CN110885822B - 一种琉璃苣启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种琉璃苣启动子，并提供了包含上述启动子的基因表达盒、载体、受体和转基因植物。可用于将目的基因通过载体转染至相应受体和/或植物中。本发明提供的琉璃苣启动子能够在宿主植物中表达酶、结构蛋白等多种类型蛋白基因。

Description

一种琉璃苣启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种琉璃苣启动子及应用。

背景技术

启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因的上游。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子调控模式的实质就是与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用。在基因工程技术蓬勃发展的今天，构建一种能够高水平表达异源蛋白质的表达载体，除了要具备克隆载体的一般要求之外，最重要的是必须带有能够控制外源插入的DNA片段进行有效转录和转译的DNA序列，即启动子结构。启动子作为基因工程表达载体的一个重要元件，对外源基因的表达水平影响很大。启动子与受体细胞之间的合理匹配对异源基因在宿主细胞中的表达起着重要的作用；同时出于高水平表达的要求，这种启动子最好是强启动子，并具有良好的调节控制系统。弄清启动子的分子本质才有可能找到提高克隆基因表达效率的有效途径。

琉璃苣（Borago officinalis L.）为紫草科（Boraginaceae）琉璃苣属（Borago）一年生草本植物，其种子油脂含量丰富，具有脂肪酸组成特殊、不饱和脂肪酸含量高、含有生物活性物质等特点，对人体的新陈代谢有较好的调节作用。目前，对琉璃苣中启动子的研究还没有报道。

发明内容

针对目前缺乏琉璃苣启动子对基因调控的作用，本发明提供一种琉璃苣启动子及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种琉璃苣启动子，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

一种包含上述启动子的基因表达盒。所述基因表达盒包括启动子、目的基因、终止子。所述目的基因的来源可以是植物、动物或微生物。

一种包含上述启动子的载体。所述载体是指能转移到受体中并能够自我复制的DNA分子，如细菌质粒、噬菌体和动植物病毒等。

一种包含上述启动子的受体。所述受体是指具有接受外源DNA的能力的细胞，如大肠杆菌、酵母菌、动植物细胞系等。

一种包含上述启动子、基因表达盒、载体或受体的转基因植物。所述转基因植物包括单子叶植物或双子叶植物。

本发明具有以下优点：

本发明提供的琉璃苣启动子能够在宿主植物中表达酶、结构蛋白等多种类型蛋白基因；而且可以通过对其中不同元件的删除、增加等基因工程的操作实现外界环境因素对Δ-6脂肪酸脱氢酶基因及其他基因的调控。

附图说明

图1为实施例1中PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图；

图2为启动子元件进行预测分析；

图3为检测阳性转化子PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图4为拟南芥转化株系的筛选PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图5为野生型拟南芥和转基因拟南芥的GUS分析。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 启动子和克隆与元件分析

剪取健康的琉璃苣叶片，置于液氮中研磨，采用CTAB法提取基因组DNA。根据已知Δ-6脂肪酸脱氢酶基因启动子的序列设计合成用于PCR扩增的一对引物：

正向引物：5’-AACCGTCAATAATGATGAAAATTTTG-3’；

反向引物：5’-TGAATAAAATATAAGAGGGTAGACTTTAAG-3’。

PCR反应体系如下：cDNA 4.0μL，10×Pyrobest Buffer 5.0μL，2 mmol/L dNTP 2μL，Pyrobest酶0.5μL，10μmol上下游引物各2.0μL，终体积为50μL。

PCR反应程序为：94 ℃预变性7min，然后进行30个循环：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃90 s，循环结束后72℃ 10 min延伸反应，4℃保温。

1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（图1），对扩增所得目的片段进行切胶回收。将回收的PCR产物与测序载体pMD19-T（TaKaRa）连接后，转化DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行筛选，再经菌落PCR检测后选择阳性克隆测序，最终获得一段长度为1134bp的启动子序列，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

将上述启动子序列提交Plant care网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/）对启动子元件进行预测分析，结果如图2和表1所示。

表1 琉璃苣启动子顺式作用元件

通过分析发现，该启动子上的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、AE-box、ARE、GT1-motif和TCCC-motif等。

实施例2 启动子对基因的调控

1. 载体构建

合成启动子-GUS基因，其上游添加EcoRI的酶切位点，下游添加Bg1II的酶切位点。将上述基因经双酶切后转入同样双酶切去除35S启动子的pCAMBIA-1303载体中，获得pCAMBIA1303- proBoD6D载体。随后，将pCAMBIA1303- proBoD6D阳性载体转染根癌农杆菌EHA105。以下序列为引物，检测阳性转化子：

proBoD6D-FP（EcoRI）：

5’-GAATTCAACCGTCAATAATGATGAAAATTTTG-3’；

proBoD6D-RP（Bg1II）：

5’-AGATCTTGAATAAAATATAAGAGGGTAGACTTTAAG-3’。

PCR反应体系如下：质粒 0.2μL，10×Pyrobest Buffer 5μL，2 mmol/LdNTP 2μL，Pyrobest酶0.5 μL，10μmol上下游引物各2.0μL，终体积为50μL。

PCR反应程序为：94℃预变性7min，然后进行30个循环：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，循环结束后72℃ 10 min延伸反应，4℃保温。

1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（图3），对扩增所得目的片段进行切胶回收、测序，表明获得了阳性转化子。

