CN101845437A - 具有诱导和组织特异表达特性的启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有诱导和组织特异表达特性的启动子。本发明提供的启动子为序列表的序列1所示的DNA分子或其部分片段。本发明提供的启动子可作为金属响应的启动子，应用于转基因植物工程中，用于获得对重金属高度耐受的农作物新品种，或用于培育可以大量累积重金属的植物。本发明提供的启动子可作为胁迫响应的启动子，应用于转基因植物工程中，用于获得对逆境耐受的农作物新品种。本发明提供的启动子可作为使目的蛋白在组织特异表达的启动子，应用于转基因植物工程中，用于获得在根中特异启动目的基因表达的农作物新品种。

Description

具有诱导和组织特异表达特性的启动子

技术领域

本发明涉及具有诱导和组织特异表达特性的启动子。

背景技术

重金属，如铜、锌等，可以作为酶或其它蛋白的辅助因子或结构组分，对植物正常的生长发育起着至关重要的作用。然而，当细胞内这些重金属离子的浓度升高时，将会对细胞产生毒害作用，并导致植物生长受到抑制。植物在长期的进化过程中，进化出一系列有效的分子机制用于重金属解毒，从而提高植物对重金属的耐受性，如利用一些生物分子对金属离子进行高度特异性螯合是其中最重要的机制之一。这些特异性的分子包括氨基酸、有机酸以及两类富含半胱氨酸多肽，植物螯合肽(phytochelatin，PC)和金属硫蛋白(metallothionein，MT)，金属硫蛋白可以结合金属离子，形成金属离子-硫簇，从而对胞内金属离子浓度的提高起到缓冲作用，降低重金属对细胞的毒性，在植物细胞中，PC的合成主要是由PC合成酶的转录后激活进行调控的，而MT蛋白是由一类基因(MT基因)所编码的。MT基因的转录过程中存在一系列精确的调控，因此对MT基因启动子进行分析和研究具有重要的意义，有助于揭示植物中MT基因的表达模式，如MT基因表达的组织特异性及其对金属诱导的响应特性等，并可以进一步为农作物的遗传改良提供新的材料。

到目前为止，已有100多个植物MT基因的全序列可以在数据库中直接获得。许多报导表明多数植物MT基因的表达具有组织特异性，而且这些基因编码的MT蛋白在许多植物的发育过程中发挥着重要的作用，如果实成熟、根的发育、栓化、授粉、种子成熟等过程中起着重要的作用。不同的MT基因由于不同的转录调控方式，因而具有不同的表达模式，编码的蛋白产物也特异地在相应的组织中发挥其功能。

在植物MT基因启动子对金属离子的响应特性方面，目前的研究报导还很少，还需要更加深入的研究，尤其是对金属响应的DNA顺式作用元件的鉴定等方面。现在植物中一个已知的金属响应元件是铜响应元件(copper response element，CuRE)，是研究人员从绿藻Chlamydomonas reinhardtii中分离得到的。CuRE含有一段保守的核心序列5’-GTAC-3’(Quinn JM，Merchant S(1995).Two copper-responsive elementsassociated with the Chlamydomonas Cyc6 gene function as targets fortranscriptional activators.Plant Cell 7，623-638.；Quinn JM，Barraco P，Eriksson M，Merchant S(2000).Coordinate copper-and oxygen-responsive Cyc6and Cpxl expression in Chlamydomonas is mediated by the same element.J.Biol.Chem.275，6080-6089.)。进一步的研究还发现了与CuRE结合的转录因子，铜响应因子(copper response regulator，CRR1)。在绿藻中，当铜缺乏时，CRR1可以结合到位点上，并激活下游基因的转录。另外也有报导证实，CuRE和CRR1在植物对镍离子的响应中也发挥重要的作用(Quinn JM，Kropat J，Merchant S(2003).Copperresponse element and Crr1-dependent Ni²⁺-responsive promoter for induced，reversible gene expression in Chlamydomonas reinhardtii.Eukaryot.Cell 2，995-1002.)。

在对金属响应元件及其相应的转录因子的鉴定方面，与植物中相对较少的研究相比，在酵母和动物细胞中的研究则较为深入系统。在酵母中，已有报导表明铜响应的MT基因上游启动子中含有一段金属响应元件(metal-responsive element，MRE)，它的核心序列为5’-HTHNNGCTGD-3’，与之对应的转录因子为ACE1。ACE1可以结合到MRE元件上，从而调控下游MT基因的转录。在动物中，MT基因对金属的响应是通过金属响应元件(metal-responsive element，MRE)介导的，MRE含有一段保守的DNA序列5’-TGCRCNC-3’，转录因子MRE-结合因子(MREbinding transcription factor-1，MTF-1)可以识别并结合到MRE元件上，激活下游MT基因的表达。在动物细胞中，MRE元件通常呈多个拷贝串联排列出现在MT基因上游的启动子区。

