具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。GUS活性测定中,实验都进行3次重复;每次实验中每个株系每个处理采用30-40株幼苗,标准误用误差线表示,*p<0.05;**p<0.01。
水稻中花10号(Oryza sativa L.cv.Zhonghua 10):国家农作物种质保存中心,中国农业科学院作物科学研究所,邮编:100081;联系电话:010-68919715。
拟南芥Col-0:Columbia生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotypeColumbia)。
pCAMBIA-1381:Cambia Institute,澳大利亚。
农杆菌GV3101:中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种编号1.1488。
实施例1、OsMT-I-4b基因启动子的发现
根据水稻I型MT基因OsMT-I-4b的全长cDNA(NCBI序列号:NM_001073598),利用PCR的方法,以水稻中花10号(Oryza sativa L.cv.Zhonghua 10)基因组DNA为模板,进行扩增,克隆得到OsMT-I-4b基因上游1730bp的DNA片段,并命名为POsMT-I-4b(OsMT-I-4b基因启动子)。POsMT-I-4b中的顺式作用元件分析见图1,将其中翻译起始密码子ATG中的A碱基定义为+1,该序列中存在两个基本启动子元件,TATA box和CAAT box,分别位于-109/-103和-214/-211区,这些元件在真核基因转录中作为基本元件发挥功能。
利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)软件对OsMT-I-4b启动子中的顺式作用元件进行搜索预测,发现其中两个基本启动子元件的上游区域中,含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列:含有与动物MRE元件核心序列类似的元件,共4个拷贝串联分布,分别位于-1542/-1536、-1370/-1364、-371/-365和-275/-269处;与金属响应相关的元件CuRE元件,它以6个拷贝的形式串联分布于-1498/-1495、-1041/-1038、-1014/-1011、-670/-667、-600/-597和-119/-116处,这些可能的金属响应元件的存在,说明OsMT-I-4b基因对金属离子的响应过程存在复杂精细的调控;还存在一些其它的顺式作用元件,这些元件在其它许多植物基因启动子中都存在,如ABRE(-996/-989),MYC(-1082/-1077、-415/-410),MYB(-1467/-1462、-1297/-1292和-856/-851)等,这些元件与OsMT-I-4b基因响应ABA和其它胁迫信号有关;OsMT-I-4b中还包括2个拷贝的I-box(-1008/-1003、-311/-306),该元件在光信号的传递和响应过程中其重要的调控作用;还包含2个拷贝的W-box(-465/-461、-336/-332),它可以被WRKY类转录因子识别,并在OsMT-I-4b基因响应伤诱导中其作用。上述这些元件都与植物响应各种环境胁迫有关,它们的存在说明OsMT-I-4b基因启动子的活性除受到金属离子诱导外,可能还受到环境因素的诱导,如ABA、干旱、光信号、伤害等。
OsMT-I-4b基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列1所示。
实施例2、转基因植株的获得
一、重组表达载体A的构建
1、以水稻中花10号的基因组DNA为模板,用特异性引物对R1(R1-F:5’-CAGGATCCCCCCTCAAAAACTG-3’/R1-R:5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’,下划线序列分别表示BamH I和Spe I酶切位点)进行PCR扩增,反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,回收并纯化1.7kb左右的的DNA片段(启动子;-1730/-1;记为R1;序列表的序列1所示的DNA片段)。
2、用限制性内切酶BamH I和Spe I酶切步骤1回收的PCR产物。
3、用限制性内切酶BamH I和Spe I酶切植物表达载体pCAMBIA-1381,回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接,得到重组质粒。
5、将重组质粒进行测序,测序结果表明,得到了重组质粒pCAMBIA-pMT-GUS(在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间,用序列表的序列1所示的DNA片段替换了原有的CaMV 35S启动子;又称重组质粒A)。
二、转基因植株的获得
1、将重组质粒A导入农杆菌GV3101,得到重组农杆菌。
2、利用农杆菌介导,通过花浸泡法(Clough SJ,Bent AF(1998).Floral-dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.16,735-743.)将重组质粒A导入拟南芥Col-0,得到T1代种子。T1代种子收获后在MS培养基(含有25mg/L潮霉素)中筛选抗性植株,将未出现性状分离的抗性植株(纯合子株系)移栽到土中,收获转基因植株的T2代种子。
