CN106191255B - 一种提高玉米单倍体雄穗育性恢复能力的方法及其专用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高玉米单倍体雄穗育性恢复能力的方法及其专用引物。本发明通过对单倍体雄穗育性恢复相关QTL的定位，开发相关的连锁标记，利用该标记进行分子标记辅助育种。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的方法能直接在苗期鉴定出含有位于6号染色体主效QTL位点qhmf4的单株，选择出含有该QTL位点的单株，有助于提高玉米单倍体雄穗育性恢复，促进玉米DH育种的利用。

Description

一种提高玉米单倍体雄穗育性恢复能力的方法及其专用引物
技术领域
本发明涉及一种提高玉米单倍体雄穗育性恢复能力的方法及其专用引物，属于分子遗传学育种领域。
背景技术
玉米是我国第一大粮食作物(张春雷，2012)，不但可以作为食用、饲用和工业等的重要来源，而且具有适应性广和高产的特征。随着气候环境的变化和人口的不断增长，为了满足对粮食的需求，加快育种流程是必经之路。
与连续自交5-7代得到纯合自交系的常规育种方法相比，单倍体育种只需要诱导和加倍两代便可产生纯系，能显著缩短育种年限，加快育种流程，提高育种效率。玉米单倍体育种主要包括单倍体诱导、单倍体鉴别和单倍体加倍三个步骤。随着新型诱导系的选育，鉴别效率的不断提高，单倍体加倍成为玉米单倍体育种的主要限制因素。
单倍体的染色体加倍方法主要有两种：化学加倍和自然加倍。化学加倍是指利用一些化学试剂诱导单倍体染色体加倍。最常用的化学加倍方法是秋水仙素芽苗浸泡法。尽管利用秋水仙素进行人工加倍能够大规模的产生DH系(Gayen et al.,1994；Barnabás etal.,1999)，但是这种化学试剂昂贵，毒性大，使用过程中需要发苗、移苗，操作繁琐，因此其利用具有一定局限性。自然加倍是指在自然环境条件下单倍体染色体发生自发的加倍(Jensen,1974)。目前，许多物种中都发现了一定比例的单倍体自然加倍。例如，油菜自然加倍率为10-40％(Henry,1998)，玉米的自然加倍效率为0-21.4％(Barnabas et al.,1999)。玉米单倍体自然加倍受环境和基因型的影响。Kleiber(2012)对温带玉米种质和热带玉米种质的单倍体自然加倍率进行了考察，结果发现温带骨干种质的单倍体自然加倍效率大于温带地方品种的单倍体自然加倍效率，早熟种质来源的单倍体自然加倍效率要高于晚熟品种，温室条件下单倍体自然加倍效率大于大田条件下单倍体自然加倍效率。玉米单倍体自然加倍又可以分为单倍体雄穗育性恢复和雌穗育性恢复。用来源于正常二倍体植株的花粉给单倍体雌穗授粉，单倍体雌穗育性恢复率能达到90％以上。而单倍体雄穗育性恢复率只有5-10％，远远低于单倍体雌穗育性恢复，因此，单倍体雄穗育性恢复情况是影响单倍体自然加倍的主要因素。
分子标记辅助技术可以利用分子标记对目标性状直接进行选择，提高育种效率，尤其是对复杂性状的选育，如抗病性和单倍体诱导率。分子标记辅助选择的基础是对性状的QTL定位及其过程中连锁标记的开发。例如，董昕等对单倍体诱导率相关QTL进行定位，并对第一条染色体位点qhir1进行精细定位，开发相关的分子标记进行诱导系的选育。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的引物对。
本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的引物对由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成。
本发明的第二个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的PCR试剂。
本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的PCR试剂包括上述引物对。
上述PCR试剂中，所述引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为5ng/ul。
本发明的第三个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的试剂盒。
本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的试剂盒包括上述引物对或上述PCR试剂。
本发明的第四个目的是提供上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下(1)-(5)中任一种中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状；
(2)制备鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的产品；
(3)选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体；
(4)制备选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体的产品；
(5)玉米育种。
