CN102154296B - 一个棉花根部高效表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因启动子及其应用，属于生物技术领域。本发明获得了一个海岛棉黄萎病抗性相关基因Ve-5的启动子pgbv-5，Place分析表明其含有抗病相关调控元件，水杨酸，生长素，赤霉酸，乙烯、茉莉酸甲酯等激素诱导元件。同时，该启动子序列还含有较多的光调控元件。该启动子可以使目的基因在根部高效表达，特别是根冠、生长点以及部分伸长区的表达量最高。在叶片，花器官，荚这些组织中表达量很低或基本不表达。水杨酸，赤霉素以及吲哚乙酸处理拟南芥植株后GUS活性均有显著上升，说明该启动子为一个根部以及激素诱导的启动子。

Description

一个棉花根部高效表达的启动子及其应用

一、技术领域

本发明涉及植物基因启动子及其应用，提供了一个棉花根部高效表达以及诱导型启动子。属于生物技术领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性，抗逆性和其他有益的生产性状。

二、背景技术

植病界普遍认为的五大难防治的病害为土传病害、维管束病害、病毒病害、细菌病害和线虫病害，土传病害由于危害性既广泛又严重，所以被列为这五大难防治的病害之首。而黄萎病是土壤传播的维管束病害，其防治难度相当大，到目前为止，尚未有特效的防治药剂。棉花是世界重要的经济作物，棉花的真菌病害、细菌病害以及线虫都会造成产量减少以及品质下降。棉花黄萎病是棉花生产中的最主要病害之一，广泛分布于世界各产棉国，目前主要依靠种植抗病品种为主的综合防治措施，但目前我国棉花品种的抗病性只能达到耐病水平，致使该病在环境条件合适的情况下连续流行危害，控制该病的猖獗危害已成为棉花，尤其是转Bt基因抗虫棉生产可持续发展的主要问题之一。

黄萎病是由土壤中的真菌繁殖体或微菌核萌发引起的，产生的菌丝体成功侵入感病品种的根部后进入维管组织，随着蒸腾作用向植株的茎和叶片扩展，最终侵染整个植株 (Garber R.H., Tolmsoff W.J., Puhalla J.E., Howell C.R., Bell A.A., Wiles A.B., SchnathorstW.C., Brinkerhoff L.A., Barrow J.R., and Minton E.B.. Verticillium wilt of cotton, In: Garber C.D. (ed.), National cotton pathology laboratory, proceedings of a work conference, 30 August-1 September, 1971 (1973), Texas, USA, pp.69-77)。科研人员对黄萎病入侵棉花的过程有过详尽的观察，发现病原菌的侵入点位于寄主植物的根尖部分。Gerik 和Huisman (Gerik J.S., and Huisman O.C.. Study of field-grown cotton roots infected with Verticillium dahliae using an immunoenzymatic staining technique. Phytopathology, 1988,78: 1174-1178)研究发现大丽轮枝菌的初始侵入点只发生在寄主植物的根尖部分，并且根表面的菌量较少，而根部的内皮层中存在大量病原菌。Bowers 等(Bowers J.H., Nameth S.T., Riedel R.M., and Rowe R.C.. Infection and colonization of potato roots by Verticillium dahliae as affected by Pratylenchus penetrans and P. crenatus. Phytopathology, 1996,86(6): 614-621)研究也表明黄萎病对马铃薯根部的侵染发生在根尖。棉花的根尖由根冠、分生区、伸长区和成熟区四部分组成。根冠位于根尖分生区的前端，黄萎病菌从根冠区侵入后，侵染菌丝通常在细胞间隙或直接穿过细胞壁在根冠细胞内扩展，绝大部分菌丝沿着根部纵轴向植株的根基方向生长(Garber R.H., and Houston B.R.. Penetration and development of Verticillium albo-atrum in the cotton plant, Phytopathology, 1966, 56: 1121-1126)。所以，根尖处是病原菌与寄主植物最先接触的地方，植物的抗病反应也最先在这里发生。 

