CN102363777A - 一种水稻根特异性表达基因exp18d启动子的克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，提供一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法。该方法先获取拟南芥根特异性基因EXP18，再获取水稻根特异性表达基因EXP18D启动子。因为本发明克隆到水稻根特异性表达基因EXP18D启动子，而该启动子为植物根系特异性表达的启动子，可以驱动相关功能基因的表达，所以该启动子具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力。

Description

一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法。

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。目前，组织特异性启动子的调控机制己进入深入研究阶段，该类启动子除具有基本结构外，通常还有一些调控特异表达的序列，这些序列为转录因子提供了结合位点，通过与蛋白质的相互作用来调节基因表达。在组织特异性启动子的驱动下，基因的表达通常只发生在特定的组织或器官，并往往表现出发育调节的特性。

根是植物吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。拟南芥的磷酸转移酶基因PHT1启动子与GUS融合，在农杆菌介导下转化拟南芥和水稻，组织化学分析显示蛋白只在拟南芥和水稻的根毛及根表皮表达，说明该启动子是根特异的。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白基因(calreticulin)构建融合表达载体，转基因烟草水培研究结果表明，根细胞不仅能高效产生某些目的蛋白质，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。

植物的根系在植物抗旱中起着重要的作用，根系吸水力的提升和根系形态的建成，无疑对提高植物的吸水力，增强其抗旱性具有重要的意义。多数的植物功能基因如激素合成、代谢相关基因，植物生长、发育调控基因在植物的地上部分和地下部分均有表达，通过简单的转基因或者基因沉默的方式只能从整体上调节基因在植物体的表达，不能特异性的实现对植物根系功能和发育的调控。

为了解决上述问题，需要利用植物根系特异性表达的启动子驱动相关功能基因的表达，以达到既能提高植物吸水性、增加植物根系长度和数量，又不影响植物地上部生长、不损害植物营养生长的目的，由此通过转基因的手段能够获得相应的抗旱植株。目前的研究中需要克隆得到根特异性表达基因启动子。

 

发明内容

本发明提供一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法。

该方法包括以下步骤：

Ⅰ、获取拟南芥根特异性基因EXP18：

A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；

B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因EXP18；

Ⅱ、获取水稻根特异性表达基因EXP18D启动子：

A、将所述的拟南芥根特异性基因EXP18的序列进行在线分析比对，得到水稻根特异性基因；

B、分别从水稻植株中提取水稻根总RNA和水稻叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列；

C、分别以所述的水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列为模板，分别以所述的水稻根特异性基因设计引物，进行半定量PCR反应，筛选得到水稻根特异性表达基因EXP18D；

D、在线分析得到水稻根特异性表达基因EXP18D的启动子的序列信息，再在水稻根基因组DNA中进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子。

步骤Ⅰ-B中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为：AT1G79580.1、AT1G62980.1、AT1G66470.1、AT1G27740.1、AT1G54970.1、AT3G10710.1、AT1G12560.1、AT2G26420.1、AT1G12040.1、AT1G62440.1、AT3G62680.1、AT2G26290.1。

步骤Ⅱ-A中所述的水稻根特异性基因在日本水稻基因组数据库（RGP）的编号分别为：os03g0377100、os01g0249100、os01g0248900、os03g0156000、 os01g0274500。

所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的序列为SEQ ID No：1。

在步骤Ⅱ之后，进行所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子功能验证，包括以下步骤：

A、在线分析得到将所述的稻根特异性表达基因EXP18D启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；

B. 将所述的稻根特异性表达基因EXP18D启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到EXP18D启动子缺失体片段；

C. 将所述的EXP18D启动子缺失体片段分别构建EXP18D启动子缺失体GUS表达载体；

D、将所述的EXP18D启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到转化体植株，再进行检测。

所述的EXP18D启动子缺失体片段的大小分别为1957 bp、1720 bp、1066 bp、954 bp、776 bp、432 bp。

本发明的有益效果为：

因为本发明克隆到水稻根特异性表达基因EXP18D启动子，该启动子为植物根系特异性表达的启动子，可以驱动相关功能基因的表达，所以该启动子具有特定地改变植物的根部形态、获得相应的抗旱植株潜力：转入该启动子的植株，在同等干旱条件下，存活率比相比对照组的野生型植株高60-70％。

