CN105803066B

CN105803066B - 与抗棉花黄萎病QTLvw1位点连锁的分子标记及其应用

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Publication number: CN105803066B
Application number: CN201610188712.XA
Authority: CN
Inventors: 赵君; 肖松华; 刘剑光; 吴巧娟; 徐剑文
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2016-03-29
Publication date: 2019-04-23
Anticipated expiration: 2036-03-29
Also published as: CN105803066A

Abstract

本发明公开了一种与棉花抗黄萎病主效QTLvw1位点连锁的分子标记，所述主效QTLvw1位点位于棉花D4染色体上，并且与所述主效QTLvw1位点连锁的分子标记为ZHX8、ZHX53和NAU3791。本发明所述分子标记在筛选或鉴定抗黄萎病棉花品种、克隆或精细定位QTL中包含的抗病相关基因中有重要应用价值。本发明可以应用于标记辅助育种，有助于解决我国棉花黄萎病抗性育种进展缓慢的问题，同时也可以克服棉花黄萎病抗性鉴定中存在的时间长、稳定性低、准确性差和易受环境影响的问题，加快棉花抗黄萎病育种的进程。

Description

与抗棉花黄萎病QTLvw1位点连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及棉花分子标记技术领域，具体涉及一种与抗棉花黄萎病主效QTLvw1位点连锁的分子标记及其应用。

背景技术

棉花是我国主要的经济作物，棉花生产在我国国民经济中始终占有举足轻重的地位。棉花的病害比较多，特别是黄萎病，给棉花生产造成巨大损失。棉花黄萎病是Carpenter于1914年在美国弗吉尼亚州发现并报道的，它是由大丽轮枝菌引起的一种真菌性病害。

我国棉花黄萎病是由于1935年引进美国斯字棉4B棉种传入我国的，以后随着棉种的繁殖和调运，棉花黄萎病在我国各主要产棉区逐渐传播开来。1973年普查结果显示，全国枯、黄萎病面积36.98万hm²，占统计棉田的10％，1979年增至71.17万hm²，占统计棉田的18.2％(全国棉花枯、黄萎病综合防治研究协作组，1976)。1982年农牧渔业部对全国棉花枯、黄萎病发生状况进行普查，其发生面积达148.2万hm²，占当年植棉面积的31.26％，其中纯黄萎病田面积13万hm²，占病田面积的8.7％(马存，2007)。20世纪90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，其中1993年棉花黄萎病爆发成灾，发病面积达266.67万hm²，损失皮棉1亿公斤以上。1995年、1996年棉花黄萎病在全国范围内连续大发生，给棉花生产造成极大的损失。2000年棉花黄萎病在新疆危害严重，其中农五师2.67万hm²棉田中有0.67万hm²重病田。2002和2003年棉花黄萎病在北方棉区再次连续大发生，给棉花生产造成重大损失。到目前为止，由于缺少棉花抗黄萎病的栽培材料，通过常规的育种手段来解决棉花对黄萎病的抗性进展缓慢(Caietal.，2009)。

我国棉花科技界公认的海岛棉抗黄萎病品种海7124具备抗枯斑型、黄斑型黄萎病特点。陆地棉是世界棉花的主要栽培种，但其遗传基础狭窄，缺乏对多种病、虫害的抗性。所以通过回交将海岛棉抗黄萎病相关的功能基因向陆地棉转移是提高陆地棉抗黄萎病的一个方向。但是由于棉花黄萎病菌在全国主产棉区存在着大量不同的生理小种，迄今尚未选育出能经受住生产实践检验的陆地棉抗黄萎病新品种。同时在每轮回交中，都要对黄萎病抗性进行检测，成本较高，时间相对较长，同时抗性鉴定还容易受到温度、湿度等环境因素的影响。因此，抗病育种的时间较长、成本较高，难度相对较大。