三、转空载体对照植株的获得
用限制性内切酶BamH I和Spe I酶切pCAMBIA-1381,回收载体骨架,用DNA聚合酶I的Klenow片段补平载体骨架的粘性末端,然后用T4DNA连接酶使载体环化,得到GUS报告基因上游不含任何启动子的空载体。用空载体代替重组质粒A,其它步骤同步骤二,得到转空载体对照植株的T2代种子。
实施例3、启动子的组织特异性
将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代进行GUS组织化学染色,以确定其组织特异性。拟南芥种子经表面消毒后,铺在1/2MS(pH 5.8,1.5%蔗糖,0.75%琼脂)平板上,经过4℃春化2天后,置于22℃培养箱中,光照16h,黑暗8h培养。在培养基上生长两周后,拟南芥幼苗被移植到营养土中,继续生长。
转基因拟南芥中GUS的组织化学检测按照Jefferson等(Jefferson RA,KavanaghTA,Bevan MW(1987).GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants.EMBO J.6,3901-3907.)的方法进行。具体步骤:取幼苗或其发育过程的各个器官,在含0.5%多聚甲醛的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)固定30min;然后置于GUS反应液中(含0.1M磷酸钠缓冲液,pH 7.0 10mMEDTA,5mM铁氰化钾,1.0mM X-gluc及0.1%Triton X-100),于30℃放置过夜;观察植物的着色强度。幼苗或光合组织用70-100%系列乙醇脱色以去掉叶绿素,在体视镜(Olympus,Japan)下观察并照相。
GUS着色情况如图2所示。图2中,图2a为1天大拟南芥幼苗,图2b为3天大拟南芥幼苗,图2c为5天大拟南芥幼苗,图2d为10天大拟南芥幼苗,图2e为20天大拟南芥幼苗的莲座叶,图2f为35天大拟南芥幼苗的莲座叶,图2g为35天大拟南芥幼苗的茎生叶,图2h为拟南芥的衰老叶片,图2i为拟南芥的衰老叶片的局部放大图,图2j为35天大拟南芥的茎,图2k为40天大拟南芥的成熟花器官,图21为40天大拟南芥的幼花,图2m为45天大拟南芥的幼嫩果荚,图2n为55天大拟南芥的成熟果荚,图2o为空载体对照拟南芥35天大的莲座叶(左)和茎生叶(右)。
1天大拟南芥幼苗中,可见GUS活性在子叶和胚根中相对较高,而在胚轴中相对较弱。3天大和5天大的幼苗中,GUS着色情况有所改变,GUS活性主要分布在胚根和胚轴中,而在子叶中的活性较低。在10天大的幼苗中,根中仍保持较强的GUS活性,另外在第1对真叶中也能检测到GUS报告基因的表达。在1-10天大幼苗的根尖都检测不到GUS着色。对于转化空载体拟南芥幼苗,各个生长时间均检测不到任何GUS着色。
对于成熟拟南芥,根中同样能检测到较高的GUS活性。如在20天大和35天大的转基因拟南芥的莲座叶中,GUS活性只在排水器和表皮毛中可以检测到,在茎生叶的排水器和表皮毛中也能检测到GUS着色。而在衰老叶片中,只能在排水器中检测到GUS活性。另外,在茎生叶中受伤部位周围可以检测到GUS着色,而在莲座叶的受伤部位则检测不到,说明OsMT-I-4b启动子特异地在茎生叶中对伤诱导有响应。在成熟拟南芥的茎中无明显的GUS着色。对于转化空载体拟南芥植株,各个组织中均检测不到任何GUS着色。
拟南芥的花器官中:在柱头顶部可以检测到较强的GUS活性;在萼片和花丝中也有一定的GUS着色;另外在花瓣的微观组织中也能检测到相对较弱的GUS活性;在幼嫩的果荚中,GUS着色主要分布在果荚的上半部分,随着果实的逐渐成熟,GUS活性逐渐降低,当果荚完全成熟开裂时,几乎检测不到GUS活性;在成熟的种子中也检测不到GUS着色。在转化空载体的拟南芥植物的花器官、果荚和种子中都检测不到GUS活性。
启动子在转基因拟南芥幼苗的根中表现出很高的活性。启动子活性在转基因拟南芥的叶片中虽然比较低,但主要集中在叶片的表皮毛和叶缘的排水器中,这两个部位都是植物体内重金属离子通过叶片向外排出的重要途径。在生殖生长阶段,启动子驱动的GUS主要在花器官的柱头、花丝和萼片中有较强的着色。花的发育过程需要多种金属离子的参与。OsMT-I-4b的特异性高表达可能有助于花中金属离子的转运和交换,从而在花发育过程中起重要作用。以上结果说明,无论是在营养生长阶段,还是生殖生长阶段,OsMT-I-4b启动子的活性都受到复杂的调控,从而保证OsMT-I-4b基因特异地在某些组织中表达并发挥功能。
实施例4、启动子的诱导表达(对ABA和非生物胁迫处理的响应能力)
将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代分别进行各种胁迫处理,然后进行GUS活性测定,以确定其诱导表达特性。
1、进行各种胁迫处理
拟南芥种子经表面消毒后,铺在1/2MS(pH 5.8,1.5%蔗糖,0.75%琼脂)平板上,经过4℃春化2天后,置于22℃培养箱中,光照16h,黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集,用去离子水清洗2次后,分成5组,分别进行如下处理:
