CN101831424B - 一个植物组织特异以及发育后期表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个植物组织特异以及发育后期表达的启动子及其应用，属于生物技术领域。本发明获得了一个棉花环丙烷脂肪酸合酶的启动子序列，长度为2.6Kb。Place分析表明其含有CAAT-box、TATA-box及铜离子诱导表达元件、病原菌诱导表达元件、干旱响应元件、冷胁迫响应元件等。还存在一些根特异表达元件以及花器官特异元件。GUS染色后发现该启动子使目的基因在生长发育后期特异表达，同时表达部位只限于茎基部、根以及花药。

Description

一个植物组织特异以及发育后期表达的启动子及其应用

一、技术领域

本发明涉及植物基因启动子及其应用，提供了一个植物组织特异、生长发育后期特异的启动子。属于生物技术领域。用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。

二、背景技术

植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，是转录调控的中心。从1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组成型启动子(如CaMV35S启动子)经常被应用于植物基因工程，但这些组成型启动子使它们的下游基因持续表达以致跨度宿主植物的整个生命周期以及所有的组织器官，这不仅浪费宿主植物的能源，而且可能会导致宿主植物性状的改变。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。组织特异启动子由于其表达的空间特异性而具有许多组成型启动子所不具备的特点，将外源基因在转基因植物中定位表达不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，还可以提高外源基因在特定部位的浓度，增加转基因的效果。选择合适的组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。

目前，已经找到一些组织特异性或诱导表达启动子，并发现其上存在的相应的顺式因子。Prasenjit S.等发现水稻蔗糖合酶基因RSs1和rolC的启动子均为韧皮部组织特异性启动子，并可以驱动植物杀虫蛋白基因的表达，为植物抗病工程提供了新途径(Prasenjit S.，Dipankar C.，Anindya S.Characterization of vascular-specific RSs1 and rolCpromoters for their utilization in engineering plants to develop resistance against hemipteraninsect pests.Planta，2007，226(2)：429-442)。有些组织特异启动子同时也是特异时期启动子，例如种子、花器官特异启动子。对于那些以收获种子为目的植物来说，找到能在果实中特异表达的启动子，对利用基因工程进行品质改良、提高产量等有较大的意义。近年来，一系列的果实特异型启动子被发现，研究较多的果实特异型启动子主要包括E8、2A11/2A12、PG、MCPI、B33和ACC氧化酶启动子等。其中果实特异启动子E8被广泛应用构建植物基因高效表达载体(姚嵘，马三梅.植物果实的特异型启动子.生命的化学，2006，26(4)：55-57.)。另外，花器官的发育是一个特殊以及复杂的过程，有很多特殊的启动子参与其中。目前获得的花器官组织特异性启动子包括花药特异性启动子、花粉特异性启动子、绒毡层特以异性启动子等。人们利用这些特异启动子专一抑制花器官中的相关基因表达，即可利用基因工程的方法创建雄性不育系。

在植物和细菌中有一类含有三碳碳环的脂肪酸，包括环丙烷脂肪酸(CPA-FAs)和环丙烯脂肪酸(CPE-FAs)，但是在细菌中还没有报道存在CPE-FAs。正是由于三碳碳环的存在，赋予这类脂肪酸特殊的物理化学性质，从而满足工业领域的一些特殊需要。例如，润滑油的组分一般为含有16-18个碳的长链脂肪酸，但是长链饱和脂肪酸的融点较高，不能满足发动机的需求，而长链不饱和脂肪酸又很容易氧化。环丙烷脂肪酸正好可以解决这一问题，三碳碳环的存在使其兼具有饱和和不饱和脂肪酸的特性。利用氢化作用使碳环打开，产生大量有甲基分支的脂肪酸。这将导致其具有不饱和脂肪酸及其酯的低温特性，又没有双键的易氧化性，因此可以用于润滑及相关领域。另外，环丙烯环在与亲电子试剂的放热反应中容易打开，环丙稀脂肪酸含量高的油，如臭苹婆油可以在升高的温度下聚合(Gontier，Eric，Thomasset，Brigitte，Wallington，Emma，Wilmer，Jeroen.Plant Cyclopropane Fatty Acid Synthase Genes and Uses Thereof.United States Patent Application 20080155714)。这种特性特别适用于聚合物的生产。另外，CPE-FAs和CPA-FAs还被认为参与植物的抑菌反应。