目前，随着分子标记技术的不断进步，研究者通过构建棉花遗传连锁图谱来定位抗病性状，研究取得很大的进展，检测到许多与抗性相关的QTLs(Bolek et al.，2005；Yanget al.，2008；蒋锋等2009)。到目前为止，在10条染色体或连锁群上共定位至少60个抗病相关QTLs(Wang et al.，2008；Zhao et al.，2014)。如Bolek等(2005)利用海岛棉抗黄萎病品种Pima S-7与陆地棉感病品种Acala44作为实验材料，对其F₂代单株多个表型数据分析表明，抗性受多基因控制。单标记分析和区间分析，检测出与抗黄萎病相关的QTL，其中，CM12，STS1和NEJ6与黄萎病抗性位点小于15cM，这三个标记都定位于11号染色体。蒋锋等(2009)利用抗黄萎病品系60182和感黄萎病品种军棉1号为亲本配制杂交组合，用F₂作为作图群体，将抗病相关QTLs主要定位在D7和D9染色体上。Ning等(2013)使用陆地棉Prema和86-1构建重组自交系群体对黄萎病抗性QTL进行定位，通过混合人工病圃接菌鉴定，共检测到7个显著的QTLs；利用温室接菌鉴定，共检测到5个显著的QTLs，分别位于A9、D3、D11和D9染色体上，其中一个位于D9染色体上的QTL在四个不同的环境中均能被检测到。在D4染色体上也定位了部分与抗病相关的QTLs。Wang等(2012)在D4染色体定位抗根癌线虫QTL，解释表型变异7.7％。Yang等(2008)利用海岛棉海7124和陆地棉军棉1号配制的F₂和BC₁群体，在D4染色体检测到抗病QTL，且与标记NAU3392连锁，解释表型变异20.3％。可见分子标记对于从分子水平上研究棉花的抗黄萎病机理具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种与棉花抗黄萎病主效QTLvw1位点连锁的分子标记；

本发明的另一目的是提供与棉花抗黄萎病主效QTLvw1位点连锁的分子标记的应用。

本发明采用如下技术方案：

1、一种与棉花抗黄萎病主效QTLvw1位点连锁的分子标记，所述主效QTLvw1位点位于棉花D4染色体上，在抗黄萎病株系苏研VR025和苏棉8号配制的F2群体中，QTLvw1能解释13.99％-25.98％的表型变异，并且与所述主效QTLvw1位点连锁的分子标记为ZHX8、ZHX53和NAU3791，各分子标记引物序列及在抗病品系苏研VR025中扩增的目的条带长度如下：

ZHX8的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在高抗黄萎病种质系苏研VR025中可扩增出长度为225bp的DNA片段；

ZHX53的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在高抗黄萎病种质系苏研VR025中可扩增出长度为460bp的DNA片段；

NAU3791的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在高抗黄萎病种质系苏研VR025中可扩增出长度为230bp的DNA片段。

与抗棉花黄萎病主效QTLvw1位点连锁的分子标记的应用，包括：

(1)在定位棉花抗黄萎病主效QTLvw1位点中的应用；

(2)在鉴定棉花抗黄萎病性状中的应用；

(3)在筛选和鉴定棉花抗黄萎病品种中的应用。

具体地，本发明提供的分子标记，通过以下方法获得：

(1)以陆地棉苏棉8号为母本，海岛棉H7124为父本杂交，杂交后代用苏棉8号回交产生BC1，次年将BC1播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择抗病单株，与苏棉8号回交产生BC2，次年将BC2播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择抗病单株，与苏棉8号回交产生BC3，连续回交，鉴定产生BC6，自交2代，产生BC6F2。在黄萎病人工病池中鉴定，获得一个抗黄萎病的种质系苏研VR025。根据本方法，结合分子标记选择，就可以获得本研究中的种质系苏研VR025。