本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的方法包括如下步骤：用上述引物对对待测玉米基因组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物确定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状：PCR扩增产物中仅含有大小为265bp片段的待测玉米单株的单倍体雄穗育性恢复能力高于或候选高于PCR扩增产物中仅含有大小为226bp片段的待测玉米单株的单倍体雄穗育性恢复能力。
上述方法中，所述待测玉米单株为由一个单倍体雄穗育性恢复能力高和一个单倍体雄穗育性恢复能力低的亲本杂交，得到杂交子代，将所述杂交子代与所述单倍体雄穗育性恢复能力低的亲本回交，得到回交后代，再以单倍体诱导系为父本，对所述回交后代进行诱导获得的单倍体。
上述方法中，所述单倍体雄穗育性恢复能力体现在花药外露率和/或花药得分。上述方法中，所述花药外露率是指单倍体的花药外露的比例，根据单倍体花药外露的比例从低到高，将花药外露率划分为如下0‐5六个等级：0级为不散；1级为5％以下的花药外露；2级为6‐20％的花药外露；3级为21‐50％的花药外露；4级为51‐75％的花药外露；5级为75％以上的花药外露。
所述花药得分取决于花药外露率的级别，花药外露率的级别为0级对应的花药得分为0分，花药外露率的级别为1级对应的花药得分为0.2分，花药外露率的级别为2级对应的花药得分为0.4分，花药外露率的级别为3级对应的花药得分为0.6分，花药外露率的级别为4级对应的花药得分为0.8分，花药外露率的级别为5级对应的花药得分为1分。
上述方法中，
所述回交的次数为2次。
上述方法中，
所述单倍体雄穗育性恢复能力高的亲本为豫87-1和4F1；
所述单倍体雄穗育性恢复能力低的亲本为郑58；
所述单倍体诱导系为诱导系CAU5。
本发明的最后一个目的是提供一种选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体的方法。
本发明提供的选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体包括如下步骤：培育上述PCR扩增产物中仅含有大小为265bp片段的玉米单倍体。
本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的方法及其专用引物，本发明通过对单倍体雄穗育性恢复相关QTL的定位，开发相关的连锁标记，利用该标记进行分子标记辅助育种。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的方法能直接在苗期鉴定出含有位于6号染色体主效QTL位点qhmf4的单株，选择出含有该QTL位点的单株，有助于提高玉米单倍体雄穗育性恢复率，促进玉米DH育种的利用。
附图说明
图1为豫87-1、4F1和郑58的琼脂糖电泳图。其中，1、2为豫87-1单株；3、4为4F1单株；5、6为郑58单株。
图2为F1单倍体群体的琼脂糖电泳图。其中，1-10为(郑58/豫87-1)单倍体单株；11为郑58单倍体单株；12为豫87-1单倍体单株。
图3为BC2群体单株的琼脂糖电泳图。其中，1-10为郑58回交郑58/豫87-1两代的BC2群体，11为郑58单株，12为豫87-1单株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的单倍体雄穗育性恢复率高的材料豫87-1，在文献“刘宗华,汤继华,陈伟程.(2002).玉米高配合力自交系豫自87-1的选育研究.作物杂志,5,48-49”中公开过，其单倍体花药外露率为89.21％，花药平均得分是0.84。公众可从中国农业大学获得。
下述实施例中的单倍体雄穗育性恢复率高的材料4F1，在文献“鲁宝良,赵文媛,刘日尊,关国志.(2004).Mo17衍生系组配杂交种对我国玉米生产的影响和贡献.玉米科学,12(1)”中公开过，其单倍体花药外露率为91.00％，花药平均得分是0.74。公众可从中国农业大学获得。
下述实施例中的单倍体雄穗育性恢复率低的材料郑58，在文献“王彦玲,卫文星,铁双贵,王延召,朱卫红,岳润清,齐建双.(2010).郑58和掖478玉米自交系基因组差异性分析.玉米科学,18(3),57-60”中公开过，其单倍体花药外露率为17.94％，花药平均得分是0.04。公众可从中国农业大学获得。
下述实施例中的高频单倍体诱导系CAU5，其平均诱导率为10％，具有R1-nj标记，在文献“陈绍江，黎亮，李浩川.玉米单倍体育种技术[M].中国农业大学出版社，2009.”中公开，公众可以从中国农业大学获得。
下述实施例中的Tris饱和酚、氯仿、酒精、异丙醇和琼脂糖均是北京吉普腾生物技术有限公司的产品。
下述实施例中的Buffer、dNTP和Taq E均是全式金有限公司的产品。
实施例1、分子标记的获得
一、玉米单倍体雄穗育性恢复QTL的定位
利用两个F1来源的玉米单倍体群体对单倍体雄穗育性恢复这一性状进行全基因组扫描，共检测到了4个控制单倍体雄穗育性恢复的QTL位点，其中位于第6染色体的QTL命名为qhmf4，该QTL是效应最大的QTL。
二、分子标记的获得
1、F1单倍体群体和BC2回交群体的发展
(1)以郑58为母本，豫87-1为父本(郑58/豫87-1)，同期播种于北京上庄实验站，散粉期将两个材料分别互相授粉，获得F1种子。同年冬天，将F1种子种于海南南繁公司基地，以诱导系CAU5为父本，对F1进行诱导，根据R1-nj颜色基因的表达挑选单倍体，胚乳为紫色但胚无紫色的籽粒为单倍体籽粒，获得F1单倍体群体(郑58/豫87-1)。并用郑58对F1进行回交，回交两次，获得BC2群体。