目前，有相关的报导表明在植物中也存在与动物MRE元件序列相似的顺式作用元件，这些元件在植物MT基因响应金属诱导过程中有重要作用。如吕世友等发现在水稻MT基因ricMT的启动子中，片段-331/-194对于启动子响应铜离子诱导起着至关重要的作用，该片段的缺失可以导致ricMT基因启动子对铜离子的不响应，进一步的序列分析发现在该片段中存在一段DNA序列，与动物MRE元件非常相似(LüSY，Gu HY，YuanXJ，Wang XM，Wu AM，Qu LJ et al.(2007).The GUS reporter-aided analysis ofthe promoter activities of a rice metallothionein gene reveals differentregulatory regions responsible for tissue-specific and inducible expressionin transgenic Arabidopsis.Transgenic Res.16，177-191.)。类似的情况在许多其它植物的MT基因中也有报道，如PsMTA(Fordham-Skelton AP，Lilley C，Urwin PE，Robinson NJ(1997).GUS expression in Arabidopsis directed by 5’-regions ofthe pea metallothionein-like gene PsMTA.Plant Mol.Biol.34，659-668.)，LeMTB(Whitelaw CA，LeHuquet JA，Thurman DA，Tomsett AB(1997).The isolation andcharacterization of type II metallothionein like genes from tomato(Lycopersicon esculentum L.).Plant Mol.Biol.33，503-511.)，PmMT(ChatthaiM，Osusky M，Osuska L，Yevtushenko D，Misra S(2004).Functional analysis ofa Douglas-fir metallothionein-like gene promoter：transient assays in zygoticand somatic embryos and stable transformation in transgenic tobacco.Planta220，118-128.)等。动物MRE类似序列也在其它非MT的金属响应基因中发现，如大豆(Phaseolus vulgaris)胁迫相关基因2(stress-related gene number 2，PvSR2)的表达受到多种金属离子的诱导，在该基因的启动子中，片段-222/-188驱动的GUS报告基因活性可以对重金属诱导响应，经HgCl₂处理后，GUS活性提高约8.2倍。这一片段中含有一个与动物MRE序列相似的元件，对该元件进行点突变后，该片段对金属离子的响应能力显著减弱，可见该元件在PvSR2基因响应金属诱导过程中具有重要作用(Qi XT，Zhang YX，Chai TY(2007).Characterization of a novel plant promoterspecifically induced by heavy metal and identification of the promoter regionsconferring heavy metal responsiveness.Plant Physiol.143，50-59.)。但是对于这些动物MRE类似元件在植物中是如何发挥其调控作用的，以及它对应的转录因子是什么等问题目前还知之甚少，还有待进一步的研究分析。

发明内容

本发明的目的是提供具有诱导和组织特异表达特性的启动子。

本发明提供的DNA片段(启动子)，为如下1)至8)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子(R1)；

2)序列表中序列1自5’端第679至1730位核苷酸所示的DNA分子(R2)；

3)序列表中序列1自5’端第817至1730位核苷酸所示的DNA分子(R3)；

4)序列表中序列1自5’端第1148至1730位核苷酸所示的DNA分子(R4)；

5)序列表中序列1自5’端第1589至1730位核苷酸所示的DNA分子(R5)；

6)序列表中序列2所示的DNA分子(R5m)；

7)在严格条件下与1)中6)中任一所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

8)与1)中6)中任一所述的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体可为在pCAMBIA-1381的多克隆位点插入所述DNA片段得到重组质粒，具体可为用所述DNA片段取代pCAMBIA-1381的BamH I和Spe I酶切识别位点间的小片段(CaMV 35S启动子)得到的重组质粒。

所述DNA片段可应用于启动目的基因表达。

所述目的基因表达可为诱导表达和/或组织特异表达。

所述组织特异表达中的组织具体可为根、花的柱头、萼片、花丝中的至少一种。

所述诱导表达具体可为为脱落酸诱导表达、黑暗诱导表达、盐胁迫诱导表达、干旱诱导表达和伤诱导表达中的至少一种。

所述诱导表达具体可为Pb²⁺离子诱导表达、A1³⁺离子诱导表达、Zn²⁺离子诱导表达、Cu²⁺离子诱导表达和Cd²⁺离子诱导表达中的至少一种。所述Pb²⁺离子具体来源于PbSO₄，所述Al³⁺离子具体来源于AlCl₃，所述Zn²⁺离子具体来源于ZnSO₄，所述Cu²⁺离子具体来源于CuSO₄，所述Cd²⁺离子具体来源于CdCl₂；所述诱导表达为根特异性表达。

所述DNA片段可应用于植物育种中。

本发明的启动子在生长期和成株期的拟南芥中均具有根特异性。本发明的启动子在生长期拟南芥的根和成株期拟南芥花的柱头中活性很高，在生长期拟南芥的地上部分活性较低，在茎中没有活性。本发明的启动子在莲座叶和茎生叶中只在排水器和表皮毛中具有活性，衰老叶片中只在排水器中具有活性，另外，在茎生叶中本发明的启动子具有伤诱导特性。拟南芥的花器官中：本发明的启动子在柱头顶部具有较强的活性，在萼片和花丝中也有一定活性，在花瓣的微观组织中具有相对较弱的活性。在幼嫩的果荚中：本发明的启动子主要在果荚的上半部分具有活性，随着果实的逐渐成熟，活性逐渐降低，当果荚完全成熟开裂时，几乎检测不到活性；在成熟的种子中，本发明的启动子没有活性。在拟南芥的根中，本发明的启动子受到各种环境信号的诱导(如ABA、干旱、暗处理等)，还受到多种金属离子的强烈诱导(如Cu²⁺，Zn²⁺，Pb²⁺和Al³⁺)，而且启动子响应的程度因金属离子的类型和浓度的不同而有所差异，根是植物与外界环境进行离子交换的最重要的部位。

