CN107354158B - 诱导型基因启动子p-shoebox的表达分析与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导型基因启动子P‑ SHOEBOX的表达分析与应用，即所述转录因子SHOEBOX基因启动子P‑SHOEBOX在水稻根系诱导发育调控中的应用，所述的转录因子SHOEBOX基因启动子P‑SHOEBOX的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。本发明通过克隆一个水稻ERF/AP2转录因子基因启动子P‑SHOEBOX，观察分析其在水稻根系的根冠、分生区、伸长区、中柱和根毛表达，并将其应用于对其特定性状进行改良具有很大的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻ERF/AP2转录因子家族基因SHOEBOX的启动子P-SHOEBOX克隆及其在水稻根系生长发育中的应用。
背景技术
生物的生长发育是基因在时空上有序的表达和协同作用的结果，启动子则为调控该过程的一个重要的元件，决定了不同基因表达的开闭、强弱和作用模式。因此，克隆并深入研究启动子的结构与功能，对于理解基因在转录水平的调控机制有着较大的帮助，同时也可以为植物基因工程中调控目的基因功能性表达提供有利的工具。
启动子是一段位于基因5’端上游区的序列，它能招募转录因子和RNA聚合酶，形成转录起始复合体启动转录。根据启动子的功能及作用方式可以分为组成型启动子、组织器官特异型启动子和诱导型启动子，以及双向启动子和人工合成启动子。早期禾本科启动子的研究主要集中玉米的Ubiquitin启动子、水稻Actin1、OsCc1、GAPDH启动子等组成型启动子（Christensen and Quail, 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes inmonocotyledonous plants. Transgenic Research, 5:213-218; Zhang et al., 1991.Analysis of Rice Act 5′ Region Activity in Transgenic Rice Plants. Plant Cell, 1991, 3:1155; Jang et al., 2002. High-level and ubiquitous expressionof the rice cytochrome c gene OsCc1 and its promoter activity in transgenicplants provides a useful promoter for transgenesis of monocots. Plant Physiology, 129:1473-1481），但是研究表明，许多组成型启动子可能会引起植物的正常生理活动异常以及一些食品安全性等方面的担忧等问题，因此获取组织特异型启动子以及诱导型启动子已经成为基因工程领域研究的重点。
水稻（Oryza sativa L.）是最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以其为主食。水稻根系作为植物在长期适应环境进化而来的三大营养器之一，发挥着固定、吸收水分和养分的功能。水稻育种研究结果表明，水稻各基因型的耐旱、耐涝、耐盐能力以及地上株型、育性的差异与其根系的生理优势和生长活力密切相关（吴伟明和程式华，2005.水稻根系育种的意义与前景. 中国水稻科学 19: 174-180）。研究表明，植物激素不仅参与了植物包括根系的生长发育的调控，并且参与了植物抵御生物与非生物胁迫中发挥重要作用（Zhao et al., 2015. The Interaction between Rice ERF3 and WOX11 PromotesCrown Root Development by Regulating Gene Expression Involved in CytokininSignaling.Plant Cell, 27: 2469-2483; Mai et al., 2014. Genes controlling rootdevelopment in rice. Rice, 7:30; Zhu et al., 2012. A gain-of-functionmutation in OsIAA11 affects lateral root development in rice. Mol. Plant5:154–161; Kitomi et al., 2011.The auxin responsive AP2/ERF transcriptionfactor CROWN ROOTLESS5 is involved in crown root initiation in rice throughthe induction of OsRR1, a type-A response regulator of cytokininsignaling.Plant Journal67:472–484; Coudert et al., 2010. Genetic control ofroot development in rice, the model cereal. Trends Plant Sci. 15:219-226)。因此，通过分子遗传改良以提高品种本身对水分、养分的利用率和逆境的生物与非生物胁迫，将大大减少人力和物力资源的浪费，并能减少因大量化学肥料和农药流失对环境造成的污染，对确保我国的粮食安全和发展持续、高效的绿色农业具有重要意义。
本发明通过分子生物学、细胞生物学等方法开展了乙烯利、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、生长素、盐及冷处理对转录因子SHOEBOX基因的启动子在根系中的表达模式进行了深入的分析，以期用于对在植物体内所需要的作用模式来对水稻根系进行分子遗传改良。
发明内容
本发明在于通过克隆一个水稻ERF/AP2转录因子SHOEBOX基因启动子P-SHOEBOX，通过使用细胞分裂素（激动素KT）、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）和生长素（IAA），以及高盐（NaCl）和冷胁迫（4℃）对该启动子株系处理实验，确定该基因启动子为诱导型水稻根系启动子。该启动子可被用来启动外源基因在根系中按照特定的表达模式进行基因表达，达到精准定向分子遗传改良，调控植物生长发育，抵御外来的生物与非生物胁迫等，用于转基因水稻育种，也为长远的启动子改造和设计储备资源。
本发明达到上述目的的技术方案是，
根据水稻公共数据库Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml），以序列表SEQ ID NO 1中所获得的1-3305bp核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上BamH I和Pst I的酶切位点，以水稻品种“中花11”（中国农业科学院作物科学研究所）样品为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到SHOEBOX基因启动子片段。