(2)以郑58为母本，4F1为父本(郑58/4F1)，同期播种于北京上庄实验站，散粉期将两个材料分别互相授粉获得F1种子。同年冬天，将F1种子种于海南南繁公司基地，以诱导系CAU5为父本，对F1进行诱导，根据R1-nj颜色基因的表达挑选单倍体，胚乳为紫色但胚无紫色的籽粒为单倍体籽粒，获得F1单倍体群体(郑58/4F1)。
2、分子标记的获得
根据QTL定位结果，下载该定位区间内B73参考序列，选取单拷贝序列，利用Primer3.0在线设计引物，经过多态性筛选及及连锁群验证后，选择一对差异性大、带型清晰的多态性引物(分子标记)F/R，将其命名为6-3。引物序列如下：
F:5’-TACAATCTGAAGCCCGTACAAAAT-3’(序列1)；
R:5’-GTTCCTGCTGCCTCGCTTCT-3’(序列2)。
F1单倍体分离群体群带型表明：该分子标记位于定位区间内，可以用于该位点的基因型检测。
3、分子标记检测亲本基因型
分别以豫87-1、郑58和4F1的基因组DNA为模板，采用引物6-3进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并对其进行测序。
电泳检测结果如图1所示。检测结果表明：引物6-3在单倍体雄穗育性恢复率高的亲本豫87-1和4F1中均仅扩增得到大小为265bp的条带(该位点来源于高亲豫87-1或者4F1)；而在单倍体雄穗育性恢复率低的亲本中仅扩增得到大小为226bp的条带(该位点来源于低亲郑58)。
三、分子标记在F1单倍体群体中的鉴定及验证
1、表型鉴定
2012年北京，在上庄试验站分别种植1000株以上郑58/豫87-1单倍体群体和1000株以上郑58/4F1单倍体群体。在单倍体散粉期，根据单倍体雄穗花药外露的比例分别鉴定郑58/豫87-1单倍体群体和郑58/4F1单倍体群体的单株的花药外露率的级别，并根据花药外露率的级别得出花药得分。鉴定方法如下：根据单倍体花药外露的比例从低到高，将花药外露率划分为如下0-5六个等级：0级为不散；1级为5％以下的花药外露；2级为6-20％的花药外露；3级为21-50％的花药外露；4级为51-75％的花药外露；5级为75％以上的花药外露。
最终在两个F1单倍体群体中，分别选取94株经鉴定散粉4-5级的单倍体和94株经鉴定不育(0级)的单倍体进行基因型鉴定。
2、基因型鉴定
(1)DNA提取
在苗期分别对94株经鉴定散粉4‐5级的单倍体和94株经鉴定不育(0级)的单倍体进行采样，剪取幼嫩叶片2cm，低温冷藏。采用改良的CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)方法(Stewart et al.1993)提取玉米基因组DNA。
(2)PCR扩增
以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，采用引物6-3进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。
配好体系后加入20ul石蜡油，进行PCR反应，分别得到PCR扩增产物。
PCR扩增反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环37次；72℃延伸10分钟，4℃保存。
(3)电泳
配制3％的琼脂糖凝胶，分别对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并测序验证，电压160V，电泳时间18min。
电泳结果如2所示。根据带型可以将F1单倍体群体分成两种基因型：PCR扩增产物仅含有大小为265bp的片段(该位点来源于高亲豫87-1或者4F1)的单株的基因型为有qhmf4型，并将PCR扩增产物仅含有大小为265bp的片段的单株命名为有qhmf4型自然恢复单株；PCR扩增产物仅含有大小为226bp的片段(该位点来源于低亲郑58)的单株的基因型为无qhmf4型，并将PCR扩增产物仅含有大小为226bp的片段的单株命名为无qhmf4型自然恢复单株。
在F1单倍体群体(郑58/豫87-1)中，散粉4-5级群体和不散粉群体中有qhmf4型自然恢复单株和无qhmf4型自然恢复单株的比率如表1所示。从表1中可以看出：在散粉4-5级群体中，有qhmf4型自然恢复单株出现的概率显著大于无qhmf4型自然恢复单株出现的概率；在不散粉群体中，有qhmf4型自然恢复单株出现的概率与无qhmf4型自然恢复单株出现的概率没有显著差异。在F1单倍体群体(郑58/4F1)中得到了同样的结果。以上结果说明该分子标记可以用于单倍体雄穗育性恢复的选择。
表1、F1单倍体群体中两种基因型的平均出现概率
注：不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。
实施例2、分子标记在BC2:3家系单倍体群体中的验证
一、BC2:3家系单株的获得
1、分别以实施例1中获得的BC2回交群体单株的基因组DNA为模板，采用引物6-3进行PCR扩增，得到PCR产物。各个单株的PCR产物的电泳检测结果如图3所示：根据带型将所有BC2单株分为如下两种基因型：PCR扩增产物仅含有大小为226bp的片段的单株(该位点来源于低亲郑58)，候选为无qhmf4型自然恢复单株；PCR扩增产物含有大小为265bp和226bp的片段的单株(该位点为杂合位点)，候选为杂合基因型自然恢复单株。
2、将BC2群体中的杂合基因型自然恢复单株与郑58进行回交，获得BC2:3家系。以诱导系CAU5作为父本，对BC2:3家系进行诱导，根据R1-nj颜色基因的表达挑选单倍体，胚乳为紫色但胚无紫色的籽粒为单倍体籽粒，分别获得如下BC2:3家系单倍体群体：BC2:3家系单倍体群体-1、BC2:3家系单倍体群体-2和BC2:3家系单倍体群体-3。