附图说明

图1： 实施例1中，12个拟南芥根特异性基因的扩增产物电泳结果。

图2： 实施例1中，5个水稻根特异性基因的比对结果。

图3： 实施例1中，5个水稻根特异性基因的同源树分析结果。

图4： 实施例1中，5个水稻根特异性基因的扩增产物电泳结果。

图5：实施例1中，水稻基因EXP18-D的基因图谱；

图6：实施例1中，水稻基因启动子EXP18-D的基因图谱；

图7：实施例1中，水稻根特异性表达基EXP18D启动子序列中含有的顺式作用元件的分析结果；

图8：实施例1中， 6种EXP18D启动子缺失体的结构简图。

图9：实施例1中，6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体的结构简图。

图10：实施例1中，6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体在拟南芥转化体植株的表达量的Gus染色图。

具体实施方式

实施例1：

一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，该方法包括以下步骤：

Ⅰ、获取拟南芥根特异性基因：

A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；

具体的操作为：

分别取生长20d的拟南芥植株的根与叶为材料，用Trizol法分别提取拟南芥根与叶的总RNA，分别进行反转录PCR反应，分别得到拟南芥根cDNA和拟南芥叶cDNA；

所述的反转录PCR反应的体系为：RNA ：1.2μg，Oligo(dT)15：2 μl，

M-MLV buffer：5μl，dNTP Mix：1.25 μl，M-MLV：1μl，RNase inhibitor：0.6 μl，DEPC 处理后的ddH₂O：补足 25 μl；

所述的反转录PCR反应的程序为：

加入上述oligo(dT)15后70℃反应5分钟，然后加入反转录PCR上述体系中的其他试剂，37℃反应1小时，得到所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列。

B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据12个拟南芥根特异性基因设计引物，再进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因EXP18；

所述的半定量PCR.反应体系为：  

Ex Taq buffer ：2 μl，dNTP Mix (2.5 mM each) ：1.6 μl，Primer Mix (5 μM each) ：2.4 μl，cDNA ：2.4 μl，Ex Taq ：0.2 μl，ddH₂O ：11.4 μl；

所述的半定量PCR反应程序为：

94℃预变性5 min；94℃变性45 s，51℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共30个循环；72℃ 延伸7 min；4℃保存；分别得到12个拟南芥根特异性基因的扩增产物；

所述的12个拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站（TAIR），（网址为http://www.arabidopsis.org/）的编号和记载该基因的文献来源如下：

SMB（AT1G79580.1）：Tom Bennett, Albert van den Toorn, Gabino F,(2010). SOMBRERO, BEARSKIN1, and BEARSKIN2 Regulate Root Cap Maturation in Arabidopsis . Plant Cell.22: 640–654；

EXP18（AT1G62980.1）：Hyung-Taeg Cho, Daniel J. Cosgrove,(2002). Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene Expression in Arabidopsis.Plant cell. 14:3237–3253；

RHD6 （AT1G66470.1）：Jill S. Parker,Alison C. Cavell,Liam Dolan,(2000). Genetic Interactions during Root Hair Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 12:1961–1974；

RSL4   （AT1G27740.1）：Keke Yi, Beno??t Menand, Elizabeth Bell,Liam Dolan,(2009). A basic helix-loop-helix transcription factor controls cell growth and size in root hairs.nature genetics.10:1038；

PRP1  （AT1G54970.1）：Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho,(2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair-Speci??c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis.Plant Physiology.150:1459-1473；

    RHS12（AT3G10710.1）：Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho,(2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair-Speci??c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis.Plant Physiology.150:1459-1473；

EXP7  （AT1G12560.1）：Hyung-Taeg Cho1,Daniel J. Cosgrove,( 2002).Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene. Plant Cell. 14:3237–3253；

PIP5K3（AT2G26420.1）：Irene Stenzel,Till Ischebeck,Sabine Konig,(2008). The Type B Phosphatidylinositol-4-Phosphate 5-Kinase 3 Is Essential for Root Hair Formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 20: 124–141；

LRX1  （AT1G12040.1）：Nicolas Baumberger, Christoph Ringli , Beat Keller,(2001).  The chimeric leucine-rich repeat/extensin cell wall protein LRX1 is required for root hair morphogenesis in Arabidopsis thaliana. Genes Dev. 15: 1128-1139；