抗病反应是由病原物无毒基因（avr）编码的激发子与寄主植物相应的抗病基因（R）编码激发子的受体分子相作用产生的一系列信号传导以及代谢过程。抗性基因的克隆一直是抗病研究的热点与难点，对于黄萎病抗性基因的克隆一直进展缓慢。直到Kawchuk等(Kawchuk L, Hachey J. Lynch D. Tomato Ve disease resistance genes encode cell surface-like receptors. PNAS, 2001, 98 (11): 6511–6515)才利用图位克隆从番茄抗黄萎材料中克隆了抗病基因Ve1，Ve2。Ve基因是第一个克隆得到的黄萎病抗性基因，Ve基因的抗性效果很好，将Ve1和Ve2分别转入感病土豆中，转基因土豆表现为抗黄萎病。Ve基因是一种表面受体蛋白（RLP）并位于细胞膜上，认为其抗性作用是感受来自于膜外的病原菌的激发子，并将抗性反应信号传递给下游的防卫反应基因。正是由于抗病基因启动抗性反应具有时空特异性，其启动子往往具有某些特殊的顺式作用元件，可以利用抗病基因、尤其是其顺式元件为基因工程改良提供有利的工具。但是黄萎病抗性基因Ve的启动子还没有任何相关研究报道。

植物基因启动子是重要的顺式作用元件,是位于结构基因5′端上游区的DNA 序列, 是转录调控的中心。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是：它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。植物的根部是唯一生长于地下部的器官,它不仅具有吸收、运输、贮存养分的重要作用,也是在某些逆境条件下植物自身防卫系统的一部分。而根尖不仅是根在土壤生长的关键部位，也是与土壤中病原物最先接触的部分。正是由于这一特殊性，根部以及根尖特异启动子在植物抗病以及抗逆性改良和植物品质改良中有广泛的应用。目前虽然这类特异启动子的相关报道较少，但是已经显现其良好的应用价值。Campillo等利用根冠启动子－拟南芥内源β-1,4-D葡聚糖酶启动子来研究根部的发育（Campillo E, Abdel-Aziz A, Crawford D, et al. Root cap specific expression of an endo-β-1,4-D-glucanase (cellulase):a new marker to study root development in Arabidopsis. Plant Molecular Biology, 2004, 56: 309–323）。Lilley等利用拟南芥根冠特异启动子MDK4-20将线虫抗性肽分别转入拟南芥和马铃薯，转化株的抗性分别达到80%和95%（Lilley CJ, Wang D, Atkinson HJ, et al. Effective delivery of a nematode-repellent peptide using a root-cap-specific promoter. Plant Biotechnol J, 2011, 9(2):151-161.）。

棉花黄萎病抗性基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为抗性新种质的培育奠定基础。本发明的发明人通过筛选棉花基因组文库获得了棉花多个胞外受体蛋白基因，这些基因与番茄     Ve基因氨基酸序列具有部分同源性。并进而通过染色体步移获得了它们的启动子序列。由于棉花再生体系的困难，一些研究小组采用模式植物烟草(Hsu CY, Creech RG, Jenkins JN, Ma DP. Analysis of promoter activity of cotton lipid transfer protein gene LTP6 in transgenic tobacco plants. Plant Sci 1999;143:63-70.)或拟南芥(Wang S, Wang J W, Yu N, Li Ch H，Luo B, Gou J Y, Wang L J, Chen X Y. Control of Plant Trichome Development by a Cotton Fiber MYB Gene. The Plant Cell 2004, 16: 2323-2334)来对棉花启动子进行分析，其研究结果表明GUS报告基因完全可以在这些模式植物中正常表达。本发明提供了黄萎病抗性材料海岛棉品种H7124中一个胞外受体基因的启动子序列。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个棉花根部高效表达启动子，该启动子在植物生长幼期以及成熟期都能够在根部高效表达，特别是根冠、生长点以及部分伸长区的表达量最高。该启动子还能被水杨酸、生长素以及赤霉素所激活。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病、抗虫性状及抗非生物逆境。