(2)该种质系经过连续三年两地(江苏农科院和中国棉花研究所)抗病性鉴定，都表现出对黄萎病的抗性，平均病指为10.5％。苏棉8号由江苏省太仓市棉花育种中心选育，高感黄萎病，平均病指为68.3％。通过标记分析，抗黄萎病株系苏研VR025携带海岛棉海7124染色体D4的一个片段。抗黄萎病株系苏研VR025与苏棉8号配制的F2群体作为作图群体，利用已经公布的棉花基因组序列，开发92对SSR分子标记，同时利用已经公布的D4染色体的分子标记，对群体亲本苏研VR025与苏棉8号进行多态性分析；共获得48对具有多态性的SSR标记，利用这些多态性引物对群体中每个单株的DNA进行PCR扩增，从而确定群体的基因型，利用遗传作图软件JoinMap 3.0软件构建棉花染色体遗传图谱。同时F2单株自交，获得F2：3家系，并在温室播种，接种黄萎病菌BP2(菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，也可以通过市场购买)。接种后4周，根据国家棉花品种区域试验抗枯黄萎病鉴定方法(朱荷琴等，2007，国家棉花品种区域试验抗枯黄萎病鉴定方法.中国棉花34：9-10)对群体的每个家系进行调查，结合前期构建的遗传图谱，利用Windows QTL Cartographer 2.5软件，采用复合区间作图法(Composite interval mapping)，LR闽值为11.5(相当于LOD值2.5)，1000次测验检测黄萎病抗性的QTL。研究结果所述如下：

利用包含1100个单株的F2(苏研VR025×苏棉8号)群体构建连锁群，同时在温室中对F2：3接种非落叶性Bp2黄萎病菌，利用复合区间作图法定位抗病基因或抗病。连锁群包含48个标记，共覆盖15.5cM，标记间平均距离为0.32cM，标记间距离最远的是ZHX5与NAU5294，遗传距离为2.4cM。抗病鉴定共分为3次，分别是2013年春天，2014年冬天，2014年春天。其中第一次和第三次分别检测到2个QTL，定位在标记ZHX65-ZHX64和ZHX8-NAU3791之间，第二次抗病鉴定检测到3个QTL，定位在标记ZHX65-ZHX64、ZHX8-NAU3791和ZHX68-ZHX6之间。在3次鉴定中，位于标记ZHX65-ZHX64和ZHX8-NAU3791之间的QTL都能检测到，我们将位于标记ZHX8-NAU3791之间的QTL命名为QTLvw1，位于标记ZHX65-ZHX64之间的QTL命名为QTLvw2。其中QTLvw1解释13.99％-25.98％的表型变异，平均解释表型变异19.12％，LOD值在4.86-9.59之间。QTLvw2解释9.69％-24.51％的表型变异，平均解释表型变异18.15％，LOD值在3.23-8.85之间。

(3)在本发明中，QTLvw1和QTLvw2在3次独立试验中都能检测到，且在不同年份和不同环境中变现稳定。其中QTLvw1与标记ZHX8，ZHX53和NAU3791紧密连锁，且QTLvw1可由标记ZHX8，ZHX53和NAU3791标定。QTLvw2与标记ZHX64，ZHX81和ZXH65紧密连锁，且QTLvw2可由标记ZHX64，ZHX81和ZXH65标定。

本发明的有益效果是：

(1)本发明定位的抗病QTL位于棉花D4染色体，且与其连锁分子标记间的遗传距离只有1.8cM和1.3cM。这为今后精细定位抗病相关基因以及利用其进行标记辅助选择抗病棉花品种提供基础。

(2)本发明利用F2(苏研VR025×苏棉8号)群体构建连锁群对其包含的QTL进行分析，发现2个抗黄萎病主效QTL位点，分别为QTLvw1和QTLvw2，主效QTLvw1能解释13.99％-25.98％的表型变异，连锁的分子标记为ZHX8，ZHX53和NAU3791。主效QTLvw2能解释9.69％-24.51％的表型变异，连锁的分子标记为ZHX64，ZHX81和ZXH65。通过标记分析，抗黄萎病株系苏研VR025携带海岛棉海7124染色体D4的一个片段，且检测到的两个QTL位于该片段上，因此检测到的QTL来源于海岛棉海7124。

(3)本发明通过在不同年份、不同环境下接种黄萎病菌，研究结果表明，QTLvw1和QTLvw2在不同年份，不同环境中表现均很稳定，这为提高我国棉花品种的黄萎病抗性水平奠定了基础。

(4)本发明所述分子标记在筛选或鉴定抗黄萎病棉花品种、克隆或精细定位QTL中包含的抗病相关基因中有重要应用价值。本发明可以应用于标记辅助育种，有助于解决我国棉花黄萎病抗性育种进展缓慢的问题，同时也可以克服棉花黄萎病抗性鉴定中存在的时间长、稳定性低、准确性差和易受环境影响的特点，加快棉花抗黄萎病育种的进程。