LRX2  （AT1G62440.1）：N.Baumberger,M.Steiner,U.Ryser,(2003).Synergistic interaction of the two paralogous Arabidopsis genes LRX1and LRX2 in cell wall  information duiing root hair development.Plant Journal,35:71-81；

PRP3   （AT3G62680.1）：       Christine Bernhardt ,Mary L. Tierney,(2000). Expression of AtPRP3, a Proline-Rich Structural Cell Wall Protein from Arabidopsis, Is Regulated by Cell-Type-Specific Developmental Pathways Involved in Root Hair Formation1. Plant Physiology. 122: 705–714；

ARSK1（AT2G26290.1）：Inhwan Hwang,Howard M.Goodman,(1995).An Arabidopsis thaliana root-specific kinase homolog is induced by dehydration,ABA,and NaCl.Plant Journal.8(1):37-43；

利用Oligo6.0软件设计所述的12个拟南芥根特异性基因的半定量PCR反应引物；由于检测基因较多，为提高实验效率，在引物设计时应尽量使退火温度保持集中、一致，即退火温度为51℃；具体引物序列如下：

SMB：      

Upper：GGAGGAGGAGCTTCTTTAC， 

Lower：CCAGAAACGACCAGTCTC CA；

EXP18：   

Upper：CG CAAGTGCCTGGTTATTTTA，

Lower：CGG AGCAGCATTATAAGCGT；

RHD6：    

Upper：GGCACTCGTTAATGACCATC，

Lower：G GTGATCAGATTCGAATTCC；

RSL4：     

Upper：GGACGTTTTTGTTGATGGTG， 

Lower：CG TACATCCATA GATCATCC；

PRP1：      

Upper：GCTGATTATTACGCTCCCTC，

Lower：GTT GGATCACTGTAGATGAC；

RHS12：

Upper：CGC TGAGCTTCTTGACCTAAC，

Lower：CGGT AGAATTGGCGTTGTGC；

EXP7：     

Upper：GTT CGTCGCTGGATACTATC，

Lower：GCAA CGTTCCAAGCATAGAT；

PIP5K3：

Upper：GCTGCCG AGATTAGAATAGT，

Lower：GCACCACCA CTCTCCAAAA G；

LRX1：     

Upper：GGTTCAGATGTTTGCTCCT，

Lower：CTTCTAGGCTCTTCATGTTA C；

LRX2：     

Upper：GGC TCTGATGTTTGTTCCTAC，

Lower：GG TTAGAGAGCTGACAAATGC；

PRP3：      

Upper：CCACCCGTTT ACAAGCCTAC，

Lower：GAGCTCCAAGTTCTTGTCCG；

ARSK1：

Upper：CG CAAGCAAATACGAAGGAG，

Lower：CGTATGTTCGCCTTCAG GTC；

所述的半定量PCR反应的体系为：

Ex Taq buffer ：2 μl，dNTP Mix (2.5 mM each) ：1.6 μl，Primer Mix (5 μM each) ：2.4 μl，cDNA ：2.4 μl，Ex Taq ：0.2 μl，ddH2O ：11.4 μl；

 所述的半定量PCR反应的程序为：  94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共30个循环；72℃ 延伸7 min；4℃保存。

通过所述的半定量PCR反应分别得到12个拟南芥根特异性基因的扩增产物；再将上述12个拟南芥根特异性基因的扩增产物进行检测，筛选得到拟南芥根特异性基因EXP18；

具体的操作为：

将上述12个拟南芥根特异性基因的扩增产物进行1％琼脂糖凝胶上电泳；电泳结果如图1所示，泳道M为 DNA markerⅡ，泳道1为内参actin，泳道2-13分别为上述12个拟南芥根特异性基因的扩增产物；泳道12表明，所述的拟南芥根特异性基因EXP18在拟南芥的根中的表达量大，在拟南芥的叶中几乎不表达。

Ⅱ、获取水稻根特异性表达基因EXP18D启动子：

A、将所述的拟南芥根特异性EXP18基因的序列在NCBI 网站进行在线分析比对，得到相似性最高的前5个水稻根特异性基因：水稻EXP18-A基因、水稻EXP18-B基因、水稻EXP18-C基因、水稻EXP18-D基因、 水稻EXP18-E基因； 