技术方案                                                                                                       

本发明所提供的一个棉花根部高效表达以及激素诱导启动子pgbv-5，来源于海岛棉H7124(Gossypium Barbadense L)，是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE (15mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 0.1mM EDTA) 、 0.1×SSC (15mM NaCl, 1.5mM 柠檬酸钠)、0.1％ SDS（十二烷基磺酸钠）的溶液中，65℃条件下洗膜。序列表中的SEQ ID NO.1由1778个碱基组成。自5’端第1742位碱基为转录起始位点, 记为+1。

本发明提供了含有本发明启动子的表达载体和宿主菌以及扩增启动子任一片段的引物序列。

拟南芥转基因证明发现本发明棉花根部高效表达启动子pgbv-5能赋予GUS基因在植物根部高效表达。另外，转基因植株受到水杨酸，生长素以及赤霉素诱导后GUS活性均有显著上升，说明pgbv-5含有相应的应答反应因子。pgbv-5在模式植物中的表达特征表明其是一个器官特异以及诱导表达的启动子。pgbv-5的功能研究可为揭示gbv-5的表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于棉花抗病、抗虫基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果  

1.        本发明获得了一个棉花根部高效表达启动子 pgbv-5 。目前作物转基因改良中使用最多的是来源于花椰菜花叶病毒的启动子p35S，这类启动子虽然可以使目的基因高效表达，但是它们启动的外源基因在受体植物中是非特异性的持续、高效表达，不仅造成浪费，而且有可能产生负面效果 (Song P, Heinen JL., Burns TH., Allen RD. Expression of Two Tissue-Specific Promoters in Transgenic Cotton Plants. The Journal of Cotton Science 2000;4:217-223)。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。而特异表达或诱导表达的启动子可以克服这些缺陷，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。本发明中的启动子pgbv-5是一个根部高效表达启动子。这样的启动子可以应用于农业生物育种和基因工程以提高作物抗病、抗虫性状和其他生产形状的改良。

本发明获得了一个全新的棉花诱导启动子。 pgbv-5是一个全新的启动子，BLAST显示没有同源性。通过拟南芥转化株分析，发现此启动子在受到水杨酸，生长素以及赤霉素等诱导后表达量显著上调，说明此启动子是一个诱导型启动子。

．表达有效。通过GUS染色分析发现该启动子在根部高效表达，特别是根冠、生长点以及部分伸长区的表达量最高。这样的表达特性为该启动子的进一步利用奠定了基础。

．更好了解抗病基因的作用机制及用于抗病育种。虽然目前有一些抗病基因被克隆出来，但是对抗性机制的了解还不是很深入。抗病基因一般是受外界调控表达的，而植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物基因的启动子是重要的顺式作用元件，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA 聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式,并决定转录的方向和效率以及所使用的RNA 聚合酶类型,是转录调控的中心。通过对启动子进行分析，可以了解抗病基因的表达模式甚至相关的反式作用因子，进而了解抗病基因的作用机制与机理。通过比较分析发现pgbv-5含有多个光响应元件，进一步说明光照与抗病反应之间关系密不可分，对研究抗病基因的作用机制起了促进性的作用。而构建的重组载体可以方便地应用于作物抗病育种。

四、附图说明

图1 –1742bp~–35bp启动子区域转化拟南芥植株后的GUS染色结果。A，B，C，D分别为4个不同的转基因株系，拟南芥为2片真叶期。

图2. 拟南芥pgbv-5转化株不同器官的GUS染色结果。A,B:根的染色结果；C:花的染色结果；D: 种子以及荚的染色结果。

图3. pgbv-5拟南芥转化株H2-11受到不同激素诱导。水H2-11：水处理转化株；SA H2-11：水杨酸处理转化株；GA H2-11：赤霉素处理转化株；IAA H2-11：吲哚乙酸处理转化株，反应时间为60min。