拟南芥转化

（1）拟南芥转化与培养

将根癌农杆菌EHA105阳性转化子的单克隆菌落至5mL LB（含Rif 50mg/L+Kan 50mg/L），28℃摇菌过夜。培养得到的菌液倒入250mL LB（含Rif 50mg/L +Kan 50mg/L），28℃振荡培养24h。将菌液倒入50mL离心管，4 000rpm离心10min，收集菌体。用5%蔗糖转化液悬浮菌体，使OD₆₀₀为0.6-0.8，加入0.03% Silwet L-77表面活性剂，备用。

将拟南芥种子放入1.5mL离心管，加入1mL 75%乙醇漂洗消毒2min。离心沉淀种子，吸干乙醇。加入1.0% NaClO消毒10min，吸干NaClO溶液。用无菌水漂洗5次。用0.2%琼脂重悬浮种子，并将其均匀的铺在1/2 MS培养基平板上发芽。4℃春化2d后，平放于22℃植物培养室中培养。长至10天后，移至土壤中培养至盛花期。剪除已有的果荚后，进行花浸泡法转化拟南芥Columbia野生型，浸泡2min。用塑料膜覆盖转化后的植物避光平放36h，保持湿润。然后正常放置，使其在土壤中继续生长，待成熟后收集种子。

（2）拟南芥转化株系的筛选

筛选过程与拟南芥的培养过程一致，差异在于培养基中抗生素30mg/L Hyg。利用所设计的PCR特异引物，对挑取的5株转基因植株分别进行两次独立的PCR检测，检测条件和引物如阳性转化子检测，能扩增出特异DNA片段，而以非转化拟南芥基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图4所示。10天后，经筛选的阳性植株移至土壤生长，待成熟收集种子即得T0代。按照上述方法筛至T2代后保存纯合体种子作为实验材料备用。

启动子-GUS报告盒的表达模式分析

将野生型拟南芥和转基因拟南芥植株分别浸入GUS染色液中，抽真空15 min，37℃保温12 h进行GUS染色。用85％的乙醇脱色几次，解剖显微镜下观察拍照，结果如图5所示：GUS分析显示，启动子成功介导了GUS基因表达。幼苗时期，根、茎和叶均被着色且着色较深，说明该启动子在幼苗期具有较强的活性。

序列表

<110> 山东省农业科学院农产品研究所

<120> 一种琉璃苣启动子及其应用

<130> 20191129

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1134

<212> DNA

<213> Borago officinalis

<400> 1

ggttttgaag acttgaatga tctctactct agtgtgaaag attagttgta tttatagtcg 60

actactacta catcatttgc aaaggatcat gcatatctaa acaatatgat cagttagtgt 120

atgaataact agtaagcaac ttgtacgtag gtagaagttg aggtggaaag ttatgatatt 180

ttatttatag attcattatt ttatcatatt tagtaatttg aaatacatat ttatgtattg 240

aaatacacaa tttttaataa gtttatatat taaaatatat ataaaatgta ataattttgt 300

gttaattttt tttgtaaata acgataattt aaaggactct aaccaattaa cttgcaactt 360

atttgacaag ataagagaaa caaatgattt gatgactgag ttgtttgaac gagttgaaaa 420

cctttttcga ctcgacataa attataagtc tgggggaaat ccttcttgaa tcaacttgag 480

cttttgcatg tttaaatttg atgtatttga ttatttatgt ctacttgatt tgactcgatg 540

tcgaacaaat tttaatattt tggttaaaac gattagattt tcatgtatta aataactcgg 600

acttagttca agtttaagat aaatggttta atcattaagt taaaaatgtt taatttttct 660

gtaagtaatt ttatttattt ccaattggtt tgattttatt gtttattcaa tagtcatttt 720

ggccaattat aattataatt tattttaatg caaaattgtc aattaatttg gtatctaagg 780

atgcaaaagg aactcacagt tacattgctg gatgaattga cagaacttat aattacatta 840

cttagataaa ttgacataac aatagaaata gaagcttgca tagttgcatg caacatacgt 900

atatttcttg taatcactta acttagtttc ctgtctgctt caattgtaaa aagggagtat 960

tattgtgggc ccttaaatgt gatatgtcat tcaagaaatt attgaaaaac ttctatatcc 1020

tattctcgta attgattctc cctaattatt acggagtatg ttgtaattta tttttgtttt 1080

cccttaacaa tttagtttca tataataatg aaattgttac tccatatttt ccat 1134

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F1

<400> 2

aaccgtcaat aatgatgaaa attttg 26

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1

<400> 3

tgaataaaat ataagagggt agactttaag 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> proBoD6D-FP

<400> 4

gaattcaacc gtcaataatg atgaaaattt tg 32

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> proBoD6D-RP

<400> 5

agatcttgaa taaaatataa gagggtagac tttaag 36

Claims (7)

1.一种琉璃苣的启动子，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.一种包含如权利要求1所述的启动子的基因表达盒。

3.根据权利要求2所述的基因表达盒，其特征在于，包括启动子、目的基因、终止子；所述目的基因的来源为植物。

4.一种包含如权利要求1所述的启动子的载体。

5.一种包含如权利要求1所述的启动子的受体，其特征在于，所述受体选自大肠杆菌、酵母菌或动物细胞系。

6.一种如权利要求1所述的启动子、如权利要求2或3所述的基因表达盒、如权利要求4所述的载体或如权利要求5所述的受体在获得转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转基因植物包括单子叶植物或双子叶植物。

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