以上5个水稻根特异性基因在日本水稻基因组数据库（RGP）

（网址为：http://rgp.dna.affrc.go.jp）的编号分别为：水稻EXP18-A基因：os03g0377100；水稻EXP18-B基因：os01g0249100；水稻EXP18-C基因：os01g0248900；水稻EXP18-D基因：os03g0156000；水稻EXP18-E基因：os01g0274500；

上述在线分析比对包括blast比对和同源树分析；上述blast比对的网址为：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome；

图2为以上5个水稻根特异性基因的blast比对结果：水稻EXP18-A基因，相似度93%；水稻EXP18-B基因，相似度91%；水稻EXP18-C基因，相似度88%；水稻EXP18-D基因，相似度85%；水稻EXP18-E基因，相似度84%；

上述同源树分析采用DNAMAN软件，图3为以上5个水稻根特异性基因同源树分析结果。通过比对得知，水稻EXP18-A基因、水稻EXP18-B基因、水稻EXP18-C基因、水稻EXP18-D基因、水稻EXP18-E基因与拟南芥EXP18基因均具有较高的相似性。

B、分别从水稻植株中提取水稻根总RNA和水稻叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列；所述的水稻植株的品种为日本晴，粳亚种Oryza sativa ssp.japonica。

具体的操作为：

分别取生长12-18d，优选为15d的水稻植株的根与叶为材料，用Trizol法分别提取水稻根与叶的总RNA，分别进行反转录PCR反应，分别得到水稻根cDNA和水稻叶cDNA；

所述的反转录PCR反应的体系为：RNA ：1.2μg，Oligo(dT)15：2 μl，

M-MLV buffer：5μl，dNTP Mix：1.25 μl，M-MLV：1μl，RNase inhibitor：0.6 μl，DEPC 处理后的ddH₂O：补足 25 μl；

所述的反转录PCR反应的程序为：

加入上述oligo(dT)15后70℃反应5分钟，然后加入反转录PCR上述体系中的其他试剂，37℃反应1小时，得到所述的水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列；

C、分别以所述的水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列为模板，分别以水稻EXP18-A基因、水稻EXP18-B基因、水稻EXP18-C基因、水稻EXP18-D基因、 水稻EXP18-E基因设计引物，进行半定量PCR反应，选取得到水稻根特异性表达基因EXP18D；

具体的操作为：

利用Oligo6.0软件设计以上5个基因的PCR引物；由于检测基因较多，为提高实验效率，在引物设计时应尽量使退火温度保持集中、一致，即退火温度为53摄氏度；具体引物序列如下：

EXP18-A：       

Upper：TGATGTTCGGGGACGGGCTGAG，

Lower：CCGGCGCGACGTTGTACGACAC； 

EXP18-B：       

Upper：CGGGTACGGGACGAACACGAC，

Lower：GGCCTGCACCCTGAACGACA；

EXP18-C：       

Upper：CGCCAGAATGCTCGTGCTCC，

Lower：CCATCCTATGCCACGTCGATCAAA；

EXP18-D：

Upper：CGGGTACGGGAACCTGTACGA，

Lower：GGTGGTAGGTGCTGAATGTTTGGC；

EXP18-E：

Upper：CGGGTACGGGACGAGCACGG，

Lower：GTCGCTGGCGGTGACCCTGA；

所述的半定量PCR反应体系为：  

Ex Taq buffer ：2 μl，dNTP Mix (2.5 mM each) ：1.6 μl，

Primer Mix (5 μM each) ：2.4 μl，cDNA ：2.4 μl，Ex Taq ：0.2 μl，ddH₂O ：11.4 μl；

所述的半定量PCR反应程序为：

94℃预变性5 min；94℃变性45 s，51℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，共30个循环；72℃ 延伸7 min；4℃保存；

通过所述的半定量PCR反应分别得到上述5个水稻根特异性基因的扩增产物；

将上述5个水稻根特异性基因的扩增产物进行检测；将上述5个水稻根特异性基因的扩增产物进行1％琼脂糖凝胶上电泳；电泳结果如图4所示，泳道M中为DNA markerⅡ，泳道1为 内参actin，泳道2-6中分别为上述5个水稻根特异性基因的扩增产物；泳道5中表明，所述的水稻根特异性EXP18-D基因在拟水稻的根中的表达明显。