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海博亚生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验所用的陆地棉(Gossypium Barbadense L)品种均为H7124（马峙英，王省芬，张桂寅. 河北省棉花黄萎病菌致病性的研究. 棉花学报, 1997, 9 (1)∶15～20），拟南芥品种为哥伦比亚型（Lin X, Kaul S, Rounsley S, Shea TP, Benito MI, Town CD, Fujii CY, Mason T, Bowman CL, Barnstead M, Feldblyum TV, Buell CR, Ketchum KA, Lee J, Ronning CM, Koo HL, Moffat KS, Cronin LA, Shen M, Pai G, Van Aken S, Umayam L, Tallon LJ, Gill JE, Adams MD, Carrera AJ, Creasy TH, Goodman HM, Somerville CR, Copenhaver GP, Preuss D, Nierman WC, White O, Eisen JA, Salzberg SL, Fraser CM, Venter JC. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana. Nature 1999; 16; 402(6763):761-8.）。棉花与拟南芥都在培养箱中生长。光照强度为130μmol photons m^–2 s^–1，湿度为65%。

（一）: 棉花GHNBS基因启动子 pgbv-5 的克隆以及序列分析

根据一个具有Ve基因结构域的棉花抗性相关基因Gbv-5设计了2个反向引物（5'- AACATGACCACCGCCATCGCAAC -3'；5'- ATGGCTTGGTTCCATTTCATCAG -3'）用来获得基因的5’末端。参照Paterson 等的方法(Paterson AH, Brubaker CL, Wendel JF. A rapid method for extraction cotton (Gossypium spp.) Genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Mol Biol Rep 1993;11:122-7.) 提取H7124叶片的核基因组DNA，分别用限制性内切酶HindIII、DraI对所提取的核基因组DNA进行酶解。然后用染色体步行法克隆棉花抗性相关基因gbv-5的启动子序列。采用clontech公司的GenomeWalker^TM 试剂盒并按试剂盒说明书进行操作，具体方法为：首先将上述经不同限制性内切酶酶解后产生的不同长度的DNA片段连接各自相应的接头，得到带有接头的基因组DNA文库；然后以含有接头的基因组DNA文库作为模板，在外侧接头引物AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'和外侧基因特异引物GSP1：5'- AACATGACCACCGCCATCGCAAC -3'的引导下，进行第一轮PCR扩增；再以第一轮PCR扩增产物为模板，在内侧接头引物AP2：5'-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3'和内侧基因特异引物GSP2：5'- ATGGCTTGGTTCCATTTCATCAG -3'的引导下，进行第二轮的PCR扩增。第二轮PCR扩增结束后，用维特洁公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T Easy中 (Promega公司) ,转化E.coli JM109（大连宝生物公司）感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由ABI310 DNA测序仪完成 (Applied Biosystem Inc., Foster City, TX, USA)。结果以DraI酶解的棉花核基因组DNA片段库为模板，经过两轮PCR扩增后，获得一个长度为2.0kb的DNA片段，具有序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。与已克隆的GHNBS的cDNA序列进行比较，结果该2.0kb的DNA片段含有Gbv-5 cDNA序列5’端编码区的200个核苷酸，即5’端编码区部分重叠，表明所克隆到的长度为2.0kb的DNA片段就是目标基因Gbv-5的启动子序列，将该启动子命名为pgbv-5。而将上述含有pgbv-5的重组载体命名为pGEM-T Easy-pgbv-5。