在植物转基因工程中，启动子的选择是十分重要的。有时，利用组成型启动子在植物中过量表达某一目的基因，往往对植物的生长发育是有害的，甚至有时无法得到高表达的稳定的转基因植物。在这种情况下，诱导型表达的启动子，如金属诱导型启动子或胁迫诱导型启动子就是很好的选择。本发明提供的启动子可作为金属响应的启动子，应用于转基因植物工程中，用于获得对重金属高度耐受的农作物新品种，或用于培育可以大量累积重金属的植物。本发明提供的启动子可作为胁迫响应的启动子，应用于转基因植物工程中，用于获得对逆境耐受的农作物新品种。本发明提供的启动子可作为使目的蛋白在组织特异表达的启动子，应用于转基因植物工程中，用于获得在根中特异启动目的基因表达的农作物新品种。

附图说明

图1为OsMT-I-4b基因启动子序列中的顺式作用元件分析；翻译起始密码子ATG中A碱基记为+1位置；预测的CAAT和TATA box用灰色阴影并下划线表示；预测的与重金属诱导相关的元件用灰色阴影并方框表示；其它各种顺式作用元件用方框表示；所有的元件名称均标记在序列下方。

图2为拟南芥不同发育时期的GUS组织化学分析。

图3为幼苗在各种非生物胁迫条件下根中的GUS活性变化。

图4为幼苗在各种金属离子存在的条件下根中的GUS活性变化。

图5为幼苗在各种浓度金属离子存在的条件下根中的GUS活性变化。

图6为不同长度OsMT-I-4b启动子的缺失构建与转基因活性分析；左侧为不同长度OsMT-I-4b启动子缺失构建的示意图。其中代表推测的TATA box，代表预测的与动物MRE类似的顺式元件，0代表预测的CuRE元件，左侧数字表示每个缺失片段的5’-起始位点(以翻译起始位点定义为+1)；n.d.，检测不到GUS活性(not detectable)。

图7为转基因拟南芥根中，不同长度OsMT-I-4b启动子对金属离子的响应；图中横坐标表示转基因幼苗经Cu²⁺(100μM，A)、Pb²⁺(50μM，B)或Al³⁺(50μM，C)处理24h后，与处理前相比，根中GUS活性增长的倍数，纵坐标转入不同DNA片段(R1、R2、R3、R4、R5和R5m)的转基因植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。GUS活性测定中，实验都进行3次重复；每次实验中每个株系每个处理采用30-40株幼苗，标准误用误差线表示，*p＜0.05；**p＜0.01。

水稻中花10号(Oryza sativa L.cv.Zhonghua 10)：国家农作物种质保存中心，中国农业科学院作物科学研究所，邮编：100081；联系电话：010-68919715。

拟南芥Col-0：Columbia生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotypeColumbia)。

pCAMBIA-1381：Cambia Institute，澳大利亚。

农杆菌GV3101：中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号1.1488。

实施例1、OsMT-I-4b基因启动子的发现

根据水稻I型MT基因OsMT-I-4b的全长cDNA(NCBI序列号：NM_001073598)，利用PCR的方法，以水稻中花10号(Oryza sativa L.cv.Zhonghua 10)基因组DNA为模板，进行扩增，克隆得到OsMT-I-4b基因上游1730bp的DNA片段，并命名为POsMT-I-4b(OsMT-I-4b基因启动子)。POsMT-I-4b中的顺式作用元件分析见图1，将其中翻译起始密码子ATG中的A碱基定义为+1，该序列中存在两个基本启动子元件，TATA box和CAAT box，分别位于-109/-103和-214/-211区，这些元件在真核基因转录中作为基本元件发挥功能。

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)软件对OsMT-I-4b启动子中的顺式作用元件进行搜索预测，发现其中两个基本启动子元件的上游区域中，含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列：含有与动物MRE元件核心序列类似的元件，共4个拷贝串联分布，分别位于-1542/-1536、-1370/-1364、-371/-365和-275/-269处；与金属响应相关的元件CuRE元件，它以6个拷贝的形式串联分布于-1498/-1495、-1041/-1038、-1014/-1011、-670/-667、-600/-597和-119/-116处，这些可能的金属响应元件的存在，说明OsMT-I-4b基因对金属离子的响应过程存在复杂精细的调控；还存在一些其它的顺式作用元件，这些元件在其它许多植物基因启动子中都存在，如ABRE(-996/-989)，MYC(-1082/-1077、-415/-410)，MYB(-1467/-1462、-1297/-1292和-856/-851)等，这些元件与OsMT-I-4b基因响应ABA和其它胁迫信号有关；OsMT-I-4b中还包括2个拷贝的I-box(-1008/-1003、-311/-306)，该元件在光信号的传递和响应过程中其重要的调控作用；还包含2个拷贝的W-box(-465/-461、-336/-332)，它可以被WRKY类转录因子识别，并在OsMT-I-4b基因响应伤诱导中其作用。上述这些元件都与植物响应各种环境胁迫有关，它们的存在说明OsMT-I-4b基因启动子的活性除受到金属离子诱导外，可能还受到环境因素的诱导，如ABA、干旱、光信号、伤害等。

OsMT-I-4b基因启动子的核苷酸序列如序列表的序列1所示。

实施例2、转基因植株的获得

一、重组表达载体A的构建

1、以水稻中花10号的基因组DNA为模板，用特异性引物对R1(R1-F：5’-CAGGATCCCCCCTCAAAAACTG-3’/R1-R：5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’，下划线序列分别表示BamH I和Spe I酶切位点)进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化1.7kb左右的的DNA片段(启动子；-1730/-1；记为R1；序列表的序列1所示的DNA片段)。

2、用限制性内切酶BamH I和Spe I酶切步骤1回收的PCR产物。

3、用限制性内切酶BamH I和Spe I酶切植物表达载体pCAMBIA-1381，回收载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒。