D、在线分析得到所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子，再在水稻根DNA中进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子。

具体的操作为：

a. 在NCBI网站上分析获得水稻根特异性表达基因EXP18D的启动子：

在NCBI网站上找到水稻EXP18-D基因序列，网址为：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/115450812?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=54&RID=2XABFGHC015；

在NCBI网站上分析EXP18-D基因的map view，网址为：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=4530&chr=3&MAPS=rna-r&cmd=focus&fill=40&query=uid(1556461)&QSTR=NM%5F001055542%2E1；图5为水稻基因EXP18-D的基因图谱，由此可看出该基因含三个外显子，两个内含子；

在NCBI网站上分析EXP18-D基因启动子的 map view，网址为：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/maps.cgi?TAXID=4530&CHR=3&MAPS=rna-r&QSTR=NM_001055542.1&QUERY=uid%281556461%29&BEG=3%2C005%2C820&END=3%2C008%2C400；图6为 EXP18-D基因启动子的图谱，第一个外显子前2000bp左右的片段即为启动子区；

在NCBI网站上找到已公布的水稻EXP18-D基因上游的序列，网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008396.1?from=3005820&to=3008400&report=genbank，

以上网址链接的页面显示了水稻EXP18D基因第一个外显子前2500bp左右的序列，本实施例截取其中的1957bp，详见序列表SEQ ID No：1，作为最终需要克隆的出来的所述的水稻根特异性表达基因EXP18-D启动子；

b. 在水稻根DNA克隆得到所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子；

取生长8-12d，优选为10d的水稻植株，采用CTAB法提取水稻根DNA；

以上述水稻根DNA为模板进行PCR反应，得到水稻EXP18-D基因的启动子；

所述的PCR反应体系为：  

5× buffer：5μl，dNTP Mix (2.5 mM each)： 2 μl，Primer Mix (5 μM each) ：2 μl，cDNA： 1 μl，PrimeSTAR ：0.25 μl，ddH₂O ：14.75 μl；

所述的PCR反应的引物为序列：

Upper：5-accaa ggcatgtcaa agtc-3，Lower： 5-gttccccatttcctcttag-3；

所述的PCR反应程序为：

94℃预变性5 min；98℃变性10s，50℃退火15 s，72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃ 延伸10min；4℃保存；

Ⅲ、水稻根特异性表达基因EXP18D启动子功能验证：

A、在线分析得到将所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；

在Softberry网站在线分析预测所述的稻根特异性表达基因EXP18D启动子的转录起始位点，上述Softberry在线分析网址为：http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfind，分析结果表明：所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的转录起始位点可能位于自序列表SEQ ID No：1中的5′端第1849位的碱基T；

 在PlantCARE网站在线分析预测所述的水稻根特异性表达基EXP18D启动子含有的顺势作用元件：

上述PlantCARE在线分析网址为：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/；图7为所述的水稻根特异性表达基EXP18D启动子序列中含有的顺式作用元件的分析结果：所述的水稻根特异性表达基EXP18D启动子序列（序列表中序列1）的自5′端第402－408位核苷酸为光响应元件G-Box，自5′端第291－295位核苷酸为胚乳表达所需的顺势作用元件SKn-1 motif，自5′端第1294－1300位胚乳表达所需的顺势作用元件GCN4 motif，自5′端第228-232位、820－824位、925-929位、994-998位、1130-1134位核苷酸为根特异表达相关元件ROOTMOTIFTAPOX1；

   B. 将所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到6种EXP18D启动子缺失体P1、P2、P3、P4、P5、P6片段；

具体的操作为：

以水稻根cNDA序列为模板，分别根据上述6种EXP18D启动子缺失体P1、P2、P3、P4、P5、P6设计引物，再进行PCR反应，分别得到以上6种EXP18D启动子缺失体的扩增产物，再进行回收处理，得到6种EXP18D启动子缺失体片段；下表中为以上6种EXP18D启动子缺失体的详细信息，图8为以上6种EXP18D启动子缺失体的结构简图。

                                                 