用PLACE(Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T. Plant cis-acting regulatory DNA-elements (PLACE). Nucl Acids Res 1999;27:297-300.)和PlantCARE(Lescot M, Déhais P, Thijs G, Marchal K, Moreau Y, Van de Peer Y, Rouzé P, Rombauts S. PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucl Acids Res 2002;30:325-7.)软件对棉花抗性相关基因Gbv-5的启动子的核苷酸序列（序列表中的SEQ ID NO.1）进行序列分析，结果该启动子中含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列。其中，自5’端第1742位碱基为转录起始位点, 记为+1。调控元件序列，位置以及可能的功能见表1，结果显示pgbv-5含有多个与水杨酸，赤霉素，茉莉酸甲酯，乙烯等激素响应的元件，说明该启动子可能受这些激素的诱导响应。pgbv-5还含有一些抗病或病原菌响应的元件，如BIHD1OS，ELRECOREPCRP1，TL1ATSAR，WBOXATNPR1等，说明该启动子可能受病原菌的诱导。同时，该启动子含有多个光调控元件，如EBOXBNNAPA，GT1CONSENSUS，I BOX，INRNTPSADB等，越来越多的研究表明光与植物的抗病性关系十分密切，相当多抗病基因的激活需要光照（Asai T., Stone J.M., Heard J.E., et al. Fumonisin B1-induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways. Plant Cell, 2000, 12: 1823–1836；Brodersen P., Petersen M., Pike H.N., et al. Knockout of Arabidopsis ACCELERATED-CELL-DEATH11 encoding a sphingosine transfer protein causes activation of programmed cell death and defense. Genes Dev, 2002, 16: 490–502；Fryer M.J., Ball L., Oxborough K.et al. Control of ascorbate peroxidase-2 expression by hydrogen peroxide and leaf water status during excess light stress reveals a functional organization of Arabidopsis leaves. Plant J, 2003, 4: 691–705）。水杨酸途径参与了绝大多数的抗病信号通路，并最终激活病程蛋白PR引起过敏性反应，而这条通路的顺利进行必须依靠光，在黑暗或弱光下，这种过敏性反应强度就会下降乃至消失（Genoud T., Buchala A.J., Chua N.-H., et al. Phytochrome signalling modulates the SA-perceptive pathway in Arabidopsis. Plant J, 2002, 31, 87–95; Karpinski S., Gabrys H., Mateo A., et al. Light perception in plant disease defence signalling. Curr. Opin. Plant Biol, 2003, 4: 390–396. Zeier J., Pink B., Mueller M.J., et al. Light conditions influence specific defense responses in incompatible plant pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta, 2004, 219: 673–683）。Pgbv-5启动子中数量众多的光调节元件也说明Ve基因的抗病反应需要光的参与。另外，pgbv-5启动子还含有根顶端分生组织特异元件WUSATAg。这些结果表明GbV-5基因在棉花抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。

（二）构建GHNBS启动子序列与GUS基因融合的重组载体并转化拟南芥

为检测启动子在以常抗棉DNA为模板，用正向引物（5'- TCTAAGCTTGCCACA TGGAATTTTTGGTACACT -3'带下划线碱基为限制性内切酶HindIII识别位点）和反向引物（5'- TCAGGATCCGAAACTTGCAAGAGACGTTGAGTAT -3'，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点）扩增启动子片段，获得序列SEQ ID NO.1的片段–1472b p~–60bp区域，并在序列两段分别添加上限制性内切酶HindⅢ和BamHI的识别位点。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物用HindIII 和 BamHI进行酶切，与经相同酶双酶切的植物表达载体pBI101.1（Clontech公司）连接。将以上获得的启动子片段连接在β-葡聚醛酸酶(GUS)基因的上游5’端获得重组载体，命名为pBI-pgbv-5::GUS，用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404。用花浸染方法(Clough S J, Bent A F. Floral dip: A Simplified Method for Agrobacterium-Mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 1998; 16:735-743)转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法进一步检测转基因植株。收获转基因工程植株种子。

将转基因工程植株种子播种于含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于启动子功能以及特征研究。将转基因株系植株进行组织化学染色以检测GUS基因的表达位置和特征。