(5)本发明定位的QTL已经通过多年回交，转育到目前主栽品种中，所以可以直接通过与常规品种杂交，结合标记选择来提高棉花黄萎病抗性，因此该发明不但可以加快我国棉花黄萎病抗性育种进程，而且可以服现有育种技术对黄萎病抗性存在鉴定成本高、时间长、稳定性低等问题，提高我国棉花品种的黄萎病抗性水平。

附图说明

图1本发明抗棉花黄萎病主效QTL的定位；

图中，QTLvw1和QTLvw2在3次独立试验中都能检测到，QTLvw1与标记ZHX8，ZHX53

和NAU3791连锁，QTLvw2与标记ZHX64，ZHX81和ZXH65连锁，R1，R2，R3分别代表不同年份和不同环境中3次独立试验。

图2是本发明与QTLvw1连锁标记在不同棉种中扩增情况；

图中，泳道1、2、3分别代表海岛棉海7124，苏研VR025和苏棉8号，箭头所示为海岛棉海7124，苏研VR025与苏棉8号之间的差异条带。

图3是本发明与QTLvw2连锁标记在不同棉种中扩增情况；

泳道1、2、3分别代表海岛棉海7124，苏研VR025和苏棉8号，箭头所示为差异条带。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

1、实验材料

以陆地棉苏棉8号为母本，海岛棉H7124为父本杂交，杂交后代用苏棉8号回交产生BC1，次年将BC1播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择抗病单株，与苏棉8号回交产生BC2，次年将BC2播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择抗病单株，与苏棉8号回交产生BC3，连续回交，鉴定产生BC6，自交2代，产生BC6F2。在黄萎病人工病池中鉴定，获得一个抗黄萎病的种质系-苏研VR025。该种质系经过连续三年两地(江苏农科院和中国棉花研究所)抗病性鉴定，都表现出对黄萎病的抗性，平均病指为10.5％。苏棉8号由江苏省太仓市棉花育种中心选育，高感黄萎病，平均病指为68.3％。通过标记分析，抗黄萎病株系苏研VR025携带海岛棉海7124D4染色体的一个片段。

2、群体配制

2012年夏，以苏研VR025为母本，苏棉8号为父本配制杂交组合得到F1，F1种子在当年南繁，自交得到F2种子，2013年春种植F2，自交，分单株收得到F2：：3种子。

3、试验方法

3.1DNA提取和纯化：

种植F2群体、苏棉8号和海岛棉品种H7124种子长成植株，于苗期取未展开叶片，用于基因组DNA的提取。提取基因组DNA的方法为：

(1)将5g鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。分2次加入10ml新鲜配制的提取缓冲液(见表1)，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min。4000rpm离心20min (4℃)，弃上清；

(2)于沉淀中加入15ml 65℃预热的裂解缓冲液(见表2)，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

(3)加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)混合液，翻转50次以上，4000rpm离心20min(15℃)，将上清转入50ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4000rpm，离心10min(室温)，弃上清，于沉淀中加入2ml 70％的乙醇洗涤，并转入10ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(4)加3ml TE缓冲液(PH＝8.0，1.0M Tris-HCl溶液2.5ml和0.5M EDTA溶液0.5ml混匀，蒸馏水定容至250ml灭菌)溶解，65℃培养10～30min，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min。弃上清液，加2ml 70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(6)加3ml TE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；

(7)加5μl RNAase A(10mg/ml)，37℃温育30～60min。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(8)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次；

(9)将絮状沉淀挑入加有800μl 70％乙醇的1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min。弃上清液，自然通风干燥DNA小团；

(10)加200μl TE缓冲液[10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)]溶解DNA(4℃，1～2天)，-20℃保存。

(11)以5μl北京天根100bp DNA Ladder作为对照，将DNA依次稀释5倍，10倍和20倍，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA的浓度、纯度以及完整性。

(12)根据提取DNA的浓度，用TE将DNA稀释至20ng/μl工作液，混匀备用。

表1 DNA提取缓冲液配方

表2 裂解缓冲液配方

3.2 PCR方法

(1)所用试剂及主要仪器

PCR反应所用Taq酶和dNTPs均购自北京天为时代公司，PAGE胶所用试剂包括丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，Tris-碱，硼酸，硝酸银，氢氧化钠，TEMED等试剂从剑纯生物科技公司采购。主要仪器包括东胜牌PCR仪，Eppendor高速冷冻离心机，水浴锅，摇床和北京六一仪器厂生产的电泳槽和电泳仪。