所述的PCR反应的体系为：

5× buffer：5μl，dNTP Mix (2.5 mM each)：2 μl，Primer Mix (5 μM each)：2 μl，水稻根cDNA ：1 μl，PrimeSTAR： 0.25 μl，ddH₂O：14.75 μl；

所述的PCR反应的程序为：

94℃预变性5 min；98℃变性10 s，50℃退火15 s，72℃ 延伸2 min，共30个循环；72℃ 延伸10min；4℃保存；

C. 将上述6种EXP18D启动子缺失体P1、P2、P3、P4、P5、P6片段分别构建EXP18D启动子缺失体GUS表达载体：

a.分别将上述6种EXP18D启动子缺失体片段连接到PMD18-T质粒载体上，再进行转化处理、振荡培养处理、质粒提取处理，得到6种EXP18D启动子缺失体片段-PMD18-T质粒载体：P1-PMD18-T质粒载体、P2-PMD18-T质粒载体、P3-PMD18-T质粒载体、P4-PMD18-T质粒载体、P5-PMD18-T质粒载体、P6-PMD18-T质粒载体；

所述的连接中的连接体系为：solutionⅠ：1μl，PMD18-T质粒载体：0.5μl，6种EXP18D启动子缺失体片段：4.5μl；该连接体系16℃连接过夜，分别得到6种连接产物；

所述的转化处理为：将上述每种连接产物5μl加入100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30分钟；再42℃热激45秒，冰上放置2分钟；再加入500μlLB无抗培养基，于37℃ 转速150rpm振荡培养1小时；再以转速4000rpm离心5分钟，用枪吸掉400μl左右上清液，余下的用涂布棒涂布在含氨苄青霉素的养基上；再于37℃过夜培养，得到单菌落；

所述的振荡培养处理为：挑取分别上述生长出的单菌落，加入LB液体培养基，37℃过夜振荡培养；再分别取菌液进行菌液PCR，选出验证正确的菌液；

所述的质粒提取处理为：将上述验证正确的菌液用宝生物工程（大连）有限公司的DV801A型质粒DNA小量纯化试剂盒进行质粒提取处理，得到6种EXP18D启动子缺失体片段-PMD18-T质粒载体：P1-PMD18-T质粒载体、P2-PMD18-T质粒载体、P3-PMD18-T质粒载体、P4-PMD18-T质粒载体、P5-PMD18-T质粒载体、P6-PMD18-T质粒载体；   。

b. 分别将上述6种EXP18D启动子缺失体片段-PMD18-T质粒载体分别用内切酶HindⅢ、NcoⅠ进行酶切处理，得到6种EXP18D启动子缺失体酶切小片段，分子量（不包括HindⅢ、NcoⅠ酶切位点）分别约为：P1为1957bp，P2 为1720 bp，P3为1066 bp, P4为 954 bp，P5为776 bp，P6 为432 bp； 

c．将表达载体PCAMBIA1391用内切酶HindⅢ、NcoⅠ进行酶切处理，得到分子量为10780bp左右的载体大片段；

上述酶切处理中，酶切体系为：10×buffer： 2μl； HindⅢ：1μl，NcoⅠ：1μl，质粒：10μl，ddH₂O；6μl；于37℃反应3小时；    

d. 分别对上述6种EXP18D启动子缺失体酶切小片段、分子量为10780bp左右的载体大片段进行回收处理，再分别进行连接反应，分别得到连接产物；

上述连接反应中，连接体系为：10×buffer：1μl，载体大片段：1μl，

每种EXP18D启动子缺失体酶切小片段：7μl，T4DNA连接酶：1μl；16℃连接过夜；

参考Ⅲ-C-a中的方法将6种连接产物分别进行转化处理、振荡培养处理、质粒提取处理，得到6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体：质粒载体PCAMBIA-GUS-EXP18D-P1、质粒载体PCAMBIA-GUS-EXP18D-P2、质粒载体PCAMBIA-GUS-EXP18D-P5、质粒载体PCAMBIA-GUS-EXP18D-P4、质粒载体PCAMBIA-GUS-EXP18D-P5、质粒载体PCAMBIA-GUS-EXP18D-P6；  