（三）：GUS活性的组织化学定位分析和荧光定量测定

GUS活性的组织化学定位分析方法为：

取步骤二在温室中生长的pBI-pgbv-5::GUS拟南芥转基因幼苗全株，将植株根部洗净。参考Jefferson等的荧光组织化学定位法（Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions: p-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 1987;6:3901-7.）测定GUS活性，具体方法为：GUS组织化学染色以5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-Dglucuronic acid (X-Gluc)作为底物。将整株拟南芥用90%的丙酮充分脱色处理后，浸泡在GUS反应液中（含50 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）, 10mmol/L EDTA, 2 mmol/L 铁氰化钾，2 mmol/L 亚铁氰化钾，2.0 mmol/L X-gluc及0.2％ Triton X-100），37°C温育1~3天，直至着色达到足够强度。再将拟南芥植株用70-100％系列乙醇脱色以去掉叶绿素，最后解剖镜下镜检。GUS组织化学染色的结果如图1和图2所示，

在转基因植株的幼苗期，即2片真叶期（图1），不同转化株系的GUS基因都在根部表达，特别是根冠、生长点以及部分伸长区的表达量最高。而叶片处基本检测不到。说明pgbv-5启动子在植物生长早期就可以使目的基因表达，并且是根部高效表达的。同时，在茎的生长点处也有一些表达。在转基因植株的成熟苗期，GUS基因仍然主要在根部特别是根尖的部分区域高效表达的（图2A, 图2B），而花器官中基本没有表达（图2C），对荚和种子的染色结果显示，荚没有表达，但是在种子中有一定的表达量（图2D）上述GUS荧光组织化学定位结果表明了pgbv-5为组织特异性启动子。

利用荧光定量法进行测定GUS基因活性，GUS基因以4-methylumbelliferyl glucuronide作为作用的底物产生有荧光的产物4-甲基伞形酮 (4-MU)，通过检测产物的荧光强度来检测GUS基因的活性大小。GUS活性以每毫克可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-MU为单位。

具体方法为：将转基因拟南芥叶片约0.2克左右用液氮研磨，然后将匀浆悬浮于GUS提取缓冲液（含50mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0），0.1％ Triton X-100，10mM　β-巯基乙醇，10mM　EDTA以及0.1％ SDS）中，在12,000g、4℃离心10 min后收集上清。取适量上清样品加入到反应缓冲液（含50mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0），0.1％ Triton X-100，10mM　β-巯基乙醇，10mM　EDTA，0.1％ SDS，5mM 4-MUG）中充分混匀，于37°C温育。用1M Na₂CO3终止反应。用SHIMADZU RF-5301PC荧光光度计测定产物中4-MU的含量。参照Bradford的方法（Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Ana1 Biochem 1976;72:248-54.）对提取液中的蛋白质进行浓度定量，用牛血清白蛋白（BSA）作标准曲线。

（四）：检测pgbv-5转基因植株对植物激素的诱导反应

取在温室中生长约3周的T2代pBI-pgbv-5::GUS拟南芥转基因幼苗做各种处理。分别用水杨酸SA、生长素吲哚乙酸和赤霉素这三种植物激素处理拟南芥幼苗，并设置未处理和伤处理对照。检测不同转基因株系不同处理前后GUS活性的大小。其中水杨酸的处理浓度为5mM；生长素吲哚乙酸的处理浓度为50uM；赤霉素的处理浓度为0.01%。所有激素处理时间均为24 h。

经上述不同处理的转基因植物的GUS活性分析结果如图3所示，其中水杨酸处理后的转基因植株的GUS活性是水处理的2.4倍；赤霉酸处理后转基因株系GUS表达量是水处理的3.8倍；生长素处理后转基因株系GUS表达量是水处理的2.8倍。这说明pgbv-5启动子受到这些激素的强烈诱导。通过相似性分析发现pgbv-5启动子上含有一定数量的激素应答元件，实验结果是与之相符的。

                         SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一个棉花根部高效表达启动子及其应用

 

 

<130>  说明书

 

 

<140>  00

<141>  2011-02-11

 

 

<160>  5    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  1778

<212>  DNA

<213>   Gossypium Barbadense（海岛棉）

 

 

<220>

<221>  promoter

<222>  (1)..(1778)

<223> 

 

 

 