一般认为，植物CPE-FAs由CPA-FAs通过去饱和作用合成。而CPA-FAs的合成反应由环丙烷脂肪酸合酶(也被称为环丙烷合酶或不饱和磷脂甲基转移酶)催化，包括对磷脂十六烷酰基或十八烷酰基双键的来自S-腺苷甲硫氨酸的亚甲基的加成。CPE-FAs和CPA-FAs在高等植物中并非广泛分布，但是发现它们存在于有限的科的种子油中。包括锦葵科、梧桐科、木棉科和无患子科。在有些植物中，CPE-FAs和CPA-FAs含量可以达到相当高的水平，苹婆种子中的CPA-FAs可以达到脂肪酸总量的78％，荔枝种子中的CPA-FAs可以达到40％。但是，使用的最多、最广泛的含有CPE-FAs和CPA-FAs的油是棉籽油，棉籽油中含有1％的CPE-FAs。目前，已经获得香苹婆和荔枝的环丙烷脂肪酸合酶基因(Bao X.M，Katz S.，Pollard M.，Ohlrogge J.Carbocyclic fatty acids in plants：Biochemical and molecular genetic characterization ofcyclopropane fatty acid synthesis of Sterculia foetida.PNAS，2002，99(10)：7172-7177；Gontier，Eric，Thomasset，Brigitte，Wallington，Emma，Wilmer，Jeroen.Plant CyclopropaneFatty Acid Synthase Genes and Uses Thereof.United States Patent Application20080155714)，但是关于这种基因的启动子还没有相关报道。

棉花是世界重要的经济作物，也是利用基因工程进行遗传改良较为成功的作物之一。自从1987年人类获得第一株转基因棉花以来，棉花基因工程的研究工作进展迅速，已经培育出抗虫、抗除草剂、抗病、抗盐等优良品种的高产品系。特别是转抗虫基因Bt的转基因棉花已经在全世界范围内普遍种植，在减少农药施用，降低生产成本、减轻劳动用工等方面都起到显著的作用。但是现在生产中所采用的CaMV35S启动子是组成型启动子，其持续表达对受体植株可能造成负担。如果改用特异启动子，控制抗虫基因只在特定部位如蕾、花、铃中和特定时期如在棉花生长中后期高效表达，就能大大提高抗虫效果。本发明的发明人获得了陆地棉环丙烷脂肪酸合酶基因的启动子序列。由于棉花再生体系困难，一些研究小组采用模式植物烟草(Hsu CY，Creech RG，JenkinsJN，Ma DP.Analysis of promoter activity of cotton lipid transfer protein gene LTP6intransgenic tobacco plants.Plant Sci 1999；143：63-70.)或拟南芥(Wang S，Wang J W，Yu N，Li Ch H，Luo B，Gou J Y，Wang L J，Chen X Y.Control of Plant Trichome Developmentby a Cotton Fiber MYB Gene.The Plant Cell 2004，16：2323-2334)来对棉花启动子进行分析，其研究结果表明GUS报告基因完全可以在这些模式植物中正常表达。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个来源于棉花的组织特异、生长发育后期特异表达的启动子。该启动子使GUS基因在茎基部、根以及花药中特异表达，并且只在生长后期(生殖生长期)表达。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。

技术方案

本发明所提供的一个来源于棉花的植物组织特异以及发育后期特异的启动子pCPA-FAS-2，来源于陆地棉(Gossypium hirsutum)，含有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ IDNO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(15mM NaCl，1mM NaH₂PO₄，0.1mM EDTA)、0.1×SSC(15mMNaCl，1.5mM柠檬酸钠)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO.1由2688个碱基组成。自5’端第2659位碱基为转录起始位点，记为+1。

其中TATA框位于转录起始位点上游的-330至-323位碱基，而CAAT框位于-217至-221位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。

