CN102517286A - 从毛白杨中分离的温和的组成型表达启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从毛白杨中分离的温和的组成型表达启动子及其应用。本发明所述温和的组成型表达启动子为SEQ ID No.1所示多核苷酸序列。本发明还公开了含有所述组成型表达启动子的重组植物表达载体及宿主细胞。将本发明组成型启动子与GUS基因可操作的连接后转化到拟南芥中，获得转基因植株；GUS组织化学染色和GUS活性分析证实，本发明所分离的启动子为组成型启动子，指导GUS基因在植物各组织及发育各阶段进行温和的转录或表达。本发明进一步公开了所述组成型启动子以及含有该组成型启动子的重组植物表达载体在构建转基因植物、培育植物新品种、建立植物生物反应器以及解析基因功能等方面的应用。

Description

从毛白杨中分离的温和的组成型表达启动子及其应用

技术领域

发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从毛白杨(Populustomentosa Carr.)中所分离的温和的组成型表达启动子及其编码的蛋白，本发明还涉及含有该温和的组成型表达启动子的重组植物表达载体以及宿主细胞，本发明进一步涉及它们在在构建转基因植物、培育植物新品种、建立植物生物反应器以及解析基因功能等方面的应用，属于植物组成型表达启动子的分离及其应用领域。

背景技术

启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并具有转录起始的特异性。启动子决定着转录的方向和转录的效率，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，是理解基因表达模式和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控的中心。

按作用方式和功能，可将启动子分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研究中，组成型启动子的应用最为广泛。组成型启动子控制的结构基因在所有组织部位中都能表达且表达水平没有明显变化，表达具有持续性，RNA和蛋白质表达量也相对恒定，不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导。在双子叶转基因植物中使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子(Odell J T，NagyF，Chua N H.Identification of DNA sequences required for activity of thecauliflower mosaic virus 35S promoter[J].Nature.1985，313(6005)：810-812；Mitsuhara I，Ugaki M，Hirochika H，et al.Efficient Promoter Cassettes forEnhanced Expression of Foregin Genes in Dicotyledonous andMonocotyledonous Plants[J].Plant and Cell Physiology.1996，37(1)：49-59)，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子(Christensen A H，Sharrock R A，Quail P H.Maize polyubiquitin genes：structure，thermalperturbation of expression and transcript splicing，and promoter activityfollowing transfer to protoplasts by electroporation[J].Plant Mol Biol.1992，18(4)：675-689.)和水稻的Actinl启动子(Mcelroy D，Zhang W，Cao J，et al.Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation[J].PlantCell.1990，2(2)：163-171.)，另外还有来自章鱼碱合成酶基因Ocs启动子和根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子(Angenon G，Van Montagu M，Depicker A.Analysis of the stop codon context in plantnuclear genes[J].FEBS Lett.1990，271(1-2)：144-146.)。

虽然组成型启动子为基因工程研究带来了许多便利，但是由于它驱动目的基因在植物各组织部位中恒定且持续表达，不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，因此在其应用过程中暴露出一些问题(Gittins J R，Pellny T K，Hiles E R，et al.Transgeneexpression driven by heterologous ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase small-subunit gene promoters in the vegetative tissuesof apple(Malus pumila mill.)[J].Planta.2000，210(2)：232-240.)，例如：外源基因在整株植物表达，产生的大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破植物的代谢平衡，不利于植物生长(Robinson D J.Environmental riskassessment of releases of trangenic plants containing virus-derived inserts[J].Transgenic Res.1996，5：359-362.)。另外，重复使用同一种组成型启动子驱动二个或二个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla S P，Chandrasekharan M B，Iyer L M，et al.Genome intruderscanning and modulation systems and transgene silencing[J].Trends in PlantScience.1998，3(3)：97-104.)。对于双子叶植物，CaMV35S启动子属于强启动子，它驱动的目的基因在植物体各组织部位均强烈表达，可能会对植物体造成上述不利影响，所以寻找一个较温和的组成型表达启动子，这样既可以在转基因植株内使外源基因有效发挥作用，同时又可以尽可能地降低对植株的不利影响，以期更好地调控植物基因表达。

发明内容

本发明目的之一是提供一种从毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中所分离的温和的组成型表达启动子及其编码蛋白。

本发明目的之二是提供含有上述组成型表达启动子的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的组成型表达启动子以及含有该启动子的表达载体应用于调控异源基因在植物中的转录或表达。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种从毛白杨中所分离的温和的组成型表达启动子，其多核苷酸序列为(a)或(b)所示：