(2)PCR反应体系及扩增程序

PCR反应体系见表3。

表3 PCR反应体系

PCR反应在东胜牌PCR仪上进行，反应程序为：

电泳溶液配制：

扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度9％，电泳缓冲液为0.5×TBE，180V恒压电泳1.5～2小时。

9％PAGE胶：43.5g丙烯酰胺，1.5g甲叉丙烯酰胺，100ml 5×TBE，加蒸馏水定容至500ml，4℃保存。

10％过硫酸铵：10g过硫酸铵溶解在100ml蒸馏水中，4℃保存。

上样缓冲液：0.25g溴酚蓝+0.25g二甲苯氰+40g蔗糖，蒸馏水定容至100ml。

5×TBE：54g Tris-碱，27.5g硼酸，0.5M EDTA(PH＝8.0)20ml，蒸馏水定容至1L，室温保存。

染色液：1g硝酸银+500ml蒸馏水。

显色液：7.5g氢氧化钠+750μL甲醛+500ml蒸馏水。

凝胶制备及电泳过程：

(1)用清水将玻璃板、胶条和梳子洗净，晾干备用。

(2)将玻璃板、胶条和梳子按要求安装好，并用1％的琼脂糖凝胶封底，待凝胶凝固，将其固定在电泳槽上。

(3)在锥形瓶中倒入已经配制好的9％的PAGE胶，加入10％AP和TEMED，迅速灌胶，灌满后插入梳子，15-20分钟后，拔出梳子，准备电泳。

(4)电泳前在PCR扩增产物中加入2μL上样缓冲液，拔掉梳子，将电泳缓冲液(1XTBE)加入正负极电泳槽中，缓冲液高度要超过短玻璃板，每个点样孔上样2μL，180V恒压电泳1.5～2小时。到蓝色指示标记距胶下面2cm即可停止，小心拆开玻璃板去除凝胶，并对凝胶进行标记。

染色及显色过程：

(1)固定：将拆下来的凝胶放入固定液中(10％乙醇+0.5％冰乙酸)12min，

(2)染色：固定结束后，将固定液到出去，将染色液倒入(0.2％硝酸银水溶液)，12min 后，蒸馏水漂洗3次。

(3)显色：1.5％氢氧化钠+0.4％甲醛加入，摇晃，到胶片上条带显示清楚即可结束，适倒掉显色液，用自来水冲洗4次，将胶片放置在灯箱上拍照。

4、遗传图谱构建

利用已经公布的棉花基因组序列，开发92对SSR分子标记，同时利用已经公布的D4染色体的分子标记，对群体亲本苏研VR025与苏棉8号进行多态性分析。共获得48对具有多态性的SSR标记，利用这些多态性引物对群体中每个单株的DNA进行PCR扩增，从而确定群体的基因型，利用遗传作图软件JoinMap 3.0软件构建棉花染色体遗传图谱。连锁群包含48个标记，共覆盖15.5cM，标记间平均距离为0.32cM，标记间距离最远的是ZHX5与NAU5294，遗传距离为2.4cM。

5、F2：3家系黄萎病抗性鉴定以及QTL定位

5.1病菌培养

本研究所用黄萎病菌为BP2，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，该菌种属于研究中常用的常规菌种，一般可以通过购买或者赠送获得。

25℃下，将黄萎病菌BP2涂布于固体土豆培养基(马铃薯200g、琼脂17g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)表面，两周后转移到液体土豆培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)中，室温下振荡培养5天，测孢子浓度，将浓度稀释至5×10⁷个孢子/ml。

5.2接种方法

将处理好的棉花种子播于温室中的营养钵中，一钵两粒，每个株系种植20棵，重复3次。待棉株长到两叶一心时，进行营养钵撕底，以达到伤根的目的。对各材料分别用黄萎病病菌的分生孢子悬浮液进行接种，每营养钵10ml。接种后，关闭温室门窗，每天定期喷水两次，保持室内的温度和湿度以利于发病。一周将营养钵中死苗全部拔除，定期观察棉苗发病情况。