干旱胁迫处理(干旱):将幼苗置于干的滤纸(Whatman,3mm)上,在空气湿度为60%的培养箱中处理6h;
盐胁迫处理(高盐):将幼苗置于浸满100mM NaCl水溶液的滤纸上,于培养箱中处理6h;
黑暗胁迫处理(暗处理):将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上,并于22℃下避光培养6h;
脱落酸(ABA)处理:将幼苗置于浸满100μM ABA水溶液的滤纸上,于培养箱中处理6h;
对照处理(对照):将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上,于培养箱中处理6h。
处理完毕后,分别收集未处理和不同处理后的拟南芥幼苗的根和地上部分,将其在液氮中速冻,用于随后的GUS活性测定。
2、GUS活性测定
(1)收集拟南芥材料,在研钵中加入液氮研磨成粉末,悬浮在GUS提取缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0;0.1%Triton X-100,10mM β-疏基乙醇,10mM 1,2-环己二胺-N,N,N,N-四乙酸,0.1%月桂酸钠)中,12,000×g、4℃离心10min后收集上清。
(2)蛋白质的浓度按照Bradford的方法(Bradford MM(1976).A rapid andsensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72,248-254.)定量。用牛血清白蛋白(BSA)作标准曲线。
(3)Jefferson等的荧光测定法(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW(1987).GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion markerin higher plants.EMBO J.6,3901-3907.)测定GUS活性。反应底物为4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside,4-MUG),检测不同反应时间的样品中,在激发光365nm、发射光455nm、狭缝10nm条件下各样品的荧光强度。
(4)计算GUS的活性。GUS活性以每mg可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-甲基-伞形酮(4-methyl-umbelliferone,4-MU)为单位。以未处理样品中的GUS活性为1.0,计算各种处理后样品中的相对GUS活性。
幼苗在各种非生物胁迫条件下根中的GUS活性变化见图3。未经任何处理时,GUS活性为150.01pmol MU/min/mg蛋白,经去离子水处理6h后,GUS活性为171.03pmolMU/min/mg蛋白,与处理前的对照相比,无显著差异。100μM ABA胁迫6h后,GUS活性提高了7.65倍。干旱胁迫6h后,GUS活性提高了5.38倍。黑暗胁迫6h后,GUS活性提高了3.57倍。盐胁迫6h后,GUS活性只有较少的提高,为364.51pmol MU/min/mg蛋白,是对照活性的2.43倍。这些结果说明,OsMT-I-4b启动子对不同的环境胁迫有不同程度的响应。
与对照组相比,各种处理后拟南芥的地上部分的GUS活性并未出现显著性差异。
以上结果说明,该启动子对各种环境胁迫的响应是根特异的。
实施例5、启动子对各种金属离子的响应情况
将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代分别进行各种金属离子处理,然后进行GUS活性测定,以确定其诱导表达特性。
1、进行各种金属离子处理
拟南芥种子经表面消毒后,铺在1/2MS(pH 5.8,1.5%蔗糖,0.75%琼脂)平板上,经过4℃春化2天后,置于22℃培养箱中,光照16h,黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集,用去离子水清洗2次后,分成7组,分别进行如下处理:
CuSO4处理:将幼苗置于浸满100μM CuSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
ZnSO4处理:将幼苗置于浸满100μM ZnSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
CoCl2处理:将幼苗置于浸满100μM CoCl2水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
CdCl2处理:将幼苗置于浸满50μM CdCl2水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
PbSO4处理:将幼苗置于浸满20μM PbSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
AlCl3处理:将幼苗置于浸满50μM AlCl3水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
对照处理:将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上,于培养箱中处理6h。