5、将重组质粒进行测序，测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA-pMT-GUS(在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间，用序列表的序列1所示的DNA片段替换了原有的CaMV 35S启动子；又称重组质粒A)。

二、转基因植株的获得

1、将重组质粒A导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、利用农杆菌介导，通过花浸泡法(Clough SJ，Bent AF(1998).Floral-dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.16，735-743.)将重组质粒A导入拟南芥Col-0，得到T1代种子。T1代种子收获后在MS培养基(含有25mg/L潮霉素)中筛选抗性植株，将未出现性状分离的抗性植株(纯合子株系)移栽到土中，收获转基因植株的T2代种子。

三、转空载体对照植株的获得

用限制性内切酶BamH I和Spe I酶切pCAMBIA-1381，回收载体骨架，用DNA聚合酶I的Klenow片段补平载体骨架的粘性末端，然后用T4DNA连接酶使载体环化，得到GUS报告基因上游不含任何启动子的空载体。用空载体代替重组质粒A，其它步骤同步骤二，得到转空载体对照植株的T2代种子。

实施例3、启动子的组织特异性

将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代进行GUS组织化学染色，以确定其组织特异性。拟南芥种子经表面消毒后，铺在1/2MS(pH 5.8，1.5％蔗糖，0.75％琼脂)平板上，经过4℃春化2天后，置于22℃培养箱中，光照16h，黑暗8h培养。在培养基上生长两周后，拟南芥幼苗被移植到营养土中，继续生长。

转基因拟南芥中GUS的组织化学检测按照Jefferson等(Jefferson RA，KavanaghTA，Bevan MW(1987).GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants.EMBO J.6，3901-3907.)的方法进行。具体步骤：取幼苗或其发育过程的各个器官，在含0.5％多聚甲醛的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)固定30min；然后置于GUS反应液中(含0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.0 10mMEDTA，5mM铁氰化钾，1.0mM X-gluc及0.1％Triton X-100)，于30℃放置过夜；观察植物的着色强度。幼苗或光合组织用70-100％系列乙醇脱色以去掉叶绿素，在体视镜(Olympus，Japan)下观察并照相。

GUS着色情况如图2所示。图2中，图2a为1天大拟南芥幼苗，图2b为3天大拟南芥幼苗，图2c为5天大拟南芥幼苗，图2d为10天大拟南芥幼苗，图2e为20天大拟南芥幼苗的莲座叶，图2f为35天大拟南芥幼苗的莲座叶，图2g为35天大拟南芥幼苗的茎生叶，图2h为拟南芥的衰老叶片，图2i为拟南芥的衰老叶片的局部放大图，图2j为35天大拟南芥的茎，图2k为40天大拟南芥的成熟花器官，图21为40天大拟南芥的幼花，图2m为45天大拟南芥的幼嫩果荚，图2n为55天大拟南芥的成熟果荚，图2o为空载体对照拟南芥35天大的莲座叶(左)和茎生叶(右)。

1天大拟南芥幼苗中，可见GUS活性在子叶和胚根中相对较高，而在胚轴中相对较弱。3天大和5天大的幼苗中，GUS着色情况有所改变，GUS活性主要分布在胚根和胚轴中，而在子叶中的活性较低。在10天大的幼苗中，根中仍保持较强的GUS活性，另外在第1对真叶中也能检测到GUS报告基因的表达。在1-10天大幼苗的根尖都检测不到GUS着色。对于转化空载体拟南芥幼苗，各个生长时间均检测不到任何GUS着色。

对于成熟拟南芥，根中同样能检测到较高的GUS活性。如在20天大和35天大的转基因拟南芥的莲座叶中，GUS活性只在排水器和表皮毛中可以检测到，在茎生叶的排水器和表皮毛中也能检测到GUS着色。而在衰老叶片中，只能在排水器中检测到GUS活性。另外，在茎生叶中受伤部位周围可以检测到GUS着色，而在莲座叶的受伤部位则检测不到，说明OsMT-I-4b启动子特异地在茎生叶中对伤诱导有响应。在成熟拟南芥的茎中无明显的GUS着色。对于转化空载体拟南芥植株，各个组织中均检测不到任何GUS着色。

拟南芥的花器官中：在柱头顶部可以检测到较强的GUS活性；在萼片和花丝中也有一定的GUS着色；另外在花瓣的微观组织中也能检测到相对较弱的GUS活性；在幼嫩的果荚中，GUS着色主要分布在果荚的上半部分，随着果实的逐渐成熟，GUS活性逐渐降低，当果荚完全成熟开裂时，几乎检测不到GUS活性；在成熟的种子中也检测不到GUS着色。在转化空载体的拟南芥植物的花器官、果荚和种子中都检测不到GUS活性。

启动子在转基因拟南芥幼苗的根中表现出很高的活性。启动子活性在转基因拟南芥的叶片中虽然比较低，但主要集中在叶片的表皮毛和叶缘的排水器中，这两个部位都是植物体内重金属离子通过叶片向外排出的重要途径。在生殖生长阶段，启动子驱动的GUS主要在花器官的柱头、花丝和萼片中有较强的着色。花的发育过程需要多种金属离子的参与。OsMT-I-4b的特异性高表达可能有助于花中金属离子的转运和交换，从而在花发育过程中起重要作用。以上结果说明，无论是在营养生长阶段，还是生殖生长阶段，OsMT-I-4b启动子的活性都受到复杂的调控，从而保证OsMT-I-4b基因特异地在某些组织中表达并发挥功能。