一种诱导型基因启动子P-SHOEBOX的表达分析与应用，即所述转录因子SHOEBOX基因启动子P-SHOEBOX在水稻根系诱导发育调控中的应用，所述的转录因子SHOEBOX基因启动子P-SHOEBOX的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。
所述应用包括在生物与非生物胁迫下的调控水稻植株根系生长发育的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明的优点如下：
水稻（Oryza sativa L.）是最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以其为主食。水稻各基因型的耐肥、耐瘠、耐旱能力以及地上株型、育性的差异与其根系的生理优势和生长活力有密切的联系。启动子作为基因表达调控的重要调控元件，通过与转录因子的结合在时间和空间上决定了基因表达的强度和作用方式。植物激素，如乙烯、生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素不仅参与了植物包括根系的生长发育的调控，并且参与了植物抵御生物与非生物胁迫中发挥重要作用，因此，分离水稻根系诱导型启动子，应用于对其特定性状进行改良具有很大的经济效益。
本发明通过克隆一个水稻ERF/AP2转录因子基因启动子P-SHOEBOX，观察分析其在水稻根系的根冠、分生区、伸长区、中柱和根毛表达，并且发现表达强度和部位受细胞分裂素（KT）、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、生长素（IAA），以及高盐（NaCl）和冷胁迫诱导的影响。这些说明，P-SHOEBOX基因启动子是一个诱导型启动子，在水稻根系中受多种激素及逆境条件的诱导调控，可利用P-SHOEBOX启动子针对特定目的外源基因在植物体内特定条件、组织或器官表达，达到精准定向分子遗传改良，为转基因水稻育种，为长远的启动子改造和设计储备资源。该启动子可被用来启动外源基因在根系中按照特定的表达模式进行基因表达，用于抵御外来的生物与非生物胁迫等，用于转基因水稻育种，也为长远的启动子改造和设计储备资源。
附图说明
图1：表达载体pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost及本发明构建的P-SHOEBOX启动子融合载体构建的示意图：1A为表达载体质粒pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost，图1B为本发明构建的载体图：
图2：不同激素处理P-SHOEBOX基因启动子转基因植株在根系中的表达模式；
2A为对照组，无添加激素处理情况下P-SHOEBOX启动子融合报告基因GUS在水稻根尖表达情况；
2B为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，10μM乙烯利处理本发明创建的P- SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
2C为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，10μM激动素KT处理本发明创建的P- SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
2D为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，10μM赤霉素GA3处理本发明创建的P- SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
2E为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，10μM脱落酸ABA处理本发明创建的P- SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
2F为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，10μM吲哚乙酸IAA处理本发明创建的P-SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
2G为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，10mM氯化钠NaCl处理本发明创建的P- SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
2H为1/2 MS 培养基28℃条件下种植3天后，4℃处理处理本发明创建的P-SHOEBOX启动子融合gus转基因植株24h，报告基因gus在水稻根尖表达情况；
附图中标尺=1μm。
具体实施方式
实施例1
根据公共数据库NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 以序列表SEQ ID NO 1中所获得的1-3305bp核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上BamH I和Pst I的酶切位点，以水稻品种“中花11”（中国农业科学院作物科学研究所）样品为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到的P-SHOEBOX启动子片段。
具体条件如下：
PCR反应总体积为20μL，具体配法是：模板100ng，10xPCRbuffer 2μL，10mMdNTP1.6 μL，2.5mM Mg2+ 1.5μL，左、右引物（PromSHB-F和PromSHB-R）各0.2 μL，LA Taq酶0.2μL，加去离子水到20 μL（所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、LA Taq酶等均为自宝生物工程大连有限公司）。PCR反应条件如下：①94 ℃ 10分钟，预变性，②94 ℃30秒，变性，③68℃ 4分钟，退火及延伸，④从②－③重复31次，循环扩增，72℃ 7分钟，保温，4℃保存。
引物的构建：分别用BamH I和PstI酶切PCR产物和表达载体质粒 pG2NHL-H2BYFP-gusplus-Nost（该质粒的图谱见图1），目的片段回收纯化后用连接酶连接，通过电转化的方法（电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见该仪器说明书），将连接产物转到大肠杆菌DH10β感受态中（购自普洛麦格生物技术有限公司，即美国Promega公司），在含有250 ppm卡那霉素（购自罗氏生物公司产品）的LA（LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002版）抗性培养基上涂皿培养；用来构建P-SHOEBOX表达载体片段的引物为：
PromSHB-F: 5’-ATACTGCAGATGAAGGATGGCAAAGAGCCAT-3’,
PromSHB-R: 5’-ATAGGATCCGCGGCTGATACGCTCCTTG-3’。
菌落的培养：将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10mL离心管，管内预先加入3 mL含250 ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37 ℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，用BamH I和Pst I酶切并电泳检测，并挑取大小正确克隆测序验证。