处理完毕后,分别收集未处理和不同处理后的拟南芥幼苗的根和地上部分,将其在液氮中速冻,用于随后的GUS活性测定。
2、GUS活性测定
同实施例4的步骤2。
幼苗在各种金属离子存在的条件下根中的GUS活性变化见图4。对照处理中,GUS活性没有显著提高。Pb2+处理后GUS活性提高的倍数最高(10.38倍)。之后,依次为Al3+和Zn2+处理,经24h的诱导后GUS活性分别提高了8.24倍和8.06倍。Cu2+诱导后,GUS活性也有6.64倍的提高。Cd2+处理后,GUS活性只提高了2.07倍。Co2+处理后,GUS活性与对照组相比,没有显著性的差异(p>0.05),说明启动子在拟南芥根中对Co2+不响应。与对照组相比,各种处理后拟南芥的地上部分的GUS活性未出现显著性差异。
以上结果说明,该启动子对各种金属离子的响应是根特异的。
实施例6、启动子对各种浓度的金属离子的响应情况
将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代分别进行各种浓度金属离子处理,然后进行GUS活性测定,以确定其诱导表达特性。
1、进行各种浓度金属离子处理
拟南芥种子经表面消毒后,铺在1/2MS(pH 5.8,1.5%蔗糖,0.75%琼脂)平板上,经过4℃春化2天后,置于22℃培养箱中,光照16h,黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集,用去离子水清洗2次后,分成13组,分别进行如下处理:
CuSO4高浓度处理:将幼苗置于浸满200μM CuSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
CuSO4中浓度处理:将幼苗置于浸满100μM CuSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
CuSO4低浓度处理:将幼苗置于浸满50μM CuSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
ZnSO4高浓度处理:将幼苗置于浸满200μM ZnSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
ZnSO4中浓度处理:将幼苗置于浸满100μM ZnSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
ZnSO4低浓度处理:将幼苗置于浸满50μM ZnSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
PbSO4高浓度处理:将幼苗置于浸满50μM PbSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
PbSO4中浓度处理:将幼苗置于浸满20μM PbSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
PbSO4低浓度处理:将幼苗置于浸满10μM PbSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
AlCl3高浓度处理:将幼苗置于浸满100μM AlCl3水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
AlCl3中浓度处理:将幼苗置于浸满50μM AlCl3水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
AlCl3低浓度处理:将幼苗置于浸满25μM AlCl3水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
对照处理:将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上,于培养箱中处理6h。
处理完毕后,分别收集处理前和不同处理后的拟南芥幼苗的根,将其在液氮中速冻,用于随后的GUS活性测定。
2、GUS活性测定
同实施例4的步骤2。
幼苗在各种浓度金属离子存在的条件下根中的GUS活性变化见图5。对照处理中,GUS活性没有显著提高。随着Cu2+浓度的提高,GUS活性逐渐升高,至Cu2+达到100μM时,GUS活性最高(为对照组的6.93倍),但当Cu2+浓度升高至200μM时,GUS活性反而有所降低(为对照组的5.02倍)。在0-100μM Zn2+处理时,GUS活性逐渐升高,而在200μM Zn2+处理时,GUS活性只有100μM处理时的84.6%。当25μM和50μM Al3+处理后,GUS活性较对照组比有了显著的升高,分别提高了5.25倍和8.59倍,而当Al3+浓度达到100μM时,GUS活性降低,只是对照组的6.37倍。在一定的Pb2+浓度范围(0-50μM)内,OsMT-I-4b启动子活性随着Pb2+浓度的升高而逐渐升高。在高浓度金属离子处理时,转基因植物根中GUS活性不升反降,推测可能是由于高浓度的金属离子对细胞的毒害作用引起的。总结以上结果,说明对于不同的金属离子诱导及不同的诱导浓度,OsMT-I-4b启动子的响应程度不同。
实施例7、启动子中的各个片段的功能验证
为了深入研究OsMT-I-4b启动子活性的复杂调控机制,并对该启动子中对特异金属离子诱导的响应区域和元件进行定位,对启动子进行了缺失分析。
一、重组表达载体的构建
1、重组质粒B的构建