自5’端第-2294至-2290位，-147至-143位，-37位至-33位碱基为干旱或黑暗诱导元件ACGTATERD1；

自5’端第-2272至-2267位，-2038至-2033位，-1344至-1339位碱基为抗病反应相关表达元件BIHD1OS；

自5’端第-2642位至-2638位，第-2389位至-2385位，第-1915位至-1911位，第-1331位至-1327位，第-568位至-564位碱基为铜离子诱导表达元件CURECORECR；

自5’端第-2537位，-2519位，-2505位，-2383位，-2340位，-2329位，-2140位，-1247位，-1208位，-1163位，-974位，-915位，-741位，-524位，-236位碱基为植物特有的锌指蛋白DOF基因的结合元件DOFCOREZM；

自5’端第-1686位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位碱基为种子中储存蛋白特异元件EBOXBNNAPA；

自5’端第-2552位，-2333位，-1675位，-1574位，-1150位，-910位，-546位，-490位，-314位碱基为病原菌诱导表达元件GT-1；

自5’端第-403位，-2378位碱基为干旱响应元件MYB2CONSENSUSAT；

自5’端第-1680位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位碱基为冷胁迫响应元件MYCCONSENSUSAT；

自5’端第-2519位，-2140位，-1247位碱基为根结特异元件OSE1ROOTNODULE；

自5’端-2406位，-2334位，-2142位，-2032位，-994位，-547位碱基为花器官特异元件POLLEN1LELAT52；

自5’端第-945位，-480位碱基为糖响应元件WBOXHVISO1；

自5’端第-481位碱基为水杨酸诱导元件WBOXATNPR1。

本发明提供了含有本发明启动子的表达载体和宿主菌以及扩增启动子任一片段的引物。

本发明提供了一个棉花组织特异以及生长发育后期特异的启动子pCPA-FAS-2，拟南芥转基因证明发现pCPA-FAS-2能赋予GUS基因在茎生长点以及花药中特异表达，并且只在生长后期(生殖生长期)表达。表现出器官特异、时期特异表达模式。pCPA-FAS-2的深入研究用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。

有益效果

1.本发明首次获得了一个全新的棉花环丙烷脂肪酸合酶启动子。棉花是世界重要的经济作物，棉籽油含有多种特殊的脂肪酸，如环丙烷脂肪酸(CPA-FAs)和环丙烯脂肪酸(CPE-FAs)。这些脂肪酸能够满足一些特定工业领域的需求，如润滑油的生产。本发明获得的棉花环丙烷脂肪酸合酶基因的启动子是一个全新的启动子，BLAST显示没有同源性。

2.本发明获得了一个棉花组织特异以及生长发育后期特异启动子。组织特异、表达时期特异启动子由于其表达的时空特异性而具有许多组成型启动子所不具备的特点，将外源基因在转基因植物中定位、定时表达不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，还可以提高外源基因在特定部位的浓度，增加转基因的效果。因此，选择合适的组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。本发明中的启动子pCPA-FAS-2是一个组织特异、表达时期特异的棉花启动子。它可以使目的基因在只生长发育后期，茎基部、根以及花药中特异表达，该启动子可以应用于农业生物育种和基因工程以改善植物品质和其他有益的生产性状。

3.更好了解植物环丙烷合酶基因的表达调控以及作用机理。由于植物油越来越广泛地应用于工业、食品加工业，利用脂肪酸代谢途径中的一些关键基因可以改善油的品质，并富集特定的脂肪酸种类。所以对于植物脂肪酸代谢途径的研究一直是生物研究中的热点。虽然利用大肠杆菌的相似序列已经获得了一些植物的环丙烷合酶基因，但是对这类基因的启动子研究鲜有报道。而植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物基因的启动子是重要的顺式作用元件，能指导全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。所以通过对启动子的研究可以深入了解这类基因的表达调控以及作用机理，并为该基因的进一步应用奠定基础。