(a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

(b)、与SEQ ID NO：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有启动子的功能或活性。

优选的，本发明所述的从毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中所分离的温和的组成型表达启动子为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。

为了研究本发明从毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中所分离的PtMCPpro序列(SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列)的功能或活性，本发明将PtMCPpro序列与GUS可操作的连接，构建得到PtMCPpro::GUS植物表达载体，采用花序浸染法转化拟南芥，获得转基因植株，进而进行GUS组织化学染色和GUS活性分析，对PtMCPpro表达特性进行研究。转基因拟南芥不同器官中的表达分析结果显示，PtMCPpro能够驱动GUS基因在成熟转基因拟南芥的根，茎，叶，花，角果等各个组织部位中表达，表达量相互有差异，但表达强度均低于内参ACTIN2。转基因拟南芥的GUS染色和活性测定表明PtMCPpro驱动的GUS基因在幼苗的根、茎、子叶、真叶表达，但是表达强度弱于阳性对照CaMV35Spro驱动的GUS基因表达。在成熟苗中，PtMCPpro驱动的GUS基因在根、茎、莲座叶、叶、花等各个组织部位表达，表达强度弱于阳性对照CaMV35Spro驱动的GUS基因表达。试验结果证实，本发明所分离的PtMCPpro序列为组成型启动子，表达强度明显低于CaMV35Spro启动子，具有温和性。

本发明的另一方面是提供由上述从毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中所分离的温和的组成型表达启动子所编码的蛋白或蛋白变体。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中所述诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明所述的启动子及其编码蛋白包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变或者是通过重组的方法得到的多核苷酸变体。

本发明进一步提供了含有所述组成型表达启动子的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将本发明所述组成型表达启动子与待转录的异源性DNA序列进行可操作的连接，即得到在植物体的各种组织以及各个发育阶段温和的转录或表达所述异源性DNA序列的重组植物表达载体。可以采用任何植物转化方法将所述的重组植物表达载体引入到目标植物(所述的目标植物包括被子植物、裸子植物；单子叶植物和双子叶植物；草本植物、木本植物和藤本植物；一年生植物和多年生植物；水生植物和陆生植物等)细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击、农杆菌介导的转化以及原生质体转化等。

本发明所分离的组成型表达启动子的主要应用：

本发明组成型表达启动子在构建转基因植物、培育植物新品种、建立植物生物反应器以及解析基因功能等方面有广泛的应用。

将本发明的组成型启动子可操作的与待转录的异源性DNA序列相连接，可以指导或调控待转录的异源基因在植物细胞或组织中进行温和的转录或表达，得到具有预期性状的转基因植物或植物新品种(例如：抗病、抗虫、抗除草剂或抗逆的植物新品种)。例如，将本发明的组成型表达启动子可操作的与待转录的异源DNA序列相连接(其中，该待转录的异源DNA序列还与3′非编码区可操作的连接，所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。)得到可以在植物组织或植物细胞中温和表达该待转录的异源DNA序列的植物表达载体。待转录的异源DNA序列不受限制，可以是结构基因、结构基因的反义基因、调节基因、调节基因的反义基因或者能干扰内源基因表达的小RNA等；所述的待转录的异源DNA序列可以是来自非靶基因物种的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物种中经过人工改造或修饰的核酸分子或基因，譬如：已经存在于植物细胞中的基因，来自另一植物的基因，来自不同生物体的基因，外部产生的基因(含基因的反义信息的核酸分子)以及人工修饰或改造的基因序列等。通常来说，待转录的异源DNA序列多为提供与下列期望特征有关的DNA序列，包括：植物形态、生理、生长和发育、产量、营养强化、病虫害抗性、环境或化学耐受性等，为植物体提供有益的性状，例如：除草剂抗性，增加的产量或生物量，病虫害的控制、高蛋白的生产、环境胁迫抗性的改善、固氮作用等。该待转录的异源DNA序列可以包括具有RNA活性的序列或产生多肽产物的序列等，例如，可以是反义序列、RNAi序列、核酶序列、剪接体、氨基酸编码序列以及它们的片段。

所述的植物表达载体中还可含有选择标记基因。

另外，可以将本发明的组成型启动子与标记序列可操作的连接以确定标记序列的活性，所述的标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：四环素抗性基因、潮霉素抗性基因；草苷膦或草丁膦抗性基因等。