实施例4、启动子的诱导表达(对ABA和非生物胁迫处理的响应能力)

将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代分别进行各种胁迫处理，然后进行GUS活性测定，以确定其诱导表达特性。

1、进行各种胁迫处理

拟南芥种子经表面消毒后，铺在1/2MS(pH 5.8，1.5％蔗糖，0.75％琼脂)平板上，经过4℃春化2天后，置于22℃培养箱中，光照16h，黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集，用去离子水清洗2次后，分成5组，分别进行如下处理：

干旱胁迫处理(干旱)：将幼苗置于干的滤纸(Whatman，3mm)上，在空气湿度为60％的培养箱中处理6h；

盐胁迫处理(高盐)：将幼苗置于浸满100mM NaCl水溶液的滤纸上，于培养箱中处理6h；

黑暗胁迫处理(暗处理)：将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上，并于22℃下避光培养6h；

脱落酸(ABA)处理：将幼苗置于浸满100μM ABA水溶液的滤纸上，于培养箱中处理6h；

对照处理(对照)：将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上，于培养箱中处理6h。

处理完毕后，分别收集未处理和不同处理后的拟南芥幼苗的根和地上部分，将其在液氮中速冻，用于随后的GUS活性测定。

2、GUS活性测定

(1)收集拟南芥材料，在研钵中加入液氮研磨成粉末，悬浮在GUS提取缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0；0.1％Triton X-100，10mM β-疏基乙醇，10mM 1，2-环己二胺-N，N，N，N-四乙酸，0.1％月桂酸钠)中，12,000×g、4℃离心10min后收集上清。

(2)蛋白质的浓度按照Bradford的方法(Bradford MM(1976).A rapid andsensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72，248-254.)定量。用牛血清白蛋白(BSA)作标准曲线。

(3)Jefferson等的荧光测定法(Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW(1987).GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion markerin higher plants.EMBO J.6，3901-3907.)测定GUS活性。反应底物为4-甲基-伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside，4-MUG)，检测不同反应时间的样品中，在激发光365nm、发射光455nm、狭缝10nm条件下各样品的荧光强度。

(4)计算GUS的活性。GUS活性以每mg可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-甲基-伞形酮(4-methyl-umbelliferone，4-MU)为单位。以未处理样品中的GUS活性为1.0，计算各种处理后样品中的相对GUS活性。

幼苗在各种非生物胁迫条件下根中的GUS活性变化见图3。未经任何处理时，GUS活性为150.01pmol MU/min/mg蛋白，经去离子水处理6h后，GUS活性为171.03pmolMU/min/mg蛋白，与处理前的对照相比，无显著差异。100μM ABA胁迫6h后，GUS活性提高了7.65倍。干旱胁迫6h后，GUS活性提高了5.38倍。黑暗胁迫6h后，GUS活性提高了3.57倍。盐胁迫6h后，GUS活性只有较少的提高，为364.51pmol MU/min/mg蛋白，是对照活性的2.43倍。这些结果说明，OsMT-I-4b启动子对不同的环境胁迫有不同程度的响应。

与对照组相比，各种处理后拟南芥的地上部分的GUS活性并未出现显著性差异。

以上结果说明，该启动子对各种环境胁迫的响应是根特异的。

实施例5、启动子对各种金属离子的响应情况

将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代分别进行各种金属离子处理，然后进行GUS活性测定，以确定其诱导表达特性。

1、进行各种金属离子处理

拟南芥种子经表面消毒后，铺在1/2MS(pH 5.8，1.5％蔗糖，0.75％琼脂)平板上，经过4℃春化2天后，置于22℃培养箱中，光照16h，黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集，用去离子水清洗2次后，分成7组，分别进行如下处理：

CuSO₄处理：将幼苗置于浸满100μM CuSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

ZnSO₄处理：将幼苗置于浸满100μM ZnSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

CoCl₂处理：将幼苗置于浸满100μM CoCl₂水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

CdCl₂处理：将幼苗置于浸满50μM CdCl₂水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

PbSO₄处理：将幼苗置于浸满20μM PbSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

AlCl₃处理：将幼苗置于浸满50μM AlCl₃水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

对照处理：将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上，于培养箱中处理6h。

处理完毕后，分别收集未处理和不同处理后的拟南芥幼苗的根和地上部分，将其在液氮中速冻，用于随后的GUS活性测定。

2、GUS活性测定

同实施例4的步骤2。

幼苗在各种金属离子存在的条件下根中的GUS活性变化见图4。对照处理中，GUS活性没有显著提高。Pb²⁺处理后GUS活性提高的倍数最高(10.38倍)。之后，依次为Al³⁺和Zn²⁺处理，经24h的诱导后GUS活性分别提高了8.24倍和8.06倍。Cu²⁺诱导后，GUS活性也有6.64倍的提高。Cd²⁺处理后，GUS活性只提高了2.07倍。Co²⁺处理后，GUS活性与对照组相比，没有显著性的差异(p＞0.05)，说明启动子在拟南芥根中对Co²⁺不响应。与对照组相比，各种处理后拟南芥的地上部分的GUS活性未出现显著性差异。

以上结果说明，该启动子对各种金属离子的响应是根特异的。

实施例6、启动子对各种浓度的金属离子的响应情况

将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代分别进行各种浓度金属离子处理，然后进行GUS活性测定，以确定其诱导表达特性。