四、附图说明

图1，图2pCPA-FAS-2启动子转化拟南芥植株后的GUS染色结果。GUS基因主要在茎基部以及根中表达。

图3，图4pCPA-FAS-2启动子转拟南芥植株的花器官染色结果。GUS基因主要在花药中表达。

五、具体实施方式

下列实施方式中未注明具体条件的实验方法均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所用的内切酶、聚合酶等均购自宝生物工程有限公司。本实验所用的生物材料包括：陆地棉(Gossypium.hirsutum)品种为柯字棉312(Udall J.A.，Swanson J.M.，Halle K.，et al.A global assembly of cotton ESTs.Genome Res.，2006，(16)：441-450)，拟南芥品种为哥伦比亚型(Lin X，Kaul S，Rounsley S，Shea TP，Benito MI，Town CD，Fujii CY，Mason T，Bowman CL，Barnstead M，Feldblyum TV，Buell CR，Ketchum KA，Lee J，Ronning CM，Koo HL，Moffat KS，Cronin LA，Shen M，Pai G，VanAken S，Umayam L，Tallon LJ，Gill JE，Adams MD，Carrera AJ，Creasy TH，Goodman HM，Somerville CR，Copenhaver GP，Preuss D，Nierman WC，White O，Eisen JA，Salzberg SL，Fraser CM，Venter JC.Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsisthaliana.Nature 1999；16；402(6763)：761-8.)。棉花与拟南芥都在培养箱中生长。光照强度为130μmol photons m^-2s^-1，湿度为65％。

(一)棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2启动子序列的克隆以及序列分析

根据一个棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2(GENBANK登陆号为：AAT74601)设计了3个反向引物(5′-GAAGGAAAATATCACTGGTAGCATA-3′；5′-ACATATAGGAGCCAGGTAAGTGTTT-3′；5′-TTTTATCCCACCTCCGATCACCGCC-3′)用来获得基因的5’末端。参照Paterson等的方法(Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF.A rapid method for extraction cotton(Gossypium spp.)Genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.Plant Mol Biol Rep1993；11：122-7.)提取柯字棉312叶片的核基因组DNA，用限制性内切酶EcoRV对所提取的核基因组DNA进行酶解。然后用染色体步行法克隆棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2的启动子序列。采用clontech公司的GenomeWalker^TM试剂盒并按试剂盒说明书进行操作，具体方法为：首先将限制性内切酶酶解后产生的不同长度的DNA片段与接头连接，得到带有接头的基因组DNA文库；然后以含有接头的基因组DNA文库作为模板，在外侧接头引物AP1：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′和外侧基因特异引物GSP1：5′-GAAGGAAAATATCACTGGTAGCATA-3′的引导下，进行第一轮PCR扩增；再以第一轮PCR扩增产物为模板，在内侧接头引物AP2：5′-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3′和内侧基因特异引物GSP2：5′-ACATATAGGAGCCAGGTAAGTGTTT-3′的引导下，进行第二轮的PCR扩增。第二轮PCR扩增结束后，用维特洁公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T Easy中(Promega公司)，转化E.coli JM109(大连宝生物公司)感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒，测序由ABI310DNA测序仪完成(Applied Biosystem Inc.，Foster City，TX，USA)。结果以EcoRV酶解的棉花核基因组DNA片段库为模板，经过两轮PCR扩增后，获得一个长度为3.2kb的DNA片段，其中含有序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。与已克隆的CPA-FAS-2的cDNA序列进行比较，结果该3.2kb的DNA片段含有CPA-FAS-2cDNA序列5’端编码区的513个核苷酸，即5’端编码区部分重叠，表明所克隆到的长度为3.2kb的DNA片段就是目标基因CPA-FAS-2的启动子序列，将该启动子命名为pCPA-FAS-2。而将上述含有pCPA-FAS-2的重组克隆载体命名为pGEM-T Easy-pCPA-FAS-2。