将测序正确的克隆电转化农杆菌，利用农杆菌介导的转基因方法 (Wu et al.,2003. Development of enhancer trap lines for functional analysis of the ricegenome. Plant J. 35: 418–427) 将上述的启动子表达载体遗传转化载体导入水稻粳稻受体品种中花11（ZH11），获得的P-SHOEBOX启动子转基因植株，然后对这些阳性转基因植株根系进行GUS染色观察检测阳性植株。
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后将苗在无添加激素处理情况下处理24小时；取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育 16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2A所示。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，其不同之处在于，
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后移苗至含有10μM乙烯利处理24小时，取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2B所示。
实施例3
实施例3与实施例1基本相同，其不同之处在于，
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后分别移苗至含有10μM激动素KT处理24小时。取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2C所示。
实施例4
实施例4与实施例1基本相同，其不同之处在于，
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后移苗至含有10μM赤霉素GA3处理24小时。取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育 16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2D所示。
实施例5
实施例5与实施例1基本相同，其不同之处在于，
（6）收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后移苗至含有10μM脱落酸（ABA）处理24小时。取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育 16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2E所示。
实施例6
实施例6与实施例1基本相同，其不同之处在于，
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后移苗至含有10μM生长素（IAA）即吲哚乙酸处理24小时。取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育 16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2F所示。
实施例7
实施例7与实施例1基本相同，其不同之处在于，
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后移苗至含有10μM高盐（NaCl）处理24小时。取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育 16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2G所示。
实施例8
实施例8与实施例1基本相同，其不同之处在于，
收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿（13cm x 13cm）上28℃培养箱（16h/8h）垂直培养3天，然后移苗至4℃下处理24小时。取根尖部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育 16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜（Ni-U，尼康，日本）观察并拍照。如附图2H所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 信阳师范学院
<120> 诱导型基因启动子P-SHOEBOX的表达分析与应用
<130> 111111
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3305
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3305bp
<400> 1
atgaaggatg gcaaagagcc atccaaggcg gtttggagta acagctgggg ctgcgcaagg 60
gggttggcca gcagaggggt gatggtgcgg tgagcctgcg tgctggagga ggtcgtctgt 120
ctggcggggc attgggctgg cgatggttgg gtgggagttg gtgctgcggg tgaaagccta 180
gctcgatgtt ctcgggtcga caatgacgac acctcttggc atcgtgctct ccctttggga 240
cgttaccgag ttgccacctt cttttccccg ttaagacttt cctagtgaaa atcgagtcca 300
tggtggacat gcgacggtgg tgccttttgg tgtcacaacc tccgtggagg cgccatctag 360
gaatcttgtt ccctcgtctt tgctgccctt ttattatctc tcgtcctcac cctcaaccct 420
tccgtgaggg aggctagaag tttgtcatgg atgttggagt tggtttgagg tgggggtgtg 480
ttcgatccct atgtagcgat agcggtgacc agtcatgcac agcgatggtc agttcggtct 540
agtgattttc gagggtgtga tgaagcttct agcatgtggt gggtggcttc tttttttttt 600
tctaattata gccttttact ttttcctgaa catatcaata tgaaatttca tactgttttg 660
tgctttattt taaaaaaatt cttatccatc aattaattat caatgcggat ccgtgaggaa 720
tgaaatattt tagaaaaatt ttagacaacc aagtactaat aactaataaa aaatgcgcgg 780