重组质粒B:在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间,用序列表的序列1所示的DNA片段的-1052/-1(-1052/-1;记为R2;序列表的序列1自5’端第679至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R2(R2-F/R1-R)代替特异性引物对R1,其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。
R2-F:5’-TTGGATCCAAATTGAATTCGTACAGC-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点);
R1-R:5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。
2、重组质粒C的构建
重组质粒C:在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间,用序列表的序列1所示的DNA片段的-914/-1(-914/-1;记为R3;序列表的序列1自5’端第817至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R3(R3-F/R1-R)代替特异性引物对R1,其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。
R3-F:5’-CTGGATCCATGATAAACTTAAGTTC-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点);
R1-R:5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。
3、重组质粒D的构建
重组质粒D:在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间,用序列表的序列1所示的DNA片段的-583/-1(-583/-1;记为R4;序列表的序列1自5’端第1148至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R4(R4-F/R1-R)代替特异性引物对R1,其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。
R4-F:5’-CAGGATCCAAACAGCTAAGAACTTT-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点);
R1-R:5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。
4、重组质粒E的构建
重组质粒E:在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间,用序列表的序列1所示的DNA片段的-142/-1(-142/-1;记为R5;序列表的序列1自5’端第1589至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R5(R5-F/R1-R)代替特异性引物对R1,其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。
R5-F:5’-TTGGATCCAATTCCGCAGCTTCTT-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点);
R1-R:5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。
5、重组质粒F的构建
①在R5片段中引入点突变
重组质粒F:在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间,用R5m片段(序列表的序列2)替换了原有的CaMV 35S启动子。R5m片段:R5片段中,-119至-116位(序列1自5’端第1612位核苷酸和第1615位核苷酸)的CuRE元件的核心序列GTAC被突变为TTCC,用于分析这个距离TATA box最近的可能的CuRE元件在启动子活性调节中的作用。采用特异性引物对R5m(R5m-F/R1-R)代替特异性引物对R1,其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。在R5片段中引入点突变是通过在PCR引物的对应位点引入突变而实现的。
R5m-F:5’-TT
GGATCCAATTCCGCAGCTTCTTCTCAAGG
T
CTA-3’;(下划线序列表示BamH I酶切位点;双下划线序列表示引入的突变位点:G→T,A→C);
R1-R:5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。
二、转基因植株的获得
同实施例2的步骤二。收获转基因植株的T2代种子。
三、各个片段的启动活性比较
将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代、本实施例得到的各种转基因植株的T2代分别正常培养,然后对10天龄幼苗进行GUS活性测定。GUS活性测定同实施例4的步骤2。
