、B3、B4、B5和B6六个组，DREB/CBF亚族又分A1、A2、A3、A4、A5和A6六个组【Sakuma等，Biochem Biophys Res Commun，2002，290：998-1009】。AP2/ERF家族转录因子一般由DNA结合域(DNA-binding-domain)、转录调控域(Transcription-regulation-domain)、寡聚化位点(Oligomerization-site)和核定位信号(Nuclear-localization-signal)四个功能域组成，转录因子通过功能域与启动子顺式作用元件(cis-acting-element)或与其他转录因子的功能域相互作用来调控基因的转录表达【Allen等，The EMBO Journal，1998，17(18)：5484-5496】。 

AP2/ERF家族转录因子不同亚族之间，不仅氨基酸序列不同，功能也存在差异。一般认为，ERF亚族转录因子识别结合的顺式作用元件多为GCC盒，主要调控乙烯应答以及抗病相关基因的表达。DREB/CBF亚族转录因子通常识别结合干旱应答元件DRE，调控一些与干旱、高盐和低温耐性有关的基因表达。而AP2亚族转录因子往往同开花等过程有一定的关系。通常认为低温、干旱、高盐和ABA是DREB/CBF亚族的诱导因素，而乙烯和茉莉酮酸酯是ERF亚族的诱导因素。而且同为DREB或是ERF亚族中不同组的转录因子功能也有所分工【Gutterson等，Curr Opin Plant Biol，2004，7：465-471】。 

小麦感应胁迫信号，并通过一系列信号传递最后启动相关基因表达，由这些基因产物来协助小麦适应或抵御逆境。AP2/ERF家族转录因子能特异地结合相关顺式作用元件，从而调控大量逆境应答基因的表达，使得转基因植株同时获得抗寒、抗旱和耐盐的综合抗性，使植物的抗逆性得到了较为理想的综合改良，其在小麦抗逆过程中的作用受到越来越广泛的重视【李根英等，麦类作物学报，2003，23(2)：92-96】。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子，其碱基序列为SEQ ID No 1。 

所述转录因子编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID No 2。 

所述源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子为TaERF-B3基因。 

所述TaERF-B3基因编码阅读框由711bp组成，编码成一个236个氨基酸的蛋白质 

所述源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子在制备抗逆转基因植物中的应用。 

所述源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子在植物转化中的应用。 

所述源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子基因的制备方法，包括以下步骤： 

1)小麦cDNA文库的构建：选取小麦幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo(dT)为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。 

2)设计一对引物：正向引物GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG，反向引物GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGACCGAGAGCTG；以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得小麦AP2/ERF家族转录因子基因TaERF-B3基因片段。 

3)将上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后即获得小麦抗逆AP2/ERF家族转录因子基因，即TaERF-B3基因。 

上述制备方法的具体实验步骤如下： 

1.构建小麦cDNA文库 

将小麦种子经1％(v/v)NaOCl消毒后种植在黑土∶珍珠岩∶蛭石(1∶1∶1)混合基质中，22℃、16h光照培养生长20d。选生长健壮的幼苗提取总RNA。以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，参照东洋纺上海生物科技有限公司cDNA合成试剂盒说明(http://www.bio-toyobo.cn/)，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。 

2.引物的设计与合成 

设计一对引物，引物两端分别引入Bam HI和Sac I的酶切位点。 

正向引物GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG， 

反向引物GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGACCGAGAGCTG。 

引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(http://www.sangon.com/)。 

3.PCR方法获得普通小麦AP2/ERF家族抗冻转录因子TaERF-B3基因片段 

PCR扩增采用大连宝生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的PCR 试剂，在50μl的体系中进行PCR反应，反应参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。经过1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约700bp的片段(参见图1)。 

4.克隆鉴定与序列测定 

扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司(www.axygen.com.cn/)DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收后克隆到大连宝生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。 