用PLACE(Higo K，Ugawa Y，Iwamoto M，Korenaga T.Plant cis-acting regulatoryDNA-elements(PLACE).Nucl Acids Res 1999；27：297-300.)和PlantCARE(Lescot M，Déhais P，Thijs G，Marchal K，Moreau Y，Van de Peer Y，RouzéP，Rombauts S.PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for insilico analysis of promoter sequences.Nucl Acids Res 2002；30：325-7.)软件对棉花环丙烷脂肪酸合酶的启动子的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID NO.1)进行序列分析。用上述软件对CPA-FAS-2基因启动子中的顺式作用元件进行搜索、预测，结果该启动子中含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列。其中，将CPA-FAS-2的cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点(记为+1)，即序列表中SEQ ID NO.1自5’端的第2659位碱基，自5’端第-2294至-2290位，-147至-143位，-37位至-33位碱基为干旱或黑暗诱导元件ACGTATERD 1(Simpson SD，Nakashima K，Narusaka Y，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Two different novel cis-acting elements of erd1，aclpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress anddark-induced senescence.Plant J.33：259-270(2003)；自5’端第-2272至-2267位，-2038至-2033位，-1344至-1339位碱基为抗病反应相关表达元件BIHD1OS(Luo H，Song F，Goodman RM，Zheng Z.Up-regulation of OsBIHD1，a rice gene encoding BELLhomeodomain transcriptional factor，in disease resistance responses.Plant Biol(Stuttg).7：459-468(2005).；自5’端第-2642位至-2638位，第-2389位至-2385位，第-1915位至-1911位，第-1331位至-1327位，第-568位至-564位碱基为铜离子诱导表达元件CURECORECR(Kropat J，Tottey S，Birkenbihl RP，Depege N，Huijser P，Merchant S.Aregulator of nutritional copper signaling in Chlamydomonas is an SBP domain protein thatrecognizes the GTAC core of copper response element.Proc Natl Acad Sci U S A.102：18730-18735.(2005))；自5’端第-2537位，-2519位，-2505位，-2383位，-2340位，-2329位，-2140位，-1247位，-1208位，-1163位，-974位，-915位，-741位，-524位，-236位，碱基为植物特有的锌指蛋白DOF基因的结合元件DOFCOREZM(Yanagisawa S，Schmidt RJ Diversity and similarity among recognition sequences of Dof transcriptionfactors.Plant J 17：209-214(1999))；自5’端第-1686位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位碱基为种子中储存蛋白特异元件EBOXBNNAPA(StalbergK，Ellerstom M，Ezcurra I，Ablov S，Rask L.Disruption of an overlapping E-box/ABREmotif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in transgenicBrassica napus seeds.Planta 199：515-519(1996)；自5’端第-2552位，-2333位，-1675位，-1574位，-1150位，-910位，-546位，-490位，-314位碱基为病原菌诱导表达元件GT-1(Park HC，Kim ML，Kang YH，Jeon JM，Yoo JH，Kim MC，Park CY，Jeong JC，Moon BC，Lee JH，Yoon HW，Lee SH，Chung WS，Lim CO，Lee SY，Hong JC，Cho MJ.Pathogen-and NaCl-induced expression of the SCaM-4promoter is mediated in part by a GT-1boxthat interacts with a GT-1-like transcription factor.Plant Physiol 2004；135：2150-2161.)；自5’端第-403位，-2378位碱基为干旱响应元件MYB2CONSENSUSAT(Abe H，UraoT，Ito T，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki.Arabidopsis AtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)function as transcriptional activators in abscisic acid signaling.Plant Cell15：63-78(2003))；自5’端第-1680位，-1649位，-1046位，-1023位，-669位，-655位，-495位，-403位碱基为冷胁迫响应元件MYCCONSENSUSAT(Chinnusamy V，OhtaM，Kanrar S，Lee BH，Hong X，Agarwal M，Zhu JK.ICE1：a regulator of cold-inducedtranscriptome and freezing tolerance in Arabidopsis.Genes Dev.17：1043-1054(2003))；自5’端第-2519位，-2140位，-1247位碱基为根结特异元件OSE1ROOTNODULE(Vieweg MF，Fruhling M，Quandt HJ，Heim U，Baumlein H，Puhler A，Kuster H，AndreasMP.The promoter of the Vicia faba L.leghemoglobin gene VfLb29is specifically activatedin the infected cells of root nodules and in the arbuscule-containing cells of mycorrhizalroots from different legume and nonlegume plants.Mol Plant Microbe Interact.17：62-69(2004).)；自5’端-2406位，-2334位，-2142位，-2032位，-994位，-547位碱基为花器官特异元件POLLEN1LELAT52(Filichkin SA，Leonard JM，Monteros A，Liu PP，Nonogaki H.A novel endo-beta-mannanase gene in tomato LeMAN5 is associated withanther and pollen development.Plant Physiol.1341080-1087(2004))；自5’端第-945位，-480位碱基为糖响应元件WBOXHVISO1(Sun C.，Palmqvist S.，Olsson H.，Boren M.，Ahlandsberg S.，Jansson C.A novel WRKY transcription factor，SUSIBA2，participates insugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the isol promoter，Plant Cell 2003；15：2076-2092)；自5’端第-481位碱基为水杨酸诱导元件WBOXATNPR1(Yu D，Chen C，Chen Z Evidence for an important role of WRKY DNAbinding proteins in the regulation of NPR1 gene expression.Plant Cell 2001；13：1527-1540)。