<400>  1

tctaagcttg ccacatggaa tttttggtac acttctcaac ctatttagaa gagaattaat     60

 

aggtaaaaac aactctctca tcactctcaa ttttgaaatt gagcaaattg gtccttctca    120

 

aaaaaaactt taaagtaatt taatttctat caatttcaaa agtgagcaat aagaataatt    180

 

aaccacgaaa ttaatatttt tatatcaatt gaacatgatt tttattggta taataacaaa    240

 

tttaaccatt aaaattcata cattttgtca atttggttct aatttaacaa atttatttca    300

 

caaaatttgt gcaaatatgt aaatgttgat actaaatttg ttgaactttt tagaattaag    360

 

gctaaaatga caaaacatat aaacattaaa gaataaaatt attatataga taaaaactat    420

 

gtacagttaa taagagagat taatgttgtg cttaattatc cttaattgct tattttcgaa    480

 

aattgacagg cattaaatta cttcaaattt ttttaaagag actaatttgc tcaatttcaa    540

 

aattgagaga aattggagag atctttttac caaattaata atagtctgca tttttcttca    600

 

ctagcaattt tgccccttgc atgtaactat ttactttttc aaataatgta gttttagtta    660

 

ttgtaattag tgtaaattaa taccgataag tgttgggtac aatggtaaga catattgtat    720

 

ttttaagagg agatacaagt ccaaaactta aaaatgacat tgttaagagg gaccgtcaca    780

 

aatctcaaat ataaaccgta aaacagatat gaataataaa aatttagtgt aaattaatat    840

 

gaaatgtaag caggcccgtt cttgactttt tgaggctata ggcgaaacaa taaattggac    900

 

ccattttaaa agaattataa aatgtcatac aataaaagct aaaaaaattt tgggacccta    960

 

agagatgaag catttatggt gaaaaattgg aagccctagc gtttaattaa tttattttag   1020

 

tctatttttt ttcatattaa aagctgaaaa aatatttgtt ttgagtccct attttcctta   1080

 

tttaccccat ttgacccttc tatttttcta tttaagtact tgttatgtaa gtattcatta   1140

 

ttaaccctat ttttcttttc ctttgtccaa agctggtggt tttatagggg aaattccaat   1200

 

tgagatttca ggcttgatat agttactctt aatgcattcc aatttgtagt caaactttag   1260

 

agttcatatt aatgaaatga gatatggaca ttcagccatc gtcttaattt tcttcttcag   1320

 

taagtctctt cgatatggga cataagatgt tccatgtatt caaagataac caaattattt   1380

 

aatgttagca gaacttgatc cagggatgat ggagaaatta acccacacac aaccctataa   1440

 

tcctttttct tctctctttc attattaagt caagtgagac gtttcaattt tcttctccac   1500

 

tctccctatt aatcacagtg tgaatcttcc tacatggcag catccagagt ccctttgaac   1560

 

gggtagtgcg tttatttgaa ttaatgtaaa aattataatg acgtgagatt aaatatgtag   1620

 

cacacattct agcgtgagat aaaaataaaa gttaaacata ttttccctcc ccatttcttt   1680

 

atatactcaa cgtctcttgc aagtttcatt catctttcaa tagcctcaaa aaaaaaagaa   1740

 

atatgaggat tttactgctt tcatggctct tatttagt                           1778

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

 

<400>  2

aacatgacca ccgccatcgc aac                                             23

 

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

 

<400>  3

atggcttggt tccatttcat cag                                             23

 

 

<210>  4

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

 

<400>  4

tctaagcttg ccacatggaa tttttggtac act                                  33

 

 

<210>  5

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

 

<400>  5

tcaggatccg aaacttgcaa gagacgttga gtat                                 34

 

 

Claims (2)

1.一个棉花根部高效表达的启动子，是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2.含有权利要求1所述启动子的表达载体。

3 .含有权利要求1所述启动子的宿主菌。

4.权利要求1所述启动子在植物根部表达的应用。

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