5.序列分析 

通过核苷酸序列测定分析，获得普通小麦AP2/ERF家族转录因子TaERF-B3基因片段，它具有如下的碱基和氨基酸序列信息。 

碱基序列如下： 

1      ATGGCGTTCA CGCACCGGCA CGACCTCGAC CTCATCCGCG CCCACCTCCT CGACGACCTC 

61     CACGCGGACG CCGTCGCCCT CGCCAGCAGC GGCGGTGACT CCGACTCGAG TGCTTCGTCG 

121    CCGCCTGGGT GGCGGAGGCC GGCGCTCTCC TTGTCGCTGC CGCCGAAGCT AGCGATGACG 

181    GTCATGGAGC AGCAGCCTCA GCAGGAGAGC TGCGGCTACG TGGAGGGACA GGACGAGGAG 

241    GAGGACTTCC GGCGGTACCG GGGCGTGCGG CTGAGGTCGT GGGGCAAGTT CGCGGCGGAG 

301    ATCAGGGACC CGGCGCGGAA GGGCGCGCGC GTGTGGCTCG GCACCTACGA CGACGCCGTG 

361    GAGGCCGCGC GCGCCTACGA CCGCGCCGCC TTCCGCCTCC GCGGGTCCAA GGCCATCCTC 

421    AACTTCCCCA ACGAGGTCGG CACCCAATCC ATCCAATGGA CCTCGCCTGC TCCCCTCGCC 

481    GACACCATCG CTGCCGTGCC CACCGGCGGC AAGAGGATGA GGCCGGCACA GGAGGAAGAG 

541    CGCCTGAGGG AGGTGAAGAA GGAGAGGCTG CAGCTGAAAG AGGAGGAGGA GGAGGGTGCT 

601    AGGGACGCCG ACTTCTGGGA GGAGCTGAAG GTGATCTGCA GCCTGCCGCC CCTCTCGCCG 

661    CTGTCGCCGT ACCCGCACTT CGCCTTCCCG CAGCTCTCGG TCGTCAACTG A。 

氨基酸序列如下： 

1      M A F T H R H D L D L I R A H L L D D L 

21     H A D A V A L A S S G G D S D S S A S S 

41     P P G W R R P A L S L S L P P K L A M T 

61     V M E Q Q P Q Q E S C G Y V E G Q D E E 

81     E D F R R Y R G V R L R S W G K F A A E 

101    I R D P A R K G A R V W L G T Y D D A V 

121    E A A R A Y D R A A F R L R G S K A I L 

141    N F P N E V G T Q S I Q W T S P A P L A 

161    D T I A A V P T G G K R M R P A Q E E E 

181    R L R E V K K E R L Q L K E E E E E G A 

201    R D A D F W E E L K V I C S L P P L S P 

221    L S P Y P H F A F P Q L S V V N 

本发明实现的有益效果： 

本发明克隆了普通小麦AP2/ERF家族转录因子基因，即TaERF-B3基因，为了进一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能，比较了转TaERF-B3基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明：野生型和转TaERF-B3基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力，这也表明TaERF-B3的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。 

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物结果。 

图2为本发明的普通小麦AP2/ERF家族抗冻转录因子的进化树分析结果。 

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。 

下述实施例中，所用的试验材料及其来源分别如下： 

普通小麦的种子经过1％(v/v)NaOCl消毒后种植在黑土∶珍珠岩∶蛭石(1∶1∶1)的基质中，22℃，培养(16h光照，8h黑暗，冷光源)生长20天。 

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和酿酒酵母菌株由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。 

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambrook J，FretsE F，Mannsdes T et al.In：Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，1989】。 

实施例1 

普通小麦幼苗RNA的抽提和cDNA合成 

(一)试验方法： 

1、RNA的抽提 

加入100mL提取缓冲液(小麦RNA提取缓冲液配方：CTAB 3％(W/V)；PVP 3％(W/V)(Mw 4000)；EDTA 25mM；NaCl 2.0M；Tris-HCl 100mM，pH8.0；Spermidine 0.5g/L；DEPC 0.1％(V/V)；0.1％DEPC处理的SDS 0.5％(W/V)；0.1％DEPC处理的LiCl 10M)到50mL聚丙烯管，65℃预热。 