表1pCPA-FAS-2启动子序列中的调控元件分析

序列①	位置	名称和功能	参考文献
				TGACG	-2294，-147，-37	ACGTATERD1，干旱或黑暗诱导元件	Simpson SD，Nakashima K，Narusaka Y，SekiM，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Two different novel cis-acting elements oferd1，a clpA homologous Arabidopsis genefunction in induction by dehydration stress anddark-induced senescence.Plant J.33：259-270(2003)
AAAGAT	-2272，-2038，-1344	BIHD1OS，抗病反应相	Luo H，Song F，Goodman RM，Zheng Z.Up-regulation of OsBIHD1，a rice gene
						关表达元件	encoding BELL homeodomain transcriptionalfactor，in disease resistance responses.PlantBiol(Stuttg).7：459-468(2005)
GGATA	-2642，-2389，-1915，-1331，-568	CURECORECR，铜离子诱导表达元件	Kropat J，Tottey S，Birkenbihl RP，Depege N，Huijser P，Merchant S.A regulator ofnutritional copper signaling inChlamydomonas is an SBP domain protein thatrecognizes the GTAC core of copper responseelement.Proc Natl Acad Sci U S A.102：18730-18735.(2005)
				GRWAAW	-2537，-2519，-2505，-2383，-2340，-2329，-2140，-1247，-1208，-1163，-974，-915，-741，-524，-236	DOFCOREZM，植物特有的锌指蛋白DOF基因的结合元件	Yanagisawa S，Schmidt RJ Diversity andsimilarity among recognition sequences of Doftranscription factors.Plant J 17：209-214(1999)
GANTTNC	-1686，-1649，-1046，-1023，-669，-655，-495，-403	EBOXBNNAPA，种子中储存蛋白特异元件	Stalberg K，Ellerstom M，Ezcurra I，Ablov S，Rask L.Disruption of an overlappingE-box/ABRE motif abolished hightranscription of the napA storage-proteinpromoter in transgenic Brassica napus seeds.Planta 199：515-519(1996)
				GAAAAA	-2552，-2333，-1675，-1574，-1150，-910，-546，-490，-314	GT-1motif，病原菌诱导	Park HC，Kim ML，Kang YH，Jeon JM，YooJH，Kim MC，Park CY，Jeong JC，Moon BC，Lee JH，Yoon HW，Lee SH，Chung WS，LimCO，Lee SY，Hong JC，Cho MJ.Pathogen-andNaCl-induced expression of the SCaM-4promoter is mediated in part by a GT-1 boxthat interacts with a GT-1-like transcriptionfactor.Plant Physiol 2004；135：2150-2161.
CNGTTR	-403，-2378	MYB2CONSENSUSAT，碱基为干旱响应元件	Abe H，Urao T，Ito T，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki.Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function astranscriptional activators in abscisic acidsignaling.Plant Cell 15：63-78(2003)；
				GTTAGTT	-1680，-1649，-1046，-1023，-669，-655，-495，-403	MYCCONSENSUSAT，冷胁迫响应元件	Chinnusamy V，Ohta M，Kanrar S，Lee BH，Hong X，Agarwal M，Zhu JK.ICE1：aregulator of cold-induced transcriptome andfreezing tolerance in Arabidopsis.Genes Dev.17：1043-1054(2003)
CANNTG	-2519，-2140，-1247	OSE1ROOTNODULE，根结特异元件	Vieweg MF，Fruhling M，Quandt HJ，Heim U，Baumlein H，Puhler A，Kuster H，AndreasMP.The promoter of the Vicia faba L.leghemoglobin gene VfL b29 is specificallyactivated in the infected cells of root nodulesand in the arbuscule-containing cells ofmycorrhizal roots from different legume andnonlegume plants.Mol Plant Microbe Interact.17：62-69(2004).
				ATATT	-2406，-2334，-2142，-2032，-994，-547	POLLEN1LELAT52，花器官特异元件	Filichkin SA，Leonard JM，Monteros A，LiuPP，Nonogaki H.A novelendo-beta-mannanase gene in tomato LeMAN5is associated with anther and pollendevelopment.Plant Physiol.134 1080-1087(2004)
WAACCA	-945，-480	WBOXHVISO1，糖响应元件	Sun C.，Palmqvist S.，Olsson H.，Boren M.，Ahlandsberg S.，Jansson C.A novel WRKYtranscription factor，SUSIBA2，participates insugar signaling in barley by binding to thesugar-responsive elements of the iso 1promoter，Plant Cell 2003；15：2076-2092
				TTGAC	-481	WBOXATNPR1，水杨酸诱导	Yu D，ChenC，Chen Z Evidence for animportant role of WRKY DNA bindingproteins in the regulation o fNPR1 geneexpression.Plant Cell 2001；13：1527-1540。