1、进行各种浓度金属离子处理

拟南芥种子经表面消毒后，铺在1/2MS(pH 5.8，1.5％蔗糖，0.75％琼脂)平板上，经过4℃春化2天后，置于22℃培养箱中，光照16h，黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集，用去离子水清洗2次后，分成13组，分别进行如下处理：

CuSO₄高浓度处理：将幼苗置于浸满200μM CuSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

CuSO₄中浓度处理：将幼苗置于浸满100μM CuSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

CuSO₄低浓度处理：将幼苗置于浸满50μM CuSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

ZnSO₄高浓度处理：将幼苗置于浸满200μM ZnSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

ZnSO₄中浓度处理：将幼苗置于浸满100μM ZnSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

ZnSO₄低浓度处理：将幼苗置于浸满50μM ZnSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

PbSO₄高浓度处理：将幼苗置于浸满50μM PbSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

PbSO₄中浓度处理：将幼苗置于浸满20μM PbSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

PbSO₄低浓度处理：将幼苗置于浸满10μM PbSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

AlCl₃高浓度处理：将幼苗置于浸满100μM AlCl₃水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

AlCl₃中浓度处理：将幼苗置于浸满50μM AlCl₃水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

AlCl₃低浓度处理：将幼苗置于浸满25μM AlCl₃水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

对照处理：将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上，于培养箱中处理6h。

处理完毕后，分别收集处理前和不同处理后的拟南芥幼苗的根，将其在液氮中速冻，用于随后的GUS活性测定。

2、GUS活性测定

同实施例4的步骤2。

幼苗在各种浓度金属离子存在的条件下根中的GUS活性变化见图5。对照处理中，GUS活性没有显著提高。随着Cu²⁺浓度的提高，GUS活性逐渐升高，至Cu²⁺达到100μM时，GUS活性最高(为对照组的6.93倍)，但当Cu²⁺浓度升高至200μM时，GUS活性反而有所降低(为对照组的5.02倍)。在0-100μM Zn²⁺处理时，GUS活性逐渐升高，而在200μM Zn²⁺处理时，GUS活性只有100μM处理时的84.6％。当25μM和50μM Al³⁺处理后，GUS活性较对照组比有了显著的升高，分别提高了5.25倍和8.59倍，而当Al³⁺浓度达到100μM时，GUS活性降低，只是对照组的6.37倍。在一定的Pb²⁺浓度范围(0-50μM)内，OsMT-I-4b启动子活性随着Pb²⁺浓度的升高而逐渐升高。在高浓度金属离子处理时，转基因植物根中GUS活性不升反降，推测可能是由于高浓度的金属离子对细胞的毒害作用引起的。总结以上结果，说明对于不同的金属离子诱导及不同的诱导浓度，OsMT-I-4b启动子的响应程度不同。

实施例7、启动子中的各个片段的功能验证

为了深入研究OsMT-I-4b启动子活性的复杂调控机制，并对该启动子中对特异金属离子诱导的响应区域和元件进行定位，对启动子进行了缺失分析。

一、重组表达载体的构建

1、重组质粒B的构建

重组质粒B：在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间，用序列表的序列1所示的DNA片段的-1052/-1(-1052/-1；记为R2；序列表的序列1自5’端第679至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R2(R2-F/R1-R)代替特异性引物对R1，其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。

R2-F：5’-TTGGATCCAAATTGAATTCGTACAGC-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点)；

R1-R：5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。

2、重组质粒C的构建

重组质粒C：在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间，用序列表的序列1所示的DNA片段的-914/-1(-914/-1；记为R3；序列表的序列1自5’端第817至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R3(R3-F/R1-R)代替特异性引物对R1，其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。

R3-F：5’-CTGGATCCATGATAAACTTAAGTTC-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点)；

R1-R：5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。

3、重组质粒D的构建

重组质粒D：在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间，用序列表的序列1所示的DNA片段的-583/-1(-583/-1；记为R4；序列表的序列1自5’端第1148至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R4(R4-F/R1-R)代替特异性引物对R1，其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。

R4-F：5’-CAGGATCCAAACAGCTAAGAACTTT-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点)；

R1-R：5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。

4、重组质粒E的构建

重组质粒E：在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间，用序列表的序列1所示的DNA片段的-142/-1(-142/-1；记为R5；序列表的序列1自5’端第1589至1730位核苷酸所示的DNA片段)替换了原有的CaMV 35S启动子。采用特异性引物对R5(R5-F/R1-R)代替特异性引物对R1，其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。

R5-F：5’-TTGGATCCAATTCCGCAGCTTCTT-3’(下划线序列表示BamH I酶切位点)；

R1-R：5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。

5、重组质粒F的构建

①在R5片段中引入点突变

重组质粒F：在出发载体的BamH I和Spe I酶切位点之间，用R5m片段(序列表的序列2)替换了原有的CaMV 35S启动子。R5m片段：R5片段中，-119至-116位(序列1自5’端第1612位核苷酸和第1615位核苷酸)的CuRE元件的核心序列GTAC被突变为TTCC，用于分析这个距离TATA box最近的可能的CuRE元件在启动子活性调节中的作用。采用特异性引物对R5m(R5m-F/R1-R)代替特异性引物对R1，其它同实施例2的步骤一中重组质粒A的构建方法。在R5片段中引入点突变是通过在PCR引物的对应位点引入突变而实现的。