R1片段、R2片段、R3片段、R4片段、R5片段和R5m片段及其GUS活性测定结果如图6所示。
各个片段均具有不同程度的启动子活性。在转基因幼苗的根中,GUS活性明显高于地上部分。地上部分:R1驱动的GUS活性最高(24.68pmol MU/min/mg蛋白),然后随着5’序列的不断缺失,GUS活性逐渐降低。在构建R5m中,由于-119/-116位CuRE元件的突变,GUS活性比其野生型形式R5中的GUS活性下降了约26.4%。根:R4片段(-583/-1)驱动的GUS活性最高,为225.96pmol MU/min/mg蛋白,略高于由全长启动子驱动的GUS活性(R1,210.58pmol MU/min/mg蛋白)。当启动子片段缺失到-142(R5)时,GUS活性只有23.47pmol MU/min/mg蛋白,约为最高GUS活性(R4)的10.4%。与R5相比,其突变形式R5m中,GUS活性没有显著差异。上述结果说明,OsMT-I-4b启动子中片段即可驱动下游报告基因在拟南芥根中特异地大量表达,而在拟南芥的地上部分中大量表达,则需要全长启动子片段的参与。
四、各个片段对各种金属离子响应能力的比较
将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代、本实施例得到的各种转基因植株的T2代种子分别经表面消毒后,铺在1/2MS(pH 5.8,1.5%蔗糖,0.75%琼脂)平板上,经过4℃春化2天后,置于22℃培养箱中,光照16h,黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集,用去离子水清洗2次后,分成4组,分别进行如下处理:
CuSO4处理:将幼苗置于浸满100μM CuSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
PbSO4处理:将幼苗置于浸满50μM PbSO4水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
AlCl3处理:将幼苗置于浸满50μM AlCl3水溶液的滤纸上,于培养箱中处理24h;
对照处理:将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上,于培养箱中处理6h。
处理完毕后,分别收集处理前和不同处理后的拟南芥幼苗的根和地上部分,将其在液氮中速冻,用于随后的GUS活性测定。
GUS活性测定同实施例4的步骤2。
与对照组相比,各种处理后拟南芥的地上部分的GUS活性并未出现显著性差异。
根的GUS活性测定结果如图7所示。
经Cu2+诱导24h后(图7A):全长启动子片段(R1,-1730/-1)驱动的GUS活性提高了6.93倍,这是在所有启动子缺失片段中,GUS活性提高倍数最高的;R2片段(-1052/-1)中,虽然启动子中缺失了2个MRE类似元件(-1542/-1536,-1370/-1364)和1个CuRE元件(-1498/-1495),但它驱动的活性经相同诱导后仍有6.19倍的提高;在R3片段(-914/-1)中,启动子中5’侧第2个和第3个CuRE元件进一步发生缺失,Cu2+处理使其驱动的GUS基因表达提高了3.08倍,而在R4(-583/-1)构建中,随着两个CuRE元件(-670/-667,-600/-597)的进一步缺失,该片段对Cu2+诱导不响应,诱导后GUS活性只有诱导前GUS活性的0.77倍;与R4片段类似,R5片段(-142/-1)也对Cu2+诱导不响应。以上结果说明,片段-1052/-583对于启动子响应Cu2+诱导是必需的,这一片段中含有4个可能的CuRE元件,推测OsMT-I-4b启动子对Cu2+的响应调控是由这些元件介导完成的。
对Pb2+响应程度(图7B):最高的是全长启动子片段(R1),GUS活性提高了10.38倍,之后随着启动子片段的缺失,启动子对Pb2+诱导的响应能力逐渐减弱;当缺失至-142位(R5构建)时,Pb2+处理后,GUS活性只有2.01倍的提高;若R5片段中CuRE元件发生突变(R5m构建),经Pb2+诱导后,GUS活性只提高了1.51倍。这些结果说明,OsMT-I-4b启动子对Pb2+处理的响应需要全长启动子中各个元件的参与。
在Al3+处理时(图7C):R2片段(-1052/-1)驱动的GUS活性在Al3+处理后提高了7.97倍,而R3构建(-914/-1)中GUS活性只有1.41倍的提高,说明片段-1052/-914对于启动子响应Al3+诱导是至关重要的,推测这一区域中含有的两个CuRE元件(-1041/-1038,-1014/-1011)参与了这一响应调控过程。
总结:不同的金属响应元件(如CuRE,动物MRE类似元件等)的组合介导了启动子对不同金属离子的响应;启动子中片段-583/-1就足以驱动报告基因在模式植物根中的特异表达;OsMT-I-4b启动子中不同区域,由于含有不同的金属响应元件,从而负责对不同类型的金属离子的响应;OsMT-I-4b启动子中不同的区域,对金属离子的响应具有特异性,将各个片段与报告基因融合,有可能会成为一种新的生物发光检测技术,用于监测环境中重金属污染的水平。
序列表
<110>清华大学
<120>具有诱导和组织特异表达特性的启动子
<130>CGGNARY102229
<160>2
<210>1
<211>1730
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa L.cv.)