①N代表A，C，G或T；R代表A或G；W代表A或T；

(二)构建CPA-FAS-2启动子序列与GUS基因融合的重组载体并转化拟南芥

为检测启动子在以柯字棉312基因组为模板，用正向引物(5′CGAAGCTTGGTCGAGTGAGATGAAGTACATCAT-3′带下划线碱基为限制性内切酶HindIII识别位点)和反向引物(5′CCGGATCC GGATCCCACCTCCGATCACCGCCACT-3′，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)扩增启动子片段，并在序列两段分别添加上限制性内切酶HindIII和BamHI的识别位点。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，PCR产物用HindIII和BamHI进行酶切，与经相同酶双酶切的植物表达载体pBI101.1(Clontech公司)连接。将以上获得的启动子片段连接在β-葡聚醛酸酶(GUS)基因的上游5’端获得重组载体，命名为pBI-p CPA-FAS-2::GUS，用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404。用花浸染方法(Clough S J，Bent A F.Floral dip：A Simplified Method forAgrobacterium-Mediated Transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J 1998；16：735-743)转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法进一步检测转基因植株。收获转基因工程植株种子。

将转基因工程植株种子播种于含有40mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并用于启动子功能以及特征研究。将转基因株系植株进行组织化学染色以检测GUS基因的表达位置和特征。

(三)GUS活性的组织化学定位分析

GUS活性的组织化学定位分析方法为：取在温室中生长的pBI-pCPA-FAS-2::GUS拟南芥转基因幼苗全株，将植株根部洗净。参考Jefferson等的荧光组织化学定位法(Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions：p-Glucuronidase as a sensitiveand versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J 1987；6：3901-7.)测定GUS活性，具体方法为：GUS组织化学染色以5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-Dglucuronic acid(X-Gluc)作为底物。将整株拟南芥用90％的丙酮充分脱色处理后，浸泡在GUS反应液中(含50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，10mmol/L EDTA，2mmol/L铁氰化钾，2mmol/L亚铁氰化钾，2.0mmol/L X-gluc及0.2％Triton X-100)，37℃温育1～3天，直至着色达到足够强度。再将拟南芥植株用70-100％系列乙醇脱色以去掉叶绿素，最后解剖镜下镜检。GUS组织化学染色的结果显示，在幼苗期GUS基因不表达，而在生长后期即生殖发育期，GUS基因表现为组织特异性表达。如图1-4所示，在转基因植株中，GUS基因在茎基部以及根中的表达很强(图1，图2)，另外，在花器官中也检测到GUS基因的表达，表达部位主要集中在花药中(图3，图4)。上述GUS荧光组织化学定位结果表明了CPA-FAS-2基因在植物体内的表达为组织以及表达时期特异性。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>一个植物组织特异以及发育后期表达的启动子及其应用