图9中为以上6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体的结构简图。

D、将所述的6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到T3代转化体植株，再进行检测。

a. 将所述的6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体转入拟南芥，得到T3代拟南芥植株转化体；

试验材料：

拟南芥(Arabidopsis thaliana)为Columbia-0野生型，菌株与质粒：大肠杆菌(Esche-richia coli)DH5a菌株、农杆菌(Agrobacterium turnefaciens)EHA105（GV3101）菌株；

主要试剂：

70%消毒酒精、漂白消毒剂(50% 家用漂白剂、50％无菌水、0.05% Tween-20)、Silwet L-77、蔗糖(试剂级)、葡萄糖(试剂级)、食用蔗糖、甘露醇等；

培养基：

LB培养基1L：10 g胰蛋白胨(Tryptone)；5 g酵母提取物(Yeast Extract)；5 g NaC1；

渗透培养基：5% 蔗糖，0.3%-0.5% Silwet L-77，PH 5.7；

筛选培养基：1／2MS；8 g／L琼脂；50 μg Kan；pH 5.8。

（a）．拟南芥的培养与处理：

将春化3～4 d的拟南芥种子播种于用PNS(Plant Nutrition Solution)培养液浸湿的人工土中(腐殖土：蛭石=1：1)，并用保鲜膜罩上，置于人工培养室中光照培养，1个月后揭膜(培养室条件：相对湿度70% ，恒温(23±2)℃ ，光照强度4 000 lx，光照周期为黑暗8 h、光照16 h)；待植物培养至初生花序约5～15 cm、次生花序刚刚形成花芽状时，去除初生花序，有益于次生花序的生长发育，便于渗透转化；渗透转化处理应在去除初生花序3～5 d内完成；并且在渗透转化的前1 d植物需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开；

（b）. 菌液的培养：将制备好的已转化了6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体的农杆菌菌液10mL，在转化前1 d晚上，转入大瓶过夜培养；第2天取出使用时农杆菌液OD600为约2.0；于室温离心处理（5000rpm，15 min），弃上清液，将农杆菌沉淀悬浮于约3倍体积的渗透培养液中，使OD600在0.8左右；

（c）. 农杆菌侵染拟南芥花序：将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染15秒；或用胶头滴管吸取农杆菌悬浮液一滴一滴对每朵花进行侵染；再用保鲜膜将侵染过的植物(T0代植物)罩起来以保持湿度，置人培养室中暗培养10 h，然后置于正常培养条件，2～3 d后可去掉保鲜膜；转化后1周左右方可浇水，并定期继续侵染几次，继续培养至植物成熟，收种子(T1代)放在干燥环境中1周左右，即可筛选到转化子；

（d）. 拟南芥T1代种子的筛选：将T1代种子先用70%的酒精浸泡消毒，再用漂白消毒剂溶液处理；消毒后的种子均匀地涂布在筛选培养基表面，于4℃放置2～3 d后，移至人工培养室中培养；然后将确定的转化子转入土壤中培养至成熟，收获种子（T2代种子）；

（e）.将上述T2代种子按照d中的方法进行筛选、培养，收获T3代种子；

（f）.将上述T3代种子经过两次筛选得到T3代纯合种子，消毒后在MS培养基培养，得到T3代拟南芥转化体植株；

b. 将所述的T3代拟南芥转化体植株进行GUS 组织化学染色处理，观察染色结果；

（a）．配制GUS染色液和脱色液：

配制所述的GUS染色液：取5 mg X-gluc 溶于410 μl二甲甲酰胺，分装成 20 uL/管，置于-20℃ 冰箱中储存，用时取一管加下述溶液配成染色液（现配现用）：

50 mM 磷酸钠缓冲液(pH7.0) ：760 ul （高压灭菌），50 mM K₃[Fe(CN)₆]： 10 μl（过滤灭菌），50 mM K₄[Fe(CN)₆] ：10 μl（过滤灭菌），0.5 M EDTA ：10 μl（高压灭菌），