本发明的组成型启动子还可用于调控植物代谢或分解代谢过程，这些过程包括但不限于：次级产物代谢、氨基酸合成、种子蛋白质储存、生物量增加等。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，Mol Cell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“组成型启动子”该启动子能够在几乎所有的植物组织以及几乎所有的发育阶段中指导或调控所控制的开放阅读框(ORF)在植物细胞或组织中的转录或表达，具有持续性、不表现时空特异性。

术语“异源性DNA序列”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。

术语“内源基因”来自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。

术语“选择标记基因”：该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势，用这些选择性标记基因所转化的这些细胞所具有的选择优势可以是由于它们与非转化细胞的生长相比具有在阴性选择剂(如：抗菌素或除草剂)的存在下生长的能力。选择标记基因还指多种基因的组合，它们在植物细胞中的表达给予该细胞阴性以及阳性的选择优势。

“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1毛白杨PtMCPpro的克隆与酶切鉴定；A：PCR产物，B：重组质粒的双酶切鉴定；M：1kb DNA ladder，1：PCR产物，2：重组质粒的Sac I和Kpn I双酶切产物。

图2毛白杨PtMCPpro序列分析。

图3pProtest质粒的结构示意图。

图4PtMCPpro::GUS植物表达载体构建；A：PtMCPpro::GUS植物表达载体双酶切鉴定；B：PtMCPpro::GUS植物表达载体的结构示意图。

图5转基因植株的分子检测及PtMCPpro表达特性分析；A：T1代转基因拟南芥GUS基因PCR检测；B：T1代转基因拟南芥GUS、ACTIN2基因的RT-PCR检测；C：PtMCPpro的表达特性分析(N，代表野生型；P，代表阳性质粒；A2，A3，A4，A5，A7，A8，A9，A11分别代表不同的转基因株系；R，S，L，F，Si分别代表Root，Stem，Leaf，Flower，Silique)。

图6PtMCPpro驱动的GUS基因在拟南芥不同组织器官中的表达及GUS活性测定；a，e：CaMV35Spro，b，f：WT，c，g：PtMCPpro的转基因株系A2，d，h：PtMCPpro的转基因株系A7，i：不同株系GUS活性测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料与试剂

1.1生物材料

用于提取植物基因组DNA的毛白杨无性系TC1521无菌组培苗和遗传转化受体植物哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.ecotypeColumbia，Col-0)均取自林木育种国家工程实验室；大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌菌株GV3101(购自Biovector Science Lab.Inc.中国质粒载体菌株基因库)由本发明人实验室保存；克隆载体pMD 19-T购自TaKaRa公司。

1.2主要试剂

植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒以及普通质粒小提试剂盒均购自北京天根公司，LA Taq酶、核酸分子量标准(DNAMarker Ladder)、T₄-DNA连接酶、限制性内切酶Sac I和Kpn I等购自TaKaRa公司；GUS(β-葡萄糖苷酶，β-glucuronidase)组织化学染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)、GUS活性测定底物4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯(4-MUG)购自Sigma公司。

实施例1毛白杨温和组成型启动子PtMCPpro序列的克隆与分析

1.1毛白杨温和组成型启动子PtMCPpro序列克隆

按照北京天根公司植物基因组DNA提取试剂盒的操作流程，以毛白杨无性系LM50无菌组培苗的叶片为材料提取基因组DNA，用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。PCR扩增所用引物包括：

上游引物5’-CTACGAGCTCTACTAAATAAATATATAA-3’，

下游引物5’-ATGGTACCATCTATCTGCCCCCTTGTC-3’，

在上下游引物的5’端分别加入Sac I和Kpn I酶切位点。20μL PCR反应体系包括：2μL(100ng)毛白杨基因组DNA，2μL 10×LA PCR缓冲液，1.6μL(2.5mmol/L)dNTP，0.4μL 10pm/μL上游引物，0.4μL 10pm/μL下游引物，0.2μL LA Taq DNA聚合酶(5U/UL)，13.4μL ddH₂O。PCR反应循环条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸2.5min，35个循环，然后68℃延伸10min。

PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后，通过PCR扩增得到大小约为2.6kb的片段(图1A)，切下目的条带，使用凝胶回收试剂盒(天根公司)回收、纯化目的片段。将纯化产物与pMD19-T载体连接，再转化DH5α感受态细胞，接种到含氨苄(100mg/L)的LB平板上37℃培养14-16h，挑取单菌落进行PCR，并对重组质粒进行限制性内切酶(Sac I和Kpn I)酶切鉴定(图1B)。证明该启动子片段已克隆到pMD19-T载体上得到PtMCP-T重组质粒。测序结果表明，该序列长度为2661bp。