aacttttcgc ttgcattcaa tatttgatgg ggtgctgaca tgaatcatgt caagccgtgg 840
aatgagggag cgttaaccat gcatggttaa gagcaagttt aaggacaccc ataattatta 900
tctataagct ctctataaga gattcatatc agcatatttt cctacttgga agagattaaa 960
tgaagagaga gaataaagct atctactaac ctggagatag tctatagaga aaaatgagac1020
aatgtattag agagctatag atccccatgt agacatacta ttgagatggt ttactattaa1080
tctagtctat tgctgagatg tacatgtttt atagatagca ccttacttta ccattgcggg1140
tgctctaata aggcacactc agcgggcgat aagagtgcca cgtcatccaa attcattcgt1200
ggaggagaga gaaagctaga gggagagggc aacgggcgct tctgcaaacg ccgagctata1260
gcacaagaaa ttatgcatat tcaatattgt ggttgttttt ctccaatagt atagctatgg1320
ccccattagc agaacacacg ggataggata gagagtagca agttagatta aaaaatagaa1380
aaagttaact acctagagaa gtgtgtaggt agattagcag cctactatta tacatatcat1440
ctttattttc tatctccgga tgacatgtac atttttatcg tcagttgata gcggtactat1500
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cgagcagtat ctttaccccc ctattgttac gttgatggct tttaggctcc ttttaacatg1680
tggagtttac aataatttta taagaaatat tattagtcaa attcaatcgc agtttatttt1740
attgatatgc acacccttta atttagtcga aattatgaat cctaaattag gaagtacgag1800
cgatagtact ttatctacac tcagagaaaa aaagaatgtc ccctaataca catcactgcc1860
gatgaactct attgaaactg ggttatctgt ctccgaaagt cactttctcg gtcctcacat1920
agaggccatt tggtctgtga tctaatgtct ttgttggaag cggtgaatac ttttagacat1980
gtttgacatg attttaactt ctaaatctaa ctctaacagt gaagtctaga gtaaagtatg2040
gagcaatcca aaccctattt ttcccctata atttattttt catatcactt cagcccactt2100
tatctccttc agatattgct taaacatttg gttgggctac aattttaaga gagatggagt2160
caaaacctta tcatatactt cctccgtcta aaaaaaactt aacctagaag gtcccctcct2220
atgacaacga atctagataa atggtagtat aaatttgttg tcataagggt cacatctcct2280
ccaaagttaa gttttttttt aaatggaggg agtaagcact taatttatag ttcaagagtt2340
ctttttacac gaataatata gagtatctat atagtgagaa tttgaacaag ttatgttatg2400
tttttagttt ttagctaata tactagttta tttttttaga tcttatgatt actacacaat2460
ctatctaata aaaaataaaa ttaaaatgtt taagagagca gtagctccta ttgctataca2520
agctcttgga ataggacctc aaatcctata tccctaacct aaagaaagaa ccaaagaaac2580
caaatctata gcgttgtgtg tgtaaacaaa taaataaaaa aaaaagtcca ccgagacaag2640
aaaaaacgca ccgttgccgt tccgaggaaa cgacggcggg caggacaatc ccgcatccgc2700
cgtgtccctt tccgcccccg gcccggccaa tagcccagtg ggccccaccc cccctcccca2760
atcccatcgt atccccccgc ttcctcggat tcccctgccc cctgtccccc catgtgccgg2820
cccactgggc tccacccccc catccatcca cgcatccacc ccccccatcc gtctccatcc2880
ctcccagtct cccacctcac gcactcgatg cgatcccccc catttgaaat cccccccctc2940
tcctcaccgc gaccgcctcc cccaaacggt cacccccgct ttggctctct cttctcttct3000
cgcctcgcct cgccaccgac tccgatcgag tggggggagg gagggggggt ttgctgctgc3060
tgcgtgcgcg cgccatggcg tcccccggcc ccgccgcggg gatgcagcag aagctggagg3120
cggctgcggc ggcggcgggg ggaggagacg gggcggagtg gggccgggga atgcagaaga3180
tggaggcggt gggagcgggg ggagaggggg tgggggcggg ggcggagcag gtggcgccgc3240
cgccgaggag gcccgtggcg gcgcggaagg agagggtgtg cacggccaag gagcgtatca3300
gccgc 3305
Claims (2)
1.一种转录因子SHOEBOX基因启动子P-SHOEBOX在水稻根系诱导发育调控中的应用，其特征在于，所述的转录因子SHOEBOX基因启动子P-SHOEBOX的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所述。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括在生物与非生物胁迫下的调控水稻植株根系生长发育的应用。
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Publications (2)
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