称取5g植物材料倒入液氮使材料始终保持冻结和易碎的状态，研磨。 

研磨后细粉转移至预先加入65℃预热的提取缓冲液的50mL离心管。 

将离心管放入65℃水浴45min，并偶尔摇动以混合各成分。 

加入等体积氯仿-异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合约10min。 

在18℃，于12000g离心10min。 

吸取上清液，重复5，6步骤操作。 

吸取上清液，加入1/4体积的10M LiCl溶液，彻底混匀，4℃放置12h。 

在4℃，12000g离心30min。 

RNA沉淀用500μL 0.5％SDS轻柔溶解，用氯仿-异戊醇混合液抽提，4℃，12000g离心30min。 

上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积-20℃冰冷的无水乙醇，充分混合，放置在-20℃条件下2h，沉淀总RNA。 

12000g，4℃离心30min，用75％乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干。 

用200μL DEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其余储存于-70℃，备用。 

2、cDNA合成 

加入Oligo(dT)20(10pmol/μL)1μl；总RNA：10～100ng；补足RNaseFree H2O到12μL。 

65℃，5min后，立即置于冰上。 

再加入5×RT Buffer 4μL；dNTP Mixture(各10mM)2μL；RNaseInhibitor(10U/μL)1μL；反转录酶1μL。 

反转录反应过程为：30℃10min；42℃20min；85℃5min；4℃5min。 

瞬间离心，保存。 

(二)试验结果： 

采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物，结果可见明显的RNA条带。 

实施例2 

PCR方法获得普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子TaERF-B3基因片段 

(一)试验方法： 

设计一对正向和反向引物，为了克隆鉴定等构建的需要，引物两端分别引入Bam HI和Sac I的酶切位点。引物序列为：正向引物GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG，反向引物GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGA CCGAGAGCTG。 

PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0μL；dNTPs(各2.5mM)4μl；普通小麦幼苗的cDNA模板1μl(20ng)；正向引物0.5μl；反向引物0.5μl；Ex-Taq0.4μl(预变性后加入)；加无菌水定容至50μl。 

PCR反应程序：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。 

(二)试验结果： 

经过1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约700bp的片段(参见图1)。 

实施例3 

克隆鉴定、序列测定 

(一)试验方法： 

扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。 

通过核苷酸序列测定分析，最终获得普通小麦AP2/ERF家族转录因子TaERF-B3基因，具有如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的碱基和氨基酸序列信息(参见下文序列表)。 

进化树绘制使用NJ(Neighbor-joining)方法【Saitou等，Mol Biol Evol，1987，4：406-425】，利用程序MEGA4(Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0)(http://www.megasoftware.net/mega.html)完成【Tamura等，Mol Bio Evo，2007，24：1596-1599】。 

(二)试验结果： 

测序分析结果显示所述普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子TaERF-B3基因编码阅读框由711bp组成，编码成一个236个氨基酸的蛋白质(参见序列表)。 

构建的同源进化树表明：普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子TaERF-B3基因在进化关系上属于AP2/ERF家族的抗冻转录因子中的ERF-B3亚族(参见图2)。 

实施例4 

拟南芥转化 

(一)试验方法： 

1.农杆菌的准备 

1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养20h。 

2)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD 600≈1.5。 

3)8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5wt％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。 

2.拟南芥蘸花法转化 

1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22℃避光培养，24h去掉保鲜膜直立培养。 

2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。 

3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。 

(二)试验结果： 

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。 

实施例5 

拟南芥种子的筛选 

(一)试验方法： 

1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管。 

2)1mL 75wt％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。 

3)加入1mL过滤后的漂白粉(5％)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000转/分钟离心5s，去上清。 

4)无菌水洗涤3-4次。 

5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养6天。 

6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₀)培养至开花结实，收集T₀植株上所结T₁种子。 

实施例6 

普通小麦AP2/ERF家族转录因子TaERF-B3基因转化植物后的抗逆分析 

幼苗生长10-20天，转入4℃低温驯化24小时，然后转入-20℃处理30分钟，然后再移置到正常温度，观察植物的耐冷效果。 

(二)试验结果： 

结果表明，野生型和转TaERF-B3基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥抗冻能力有明显提高。经过抗冻处理的转基因与野生型拟南芥的存活率如表1所示。 

表1转基因与野生型拟南芥的抗冻后存活率 

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员 应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 

附：本申请中所涉及到的序列表： 

<110>上海市农业科学院 

<120>一种源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子及其制备方法与应用 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>SEQ ID No 1 

<211>661 

<212>DNA 

<213>普通小麦(Triticum aestivum L.) 