1.2PtMCPpro序列的生物信息学分析

使用TSSP-TCM软件对PtMCPpro序列进行分析，预测其转录起始位点为A。联合使用PLACE和Plant CARE在线软件分析序列，预测其含有的主要启动子基本转录元件包括：TATA-box位于-19bp处，CAAT-box分别位于-71bp，TATC-box位于-28bp处，GARE-motif位于-473bp处，BoxI位于-587bp处，MBS位于-601bp，TC-rich repeats位于-620bp处，Box4位于-737bp处，GAG-motif位于-929bp处，TCA-element位于-1008bp处，CAT-box位于-1104bp，Sp1位于-1466bp处，TCT-motif位于-1527处，LTR位于-1613bp处，Box-W1位于-1689和-1833处，另外还有2个双相连作用元件：ABRE/G-box位于-543bp处、-576bp处和-1628bp处，CCGTCC-box/A-box位于-1334bp处(图2)。

其中，TATA-box为核心启动子元件，保证转录精确开始；CAAT-box可以控制转录的效率和频率；TATC-box和GARE-motif为赤霉素响应相关顺式作用元件；BoxI、Box4、GAG-motif、Sp1、TCT-motif、G-box为光响应元件；MBS为与干旱诱导相关的MYB结合位点；TC-rich repeats为抗病和逆境胁迫作用元件；TCA-element为水杨酸响应顺式作用元件；CAT-box为与分生组织表达相关顺式作用元件；LTR为低温响应顺式作用元件；Box-W1为真菌诱导元件；ABRE为脱落酸响应作用元件。

试验例1温和组成型启动子PtMCPpro的应用效果试验

1.pPtMCP::GUS植物表达载体的构建

将pProtest质粒(pProtest质粒的结构示意图为图3所示)进行Sac I和Kpn I双酶切，同时将PtMCP-T重组质粒进行Sac I和Kpn I双酶切，回收纯化目的片段，通过T₄-DNA连接酶连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，新的重组质粒经氨苄霉素(100mg/L)和PCR筛选后，进行双酶切验证(图4A)，获得植物表达载体pPtMCP::GUS，CaMV35Spro::GUS植物表达载体作为阳性对照(图4B)。采用液氮冻融法，将表达载体pPtMCP::GUS转入根癌农杆菌GV3101中，并进行菌落PCR鉴定，获得阳性克隆，完成工程菌制备。

2.拟南芥的遗传转化

通过液氮冻融法将pPtMCP::GUS表达载体转化到农杆菌GV3101中，利用花序浸染法转化拟南芥，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基筛选，获得抗性植株。

植物表达载体PtMCPpro::GUS在植物中表达卡那霉素抗性基因，将侵染后所收获的T₀代拟南芥种子均匀播种在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上，在筛选培养基上萌发并存活的植株即为T₁代阳性植株，其余假阳性的植株虽然能长出子叶，但是均不能长出真叶并且逐渐死亡，PtMCPpro::GUS转基因拟南芥筛得24株阳性植株，从中选取8个转基因株系用于研究。

3.转基因植株的分子检测

提取拟南芥抗性植株基因组DNA，以基因组DNA为模板，用标记基因GUS特异引物GUS-F：5’-GTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACC-3’；GUS-R：5’-CTGCCCAACCTTTCGG TATAAAGAC-3’进行PCR检测，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火15s，72℃延伸20s，30个循环，然后72℃延伸5min。能扩增到239bp的GUS基因片段的特异条带，初步推断为转基因阳性植株。提取拟南芥抗性植株总RNA并反转录cDNA第一链，将第一链cDNA稀释5倍备用，用标记基因GUS特异引物进行cDNA稀释产物为模板的PCR检测，反应条件同上，同时以拟南芥ACTIN2作为内参基因，特异引物ACTIN2-F：

5’-AAGCACAATCCAAGAGAGGTATTC-3’；ACTIN2-R：

5’-TACATAGCGGGAGAGTTAAA GGTC-3’，目的片段大小为219bp，在模板量一致的情况下，对GUS和ACTIN2基因进行RT-PCR检测。

以拟南芥抗性植物基因组DNA为模板对上述T₁代转基因植株进行PCR检测，结果显示转基因植株能扩增得到239bpGUS基因特异条带(图5A)，这说明目的片段可能已经整合进入植物基因组。挑选的8个株系均有特异性扩增条带，初步证实这8个拟南芥株系为转基因阳性植株。