Triton X-100 ： 1 μl，甲醇：200 ul；

所述的脱色液为浓度70％的乙醇溶液；

(b). 取a-（f）步骤培养十天的拟南芥植株转化体放入所述的GUS染色液中进行染色处理，温度为37℃，时间为3小时以上；

(c). 用脱色液进行脱色处理12-24小时，在显微镜下进行观察，拍照；结果如下：

图10为以上6种EXP18D启动子缺失体GUS表达载体在拟南芥转化体植株的表达量的Gus染色图；图10包括P1-P6共6部分，每部分的左侧的植株为转入相应的EXP18D启动子缺失体GUS表达载体的拟南芥植株转化体，右侧为野生型植株作为对照；由P1-P3部分可见，EXP18D启动子缺失体GUS表达载体特异性地在拟南芥植株的根部表达；由P1-P6部分可见，随着启动子序列长度的缩短，gus基因在根中的表达量逐渐降低；当启动子缩短为954bp时不再具有活性，说明在-967~ -855区域可能存在与根特异表达相关的调控元件。

本实施例中，使用各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶、 PrimeSTAR酶均购自Takara 公司；各种 Marker购自Takara公司；各种PCR反应试剂盒购自Takara公司；DNA纯化试剂盒、PMD18-T质粒载体试剂盒、表达载体PCAMBIA1391试剂盒均购自Promega公司；DNA凝胶回收试剂盒型号为 DV805A，购自宝生物工程（大连）有限公司；CTAB、Trizol等其他常规生化试剂和试剂盒购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。

本实施例中，各种PCR引物合成和DNA测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

本实施例中，各种PCR反应使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因扩增仪，购自MJ Research Inc公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。

本实施例中，采用的DNA提取、PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法记载于各个试剂盒的说明书中；上述基本操作方法也可以参考《分子克隆实验指南第三版》中（（美〕J.萨姆布鲁克 等著，科学出版社，2002年出版），和《植物基因工程原理与技术》中（王关林, 方宏筠 著，科学出版社，1998）。

Claims (6)

1.一种水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

Ⅰ、获取拟南芥根特异性基因EXP18：

A、分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总RNA和拟南芥叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列；

B、分别以所述的拟南芥根cNDA序列和拟南芥叶cNDA序列为模板，分别根据拟南芥根特异性基因设计引物，再分别进行半定量PCR反应，筛选得到拟南芥根特异性基因EXP18；

Ⅱ、获取水稻根特异性表达基因EXP18D启动子：

A、将所述的拟南芥根特异性基因EXP18的序列进行在线分析比对，得到水稻根特异性基因；

B、分别从水稻植株中提取水稻根总RNA和水稻叶总RNA，再分别进行反转录PCR反应，分别扩增得到水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列；

C、分别以所述的水稻根cNDA序列和水稻叶cNDA序列为模板，分别以所述的水稻根特异性基因设计引物，进行半定量PCR反应，筛选得到水稻根特异性表达基因EXP18D；

D、在线分析得到水稻根特异性表达基因EXP18D的启动子，再在水稻根DNA中进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子。

2.根据权利要求1所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，其特征在于：

步骤Ⅰ-B中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为：AT1G79580.1、AT1G62980.1、AT1G66470.1、AT1G27740.1、AT1G54970.1、AT3G10710.1、AT1G12560.1、AT2G26420.1、AT1G12040.1、AT1G62440.1、AT3G62680.1、AT2G26290.1。

3.根据权利要求1所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，其特征在于：

步骤Ⅱ-A中所述的水稻根特异性基因在日本水稻基因组数据库（RGP）的编号分别为：os03g0377100、os01g0249100、os01g0248900、os03g0156000、 os01g0274500。

4.根据权利要求1所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，其特征在于：所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的序列为SEQ ID No：1。

5.根据权利要求1所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，其特征在于：

在步骤Ⅱ之后，进行所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子功能验证，包括以下步骤：

A、在线分析得到将所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的转录起始位点、含有的顺势作用元件；

B. 将所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子进行5’端缺失处理，经过PCR反应得到EXP18D启动子缺失体片段；

C. 将所述的EXP18D启动子缺失体片段分别构建EXP18D启动子缺失体GUS表达载体；

D、将所述的EXP18D启动子缺失体GUS表达载体转化拟南芥植株，得到转化体植株，再进行检测。

6.根据权利要求5所述的水稻根特异性表达基因EXP18D启动子的克隆方法，其特征在于：所述的EXP18D启动子缺失体片段的大小分别为1957 bp、1720 bp、1066 bp、954 bp、776 bp、432 bp。

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