R5m-F：5’-TTGGATCCAATTCCGCAGCTTCTTCTCAAGG

T

CTA-3’；(下划线序列表示BamH I酶切位点；双下划线序列表示引入的突变位点：G→T，A→C)；

R1-R：5’-GCACTAGTCTTGATCTTCTGGGTC-3’(下划线序列表示Spe I酶切位点)。

二、转基因植株的获得

同实施例2的步骤二。收获转基因植株的T2代种子。

三、各个片段的启动活性比较

将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代、本实施例得到的各种转基因植株的T2代分别正常培养，然后对10天龄幼苗进行GUS活性测定。GUS活性测定同实施例4的步骤2。

R1片段、R2片段、R3片段、R4片段、R5片段和R5m片段及其GUS活性测定结果如图6所示。

各个片段均具有不同程度的启动子活性。在转基因幼苗的根中，GUS活性明显高于地上部分。地上部分：R1驱动的GUS活性最高(24.68pmol MU/min/mg蛋白)，然后随着5’序列的不断缺失，GUS活性逐渐降低。在构建R5m中，由于-119/-116位CuRE元件的突变，GUS活性比其野生型形式R5中的GUS活性下降了约26.4％。根：R4片段(-583/-1)驱动的GUS活性最高，为225.96pmol MU/min/mg蛋白，略高于由全长启动子驱动的GUS活性(R1，210.58pmol MU/min/mg蛋白)。当启动子片段缺失到-142(R5)时，GUS活性只有23.47pmol MU/min/mg蛋白，约为最高GUS活性(R4)的10.4％。与R5相比，其突变形式R5m中，GUS活性没有显著差异。上述结果说明，OsMT-I-4b启动子中片段即可驱动下游报告基因在拟南芥根中特异地大量表达，而在拟南芥的地上部分中大量表达，则需要全长启动子片段的参与。

四、各个片段对各种金属离子响应能力的比较

将实施例2得到的转基因植株的T2代和转空载体对照的T2代、本实施例得到的各种转基因植株的T2代种子分别经表面消毒后，铺在1/2MS(pH 5.8，1.5％蔗糖，0.75％琼脂)平板上，经过4℃春化2天后，置于22℃培养箱中，光照16h，黑暗8h培养。将1/2MS平板上生长10天的幼苗收集，用去离子水清洗2次后，分成4组，分别进行如下处理：

CuSO₄处理：将幼苗置于浸满100μM CuSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

PbSO₄处理：将幼苗置于浸满50μM PbSO₄水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

AlCl₃处理：将幼苗置于浸满50μM AlCl₃水溶液的滤纸上，于培养箱中处理24h；

对照处理：将幼苗置于浸满去离子水的滤纸上，于培养箱中处理6h。

处理完毕后，分别收集处理前和不同处理后的拟南芥幼苗的根和地上部分，将其在液氮中速冻，用于随后的GUS活性测定。

GUS活性测定同实施例4的步骤2。

与对照组相比，各种处理后拟南芥的地上部分的GUS活性并未出现显著性差异。

根的GUS活性测定结果如图7所示。

经Cu²⁺诱导24h后(图7A)：全长启动子片段(R1，-1730/-1)驱动的GUS活性提高了6.93倍，这是在所有启动子缺失片段中，GUS活性提高倍数最高的；R2片段(-1052/-1)中，虽然启动子中缺失了2个MRE类似元件(-1542/-1536，-1370/-1364)和1个CuRE元件(-1498/-1495)，但它驱动的活性经相同诱导后仍有6.19倍的提高；在R3片段(-914/-1)中，启动子中5’侧第2个和第3个CuRE元件进一步发生缺失，Cu²⁺处理使其驱动的GUS基因表达提高了3.08倍，而在R4(-583/-1)构建中，随着两个CuRE元件(-670/-667，-600/-597)的进一步缺失，该片段对Cu²⁺诱导不响应，诱导后GUS活性只有诱导前GUS活性的0.77倍；与R4片段类似，R5片段(-142/-1)也对Cu²⁺诱导不响应。以上结果说明，片段-1052/-583对于启动子响应Cu²⁺诱导是必需的，这一片段中含有4个可能的CuRE元件，推测OsMT-I-4b启动子对Cu²⁺的响应调控是由这些元件介导完成的。

对Pb²⁺响应程度(图7B)：最高的是全长启动子片段(R1)，GUS活性提高了10.38倍，之后随着启动子片段的缺失，启动子对Pb²⁺诱导的响应能力逐渐减弱；当缺失至-142位(R5构建)时，Pb²⁺处理后，GUS活性只有2.01倍的提高；若R5片段中CuRE元件发生突变(R5m构建)，经Pb²⁺诱导后，GUS活性只提高了1.51倍。这些结果说明，OsMT-I-4b启动子对Pb²⁺处理的响应需要全长启动子中各个元件的参与。

在Al³⁺处理时(图7C)：R2片段(-1052/-1)驱动的GUS活性在Al³⁺处理后提高了7.97倍，而R3构建(-914/-1)中GUS活性只有1.41倍的提高，说明片段-1052/-914对于启动子响应Al³⁺诱导是至关重要的，推测这一区域中含有的两个CuRE元件(-1041/-1038，-1014/-1011)参与了这一响应调控过程。

总结：不同的金属响应元件(如CuRE，动物MRE类似元件等)的组合介导了启动子对不同金属离子的响应；启动子中片段-583/-1就足以驱动报告基因在模式植物根中的特异表达；OsMT-I-4b启动子中不同区域，由于含有不同的金属响应元件，从而负责对不同类型的金属离子的响应；OsMT-I-4b启动子中不同的区域，对金属离子的响应具有特异性，将各个片段与报告基因融合，有可能会成为一种新的生物发光检测技术，用于监测环境中重金属污染的水平。

序列表

<110>清华大学

<120>具有诱导和组织特异表达特性的启动子

 

<130>CGGNARY102229

 

<160>2

 

<210>1

<211>1730

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.cv.)