以拟南芥抗性植株cDNA稀释产物为模板，同时以拟南芥ACTIN2作为内参基因，在模板量一致的情况下对GUS、ACTIN2基因进行RT-PCR检测，结果显示，8个株系的GUS表达丰度均弱于ACTIN2表达丰度，但不同株系间，GUS基因表达丰度有所差异(图5B)。

4.PtMCPpro驱动GUS基因在转基因拟南芥不同器官中的表达分析

随机选取8个拟南芥株系的其中一个株系A8作为研究对象，提取转基因拟南芥根，茎，叶，花，角果等各组织部位RNA，并反转录成cDNA第一链，以cDNA稀释产物为模板，进行RT-PCR检测；RT-PCR检测结果显示：PtMCPpro能够驱动GUS基因在成熟转基因拟南芥的根，茎，叶，花，角果等各个组织部位中表达，表达量相互有差异，但表达强度均低于内参ACTIN2(图5C)。

5.转基因拟南芥的GUS染色和活性测定

按照Jefferson等的方法进行GUS组织化学染色分析，在37℃避光染色过夜，染色后的各组织用75％乙醇脱色2-5h至无色，在体视显微镜下观察并拍照记录拟南芥各个组织部位的GUS染色结果。按照Jefferson等和Bradford等的方法进行GUS活性测定，GUS活性测定在pH 7.0的磷酸缓冲液中进行，反应时间为30min。反应中止后在激发波长365nm，发射波长455nm条件下进行荧光测定。所示活性测定结果为3次独立试验测定的平均值。

随机挑选两个转基因株系(A2和A7)作为研究对象，对转基因拟南芥幼苗和成熟苗进行GUS组织化学染色分析，结果显示，转PtMCPpro::GUS幼苗的根、茎、子叶、真叶等组织部位呈现蓝色(图6c，d)，但颜色弱于转CaMV35Spro::GUS幼苗各组织部位呈现的蓝色(图6a)。转PtMCP pro::GUS成熟苗的根、茎、莲座叶、叶、花等组织部位均被染成蓝色(图6g，h)，同样地，颜色弱于阳性对照转CaMV35Spro::GUS成熟苗各组织部位呈现的蓝色(图6e)。这说明PtMCPpro驱动的GUS基因在幼苗的根、茎、子叶、真叶表达，但是表达强度弱于阳性对照CaMV35Spro驱动的GUS基因表达。在成熟苗中，PtMCPpro驱动的GUS基因在根、茎、莲座叶、叶、花等各个组织部位表达，表达强度弱于阳性对照CaMV35Spro驱动的GUS基因表达。整体试验结果显示，不同株系GUS活性有所差异，但均远远低于CaMV35Spro驱动的GUS活性(图6i)。所以可判定本发明所分离的PtMCPpro序列为组成型启动子，表达强度明显低于CaMV35Spro，具有温和性。

Claims (10)

1.一种从毛白杨(Populus tomentosa Carr.)中分离的组成型启动子，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)或(b)所示：

(a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

(b)、与SEQ ID NO：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列仍具有启动子活性。

2.权利要求1所述的组成型启动子所编码的蛋白。

3.一种表达盒，其特征在于，包括：含有权利要求1所述的组成型启动子和待转录的异源基因序列。

4.含有权利要求1所述的组成型启动子的重组植物表达载体。

5.按照权利要求4所述的重组植物表达载体，其特征在于，包含：权利要求1所述的组成型启动子和待转录的异源基因序列；其中，组成型启动子和待转录的异源基因序列可操作的相连接，待转录的异源基因序列位于组成型启动子的下游。

6.按照权利要求5所述的重组植物表达载体，其特征在于：所述的待转录的异源基因包括结构基因、结构基因的反义基因、调节基因、调节基因的反义基因或者能干扰内源基因表达的小RNA。

7.含有权利要求4-6任何一项重组植物表达载体的宿主细胞。

8.权利要求1所述的组成型启动子在构建转基因植物或培育植物新品种中的应用，包括：将权利要求1所述的组成型启动子和待转录的异源基因序列可操作的连接后转化到植物细胞、组织或器官中得到转化体；将转化体通过组织培养再生得到完整的植株或无性系。

9.权利要求1所述的组成型启动子在建立植物生物反应器中的应用。

10.权利要求1所述的组成型启动子在分析基因或标记物功能中的应用。

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