5.3鉴定方法

具体鉴定方法参考Ning(Ning et al，.2013)的方法。其中五级分类的标准如表4所示。分级标准为，0级：健株，无病叶，生长正常；1级：棉株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；2级：棉株四分之一以上，二分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；3级：棉株二分之一以上，四分之三以下叶片发病，变黄萎蔫；4级：棉株四分之三以上叶片发病，或棉株枯死。根据鉴定结果，计算病指，病指＝[∑(Ni×i)/(N×4)]×100；i＝0～4，Ni＝每级植株个数。

表4棉花苗期抗黄萎病鉴定分级标准

5.4QTL定位

根据国家棉花品种区域试验抗枯黄萎病鉴定方法(朱荷琴等，2007，国家棉花品种区域试验抗枯黄萎病鉴定方法.中国棉花34：9-10)对群体的每个家系进行调查，计算病指，结合前期构建的遗传图谱，利用Windows QTL Cartographer 2.5软件，采用复合区间作图法(Composite interval mapping)，LR闽值为11.5(相当于LOD值2.5)，1000次测验检测黄萎病抗性的QTL。研究结果所述如下：

抗病鉴定共分为3次，分别是2013年春天(R1)，2014年冬天(R2)，2014年春天(R3)。其中第一次和第三次分别检测到2个QTL，定位在标记ZHX65-ZHX64和ZHX8-NAU3791之间，第二次抗病鉴定检测到3个QTL，定位在标记ZHX65-ZHX64、ZHX8-NAU3791和ZHX68-ZHX6之间。在3次鉴定中，位于标记ZHX65-ZHX64和ZHX8-NAU3791之间的QTL都能检测到(见图1)，我们将位于标记ZHX8-NAU3791之间的QTL命名为QTLvw1，位于标记ZHX65-ZHX64之间的QTL命名为QTLvw2。其中QTLvw1解释13.99％-25.98％的表型变异，平均解释表型变异19.12％，LOD值在4.86-9.59之间。QTLvw2解释9.69％-24.51％的表型变异，平均解释表型变异18.15％，LOD值在3.23-8.85之间。

在本发明中，QTLvw1和QTLvw2在3次独立试验中都能检测到，且在不同年份和不同环境中表现稳定。其中QTLvw1由标记ZHX8，ZHX53和NAU3791标定。其中SSR/ZHX8的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在高抗黄萎病种质系苏研VR025和海岛棉H7124中可扩增出长度为225bp的DNA片段；SSR/ZHX53的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在高抗黄萎病种质系苏研VR025和海岛棉H7124中可扩增出长度为460bp的DNA片段；SSR/NAU3791的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQID NO.6，在高抗黄萎病种质系苏研VR025中和海岛棉H7124可扩增出长度为230bp的DNA片段(图2；表5)；QTLvw2由标记ZHX64，ZHX81和ZXH65标定。其中SSR/ZHX64的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在高抗黄萎病种质系苏研VR025和海岛棉H7124中可扩增出长度为370bp的DNA片段；SSR/ZHX81的正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，在高抗黄萎病种质系苏研VR025和海岛棉H7124中不能扩增出长度为310bp的差异片段；SSR/ZHX65的正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQID NO.12，在高抗黄萎病种质系苏研VR025和海岛棉H7124中可扩增出长度为410bp的DNA片段((图3；表5)。以上结果表明赋予种质系苏研VR025较高黄萎病抗性的QTL来源于海岛棉H7124。

表5与QTL紧密连锁的分子标记及引物序列

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.鉴定棉花抗黄萎病性状的引物，其特征在于，所述引物分别为ZHX8、ZHX53和NAU3791，并且各引物序列分别如下：

ZHX8的正向引物序列为SEQ ID N0.1，反向引物序列为SEQ ID N0.2；

ZHX53的正向引物序列为SEQ ID N0.3，反向引物序列为SEQ ID N0.4；

NAU3791的正向引物序列为SEQ ID N0.5，反向引物序列为SEQ ID N0.6。

2.权利要求1所述的引物在筛选和鉴定棉花抗黄萎病品种中的应用。