1      ATGGCGTTCA CGCACCGGCA CGACCTCGAC CTCATCCGCG CCCACCTCCT CGACGACCTC 

61     CACGCGGACG CCGTCGCCCT CGCCAGCAGC GGCGGTGACT CCGACTCGAG TGCTTCGTCG 

121    CCGCCTGGGT GGCGGAGGCC GGCGCTCTCC TTGTCGCTGC CGCCGAAGCT AGCGATGACG 

181    GTCATGGAGC AGCAGCCTCA GCAGGAGAGC TGCGGCTACG TGGAGGGACA GGACGAGGAG 

241    GAGGACTTCC GGCGGTACCG GGGCGTGCGG CTGAGGTCGT GGGGCAAGTT CGCGGCGGAG 

301    ATCAGGGACC CGGCGCGGAA GGGCGCGCGC GTGTGGCTCG GCACCTACGA CGACGCCGTG 

361    GAGGCCGCGC GCGCCTACGA CCGCGCCGCC TTCCGCCTCC GCGGGTCCAA GGCCATCCTC 

421    AACTTCCCCA ACGAGGTCGG CACCCAATCC ATCCAATGGA CCTCGCCTGC TCCCCTCGCC 

481    GACACCATCG CTGCCGTGCC CACCGGCGGC AAGAGGATGA GGCCGGCACA GGAGGAAGAG 

541    CGCCTGAGGG AGGTGAAGAA GGAGAGGCTG CAGCTGAAAG AGGAGGAGGA GGAGGGTGCT 

601    AGGGACGCCG ACTTCTGGGA GGAGCTGAAG GTGATCTGCA GCCTGCCGCC CCTCTCGCCG 

661    CTGTCGCCGT ACCCGCACTT CGCCTTCCCG CAGCTCTCGG TCGTCAACTG A。 

<210>SEQ ID No 2 

<211>200 

<212>PRT 

<213>普通小麦(Triticum aestivum L.) 

1     M  A  F  T  H  R  H  D  L  D  L  I  R  A  H  L  L  D  D  L 

21    H  A  D  A  V  A  L  A  S  S  G  G  D  S  D  S  S  A  S  S 

41     P  P  G  W  R  R  P  A  L  S  L  S  L  P  P  K  L  A  M  T 

61     V  M  E  Q  Q  P  Q  Q  E  S  C  G  Y  V  E  G  Q  D  E  E 

81     E  D  F  R  R  Y  R  G  V  R  L  R  S  W  G  K  F  A  A  E 

101    I  R  D  P  A  R  K  G  A  R  V  W  L  G  T  Y  D  D  A  V 

121    E  A  A  R  A  Y  D  R  A  A  F  R  L  R  G  S  K  A  I  L 

141    N  F  P  N  E  V  G  T  Q  S  I  Q  W  T  S  P  A  P  L  A 

161    D  T  I  A  A  V  P  T  G  G  K  R  M  R  P  A  Q  E  E  E 

181    R  L  R  E  V  K  K  E  R  L  Q  L  K  E  E  E  E  E  G  A 

201    R  D  A  D  F  W  E  E  L  K  V  I  C  S  L  P  P  L  S  P 

221    L  S  P  Y  P  H  F  A  F  P  Q  L  S  V  V  N 

Claims (5)

1.一种源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子，其特征在于，所述转录因子的碱基序列如SEQ ID No 1所示。

2.如权利要求1所述的源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子，其特征在于，所述转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

3.一种制备权利要求1所述的源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子的方法，包括以下步骤：

1)构建小麦cDNA文库：选取小麦幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、Oligo(dT)为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA；

2)设计一对引物：

正向引物：GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG，

反向引物：GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGACCGAGAGCTG；

以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得小麦AP2/ERF家族抗冻转录因子基因片段；

3)将上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后即获得小麦抗逆AP2/ERF家族转录因子基因。

4.权利要求1所述的源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子在制备抗逆转基因植物中的应用。

5.权利要求1所述的源于普通小麦AP2/ERF家族的抗冻转录因子在植物转化中的应用。

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