<400>1
cccctcaaaa actgggccaa atctcaaaat aggcactccc tatccttttt tgaggttgtc 60
ttaaaaaatt tttactaaat ttgattttgt gtgctaaatt aaaaaaaaat ccgtccggaa 120
gaacctccta cagacaccca ctggtaataa cgaaattttg aaaatttaga tccgaaattg 180
taaaccctga gagcacccgc aatggtaaag taaggtgcta tctataaaac atgtacatct 240
cagcaataga ctaaattaat agtaaaccac ttcaatggta tgtctacatg ggtatctata 300
gctctctaat ccattgcctc gtttttctct atagactatc tccagattag tagatagctt 360
tgctctctct tcatttaatc tcttccaagt aggaaaatat gctgacatgg atctcttgta 420
gagagtctat agataaccat tgcgggtgcc ctgatacgat gccgtgcgat atcgatccca 480
acaatacttc aaattcagtg aggtatatgt attcgtgaag aagatgatcc gatcgactac 540
ttcagtgatg tgtatttagt tgtttgatta aaggcaacgt atttcaaatt tagttaatac 600
atgaacatgt tcagagcagg tttgatttgg tcatagaatc atcaaacaca aatgcagtct 660
agctcatgca ttaaatttaa attgaattcg tacagcaagt taatagaatt cgatgtgtac 720
aagataagtt taagtacgtg tctggtgtag ctcgcgccat ggatttgaag gagggatgat 780
ttggtcagta gcttgaggga tttgaattct tggcgtatga taaacttaag ttcaaaaaat 840
ataagacaca tcagttttat atttcaattc gtgtaaacca ttgaattcaa ttcttgcaag 900
aaatctgaat ttgcatattt caattcatac tcttagctca ttcaaattga catttgcacg 960
atgatgagtg tgccttttgg ggtggaactg gtataagttt gacttttggg gaatttaatc 1020
taatccagcg tggttgaagc aagaaatttg aattcaactc gtacaagaaa cgtattcaat 1080
ttcaagctgt gcactaatgc atctatctta agcaaagagt ctgcatcata gtactgatgc 1140
atgattgaaa cagctaagaa ctttatcaaa ttctgttttt cgtgatgaaa gtttaaatcc 1200
agttcataca aattcagatt gtttgcttta aatatgagca acaattcgtc tatcttaagc 1260
aaaggttgac atcatggtgt gaaagcaaat ttgaacctgg ccaaaacttg gattacattt 1320
gcccagaaac ttggttcaga ttaacagtaa ttaaaataat gcaaccgtgg tgcgtaagca 1380
actacataaa aatcgtcaat atttttatat ttttcggcac ttatcaatac tatattcaac 1440
taggaatgac acaattgcac cccaaacaaa tatgcttttt ttaaaactcc aagaaatgca 1500
tatagaaaac tgacgtcaat gaatgataat gatttttcaa ggccatttca accagctaca 1560
tctttctggc aagataatgc tttgacataa ttccgcagct tcttctcaag ggtactacta 1620
ctataaatag gagggcatat ctgaactgag ttcatatcaa gctttcaatc tctcatttca 1680
tccaactaca caagttcctg aagagtttac aagagaccca gaagatcaag 1730
<210>2
<211>142
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
aattccgcag cttcttctca aggttcctac tactataaat aggagggcat atctgaactg 60
agttcatatc aagctttcaa tctctcattt catccaacta cacaagttcc tgaagagttt 120
acaagagacc cagaagatca ag 142