二、基因型鉴定
1、DNA提取
在苗期对BC2:3家系单倍体群体单株分别进行采样，剪取幼嫩叶片2cm，低温冷藏。采用改良的CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)方法(Stewart et al.1993)提取玉米基因组DNA。
2、PCR扩增
以步骤1获得的基因组DNA为模板，采用引物6-3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增体系和程序同实施例1中的步骤三。
3、电泳
配制3％的琼脂糖凝胶，对步骤2获得的PCR扩增产物进行电泳并测序验证，电压160V，电泳时间18min。
电泳结果表明：BC2:3家系单倍体群体单株共有如下两种基因型：有qhmf4型自然恢复单株和无qhmf4型自然恢复单株。其中，有qhmf4型自然恢复单株的PCR扩增产物仅含有大小为265bp的片段；无qhmf4型自然恢复单株的PCR扩增产物仅含有大小为226bp的片段。
三、表型鉴定
分别将上述BC2:3家系单倍体群体-1、BC2:3家系单倍体群体-2和BC2:3家系单倍体群体-3进行种植，两个重复，散粉期进行观察，并按照实施例1中的方法记录单倍体的花药外露级别。然后根据花药外露级别，按照如下方法得出每一家系内各单株的花药得分：花药外露率的级别为0级对应的花药得分为0分，花药外露率的级别为1级对应的花药得分为0.2分，花药外露率的级别为2级对应的花药得分为0.4分，花药外露率的级别为3级对应的花药得分为0.6分，花药外露率的级别为4级对应的花药得分为0.8分，花药外露率的级别为5级对应的花药得分为1分。最后计算每一家系的花药平均得分。
不同家系内不同基因型单倍体花药平均得分如表2所示：同一家系内有qhmf4型单倍体和无qhmf4型单倍体的雄穗花药外露平均得分存在显著差异，有qhmf4型的单倍体花药平均得分高于无qhmf4型的单倍体花药平均得分。基因型鉴定结果与表型鉴定结果一致，说明该分子标记可以用于单倍体雄穗育性恢复的选择。
表2、不同基因型对应单倍体群体的花药平均得分
注：同一BC2:3家系内，不同的字母代表在0.05水平差异显著，相同的字母代表在0.05水平差异不显著。

Claims (10)

1.用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的引物对，其由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成。
2.用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的PCR试剂，包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为5ng/ul。
4.用于鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的试剂盒，包括权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的PCR试剂。
5.权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在如下（1）-（4）中任一种中的应用：
（1）鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状；
（2）制备鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的产品；
（3）选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体；
（4）制备选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体的产品。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的引物对对待测玉米基因组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物确定待测玉米单倍体雄穗育性恢复性状：PCR扩增产物中仅含有大小为265bp片段的待测玉米单株的单倍体雄穗育性恢复能力高于或候选高于PCR扩增产物中仅含有大小为226bp片段的待测玉米单株的单倍体雄穗育性恢复能力。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述待测玉米单株为由一个单倍体雄穗育性恢复能力高的亲本和一个单倍体雄穗育性恢复能力低的亲本杂交得到杂交子代，将所述杂交子代与所述单倍体雄穗育性恢复能力低的亲本回交，得到回交后代，再以单倍体诱导系为父本，对所述回交后代进行诱导获得的单倍体；
所述单倍体雄穗育性恢复能力体现在花药外露率和／或花药得分。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述回交的次数为2次。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：
所述单倍体雄穗育性恢复能力高的亲本为豫87-1或4F1；
所述单倍体雄穗育性恢复能力低的亲本为郑58；
所述单倍体诱导系为诱导系CAU5。
10.一种选育单倍体雄穗育性恢复能力高的玉米单倍体的方法，包括如下步骤：培育权利要求6中所述的PCR扩增产物中仅含有大小为265bp片段的玉米单倍体。
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