<130>说明书

<140>00

<141>2009-06-05

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2688

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum(陆地棉)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2688)

<223>

<400>1

ggtcgagtga gatgaagtac atcatctttc tatttatagg ttaggaagag actattagta      60

attttagaca ttgtgccaac aagaattaga tatggttaga atttatgaaa aattgttcaa     120

aaaagttttg agattttaaa aagatatata ttaaaagcaa attttatttc ataggcttaa     180

tatatccttt aacacatttt tctatgtagt gtatgtatta atttatcgtc taatttaata     240

tttatatttg atagaaatta tatattttgg tactcaaagg taactgtgtt aattatttag     300

tgtcgaatta agagggccaa agctagaaaa aagtatgcat gcaacaaaat ttgaacccaa     360

aattacgtaa cattatttat caattttgtc atttcaacca aaattatatt taaatctttt     420

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tttttagtat atatttaata tattcatgca tacttcaata tatcaatttt tagagcatat     960

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aaattaatta ataaattaaa tgtagcaaca tttttttatg taagcaacat gtattgttaa    1200

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cctaaatgga taatttttca ctttagaggg agtcggggct gcctctacca gcccccttag    1560

atccaccact gaatttacct taaataattt ttttaaatat agtcaatagc tacaagtggc    1620

agattattat cgtgacaaat gacagtttat aaactatgcc acatagaaat tctttttttt    1680

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cccaaagagg taaacgatta gccataaaat gtattccatt cctatgagtg gggatttctt    1800

ttcttttatg taacattata atgctacagt atatatatga ttgtcttcac ccacacggtg    1860

aatatactat aatcaagttt tcttattacg actctactta tgcgtaaaaa aaatataaaa    1920

gctatcaata tctttaacga taagttgaga ttttgagaat tttaaaaatt caagttcgaa    1980

gtttcatttc acatgcggat tttcaattga attttttttt gattaagtct cgtatgtgta    2040

tgagaactac atacttaaat gaaactaatt aataataaaa tattaaatat gtacaaatag    2100

attaaattgc aagaaaaata aaattaaaat acgaaaagac atttttttaa aatttctcta    2160

aaccagttgg taatcaattg acttgtaaca ccaacttaat caagagttta aataataata    2220

tcgatactct atttaaattt attctcgtat aagttcaact gtattatgat tttcaaacac    2280

atgtgcaatg taaggatatg gggttttaat tataatttgt gattatttta taaatatcat    2340

ttcagaaaat tttaagatat aatattaaaa taatctttct cgatttccaa ttttaacata    2400

tatatattat atcaccatcg ggaaagcaat ttagaatcaa ttgagcacta taatgcactg    2460

caactgctag tgttgaattt taagtgaaac tttcgaagca ttacttcttc gtaaaacgta    2520

ggtttcaact tctttcaagc ctttcatcaa acatggcatc tacattttag tttccacttt    2580

ctttctgaag ataaatgatg atttgggttg ggtttttttg gacgtaagtg caggtcaagc    2640

agtgtcacgg cggcagtgat ggaagtggcg gtgatcggag gtgggatc                 2688

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CPA-FAS-2启动子序列正向引物

<222>(1)..(33)

<223>

<400>2

cgaagcttgg tcgagtgaga tgaagtacat cat                                33

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CPA-FAS-2启动子序列反向引物

<222>(1)..(34)

<223>

<400>3

ccggatccgg atcccacctc cgatcaccgc cact                               34

Claims (3)

1.一个植物组织特异以及发育后期表达的启动子，其特征在于，其核苷酸序列为SEQID NO.1所示的DNA序列。

2.含有权利要求1所述启动子的表达载体。

3.含有权利要求1所述启动子的宿主菌。

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