 

<400>1

cccctcaaaa actgggccaa atctcaaaat aggcactccc tatccttttt tgaggttgtc     60

ttaaaaaatt tttactaaat ttgattttgt gtgctaaatt aaaaaaaaat ccgtccggaa    120

gaacctccta cagacaccca ctggtaataa cgaaattttg aaaatttaga tccgaaattg    180

taaaccctga gagcacccgc aatggtaaag taaggtgcta tctataaaac atgtacatct    240

cagcaataga ctaaattaat agtaaaccac ttcaatggta tgtctacatg ggtatctata    300

gctctctaat ccattgcctc gtttttctct atagactatc tccagattag tagatagctt    360

tgctctctct tcatttaatc tcttccaagt aggaaaatat gctgacatgg atctcttgta    420

gagagtctat agataaccat tgcgggtgcc ctgatacgat gccgtgcgat atcgatccca    480

acaatacttc aaattcagtg aggtatatgt attcgtgaag aagatgatcc gatcgactac    540

ttcagtgatg tgtatttagt tgtttgatta aaggcaacgt atttcaaatt tagttaatac    600

atgaacatgt tcagagcagg tttgatttgg tcatagaatc atcaaacaca aatgcagtct    660

agctcatgca ttaaatttaa attgaattcg tacagcaagt taatagaatt cgatgtgtac    720

aagataagtt taagtacgtg tctggtgtag ctcgcgccat ggatttgaag gagggatgat    780

ttggtcagta gcttgaggga tttgaattct tggcgtatga taaacttaag ttcaaaaaat    840

ataagacaca tcagttttat atttcaattc gtgtaaacca ttgaattcaa ttcttgcaag    900

aaatctgaat ttgcatattt caattcatac tcttagctca ttcaaattga catttgcacg    960

atgatgagtg tgccttttgg ggtggaactg gtataagttt gacttttggg gaatttaatc  1020

taatccagcg tggttgaagc aagaaatttg aattcaactc gtacaagaaa cgtattcaat  1080

ttcaagctgt gcactaatgc atctatctta agcaaagagt ctgcatcata gtactgatgc  1140

atgattgaaa cagctaagaa ctttatcaaa ttctgttttt cgtgatgaaa gtttaaatcc  1200

agttcataca aattcagatt gtttgcttta aatatgagca acaattcgtc tatcttaagc  1260

aaaggttgac atcatggtgt gaaagcaaat ttgaacctgg ccaaaacttg gattacattt  1320

gcccagaaac ttggttcaga ttaacagtaa ttaaaataat gcaaccgtgg tgcgtaagca  1380

actacataaa aatcgtcaat atttttatat ttttcggcac ttatcaatac tatattcaac  1440

taggaatgac acaattgcac cccaaacaaa tatgcttttt ttaaaactcc aagaaatgca  1500

tatagaaaac tgacgtcaat gaatgataat gatttttcaa ggccatttca accagctaca  1560

tctttctggc aagataatgc tttgacataa ttccgcagct tcttctcaag ggtactacta  1620

ctataaatag gagggcatat ctgaactgag ttcatatcaa gctttcaatc tctcatttca  1680

tccaactaca caagttcctg aagagtttac aagagaccca gaagatcaag             1730

 

<210>2

<211>142

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

 

<223>

 

<400>2

aattccgcag cttcttctca aggttcctac tactataaat aggagggcat atctgaactg     60

agttcatatc aagctttcaa tctctcattt catccaacta cacaagttcc tgaagagttt    120

acaagagacc cagaagatca ag                                             142

Claims (10)

1.DNA片段，为如下1)至8)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’端第679至1730位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列1自5’端第817至1730位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表中序列1自5’端第1148至1730位核苷酸所示的DNA分子；

5)序列表中序列1自5’端第1589至1730位核苷酸所示的DNA分子；

6)序列表中序列2所示的DNA分子；

7)在严格条件下与1)中6)中任一所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

8)与1)中6)中任一所述的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pCAMBIA-1381的多克隆位点插入权利要求1所述DNA片段得到重组质粒；所述重组载体优选为用权利要求1所述DNA片段取代pCAMBIA-1381的BamH I和Spe I酶切识别位点间的小片段得到的重组质粒。

4.权利要求1所述DNA片段在启动植物中目的基因表达中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述目的基因表达为诱导表达和/或组织特异表达。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述组织特异表达中的组织为根、花的柱头、萼片、花丝中的至少一种。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述诱导表达为脱落酸诱导表达、黑暗诱导表达、盐胁迫诱导表达、干旱诱导表达和伤诱导表达中的至少一种。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述诱导表达为Pb²⁺离子诱导表达、Al³⁺离子诱导表达、Zn²⁺离子诱导表达、Cu²⁺离子诱导表达和Cd²⁺离子诱导表达中的至少一种。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述Pb²⁺离子来源于PbSO₄，所述Al³⁺离子来源于AlCl₃，所述Zn²⁺离子来源于ZnSO₄，所述Cu²⁺离子来源于CuSO₄，所述Cd²⁺离子来源于CdCl₂；所述诱导表达为根特异性表达；所述植物为拟南芥，优选哥伦比亚生态型拟南芥；所述目的基因为GUS基因。

10.权利要求1所述DNA片段在植物育种中的应用。

Images