KR101871806B1 - 유채의 웅성불임성 회복 유전자형 판별용 마커 및 이를 이용한 판별방법 - Google Patents

유채의 웅성불임성 회복 유전자형 판별용 마커 및 이를 이용한 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유채 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS 및 이를 이용한 회복유전자의 유전자형 판별 방법과 이의 회복인자 계통 육성방법을 제공한다.

Description

유채의 웅성불임성 회복 유전자형 판별용 마커 및 이를 이용한 판별방법{Markers for discriminating genotyping restorer gene involved in male sterility of Brassica napus and discriminating method using the same}
본 발명은 유채의 웅성불임성 회복 유전자형 판별용 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 유채의 웅성불임성 회복 유전자형 판별용 마커 및 이를 이용한 판별방법에 관한 것이다.
웅성불임성(male sterility)을 이용한 품종개발은 십자화과(Brassicaceae)에서는 배추나 양배추에서 먼저 개발되어 오랫동안 되어져 왔고, 최근 유채와 갓 등 다른 작물에서도 많이 이용되고 있고 유채의 일대 잡종 종자 생산에는 주로 웅성불임성이 이용된다. 웅성불임이란 웅성기관의 이상으로 정상적인 화분이 만들어지지 않아 종자가 형성되지 않는 현상으로 핵 내 유전자에 의한 웅성불임성(genetic male sterility, GMS)은 열성 유전으로 열성 동형인 경우에 불임으로 나타나기 때문에, 50%만의 불임주를 얻을 수 있어, F1 개체의 임성을 확인하기 위해서는 반드시 각 개체들을 개화시켜 화분의 생성 유무를 확인해야 하는 과정이 필요하고 웅성불임계의 유지 및 증식에도 많은 노력이 소요된다. 한편, 세포질 인자에 의한 웅성 불임성은 세포질 웅성불임성(cytoplasmic male sterility, CMS)이라고 하는데, 이는 모계 유전되며 어느 가임계를 교배해도 100% 불임주가 수득되기 때문에, 웅성불임계의 유지가 매우 쉽고 잎, 줄기 등 영양기관을 이용하는 작물에 적용하기 매우 편리하다. CMS를 가지는 계통으로는 무 속(Raphanus sp.)에서는 오구라(Ogura), 코세나(Kosena) 등이 알려져 있으며, 이들 계통들은 모두 세포질 내의 미토콘드리아 유전자의 구조적 변형 또는 새로운 ORF(open reading frame)의 생성으로 인해 CMS를 일으키는 것으로 알려져 있다. 오구라 웅성불임의 원인은 세포질의 orf138 유전자에 의한 것이며, 핵내 웅성회복 유전자인 Rf와 일부 유전자에 의해서도 웅성불임성의 발현이 조절된다고 알려져 있다(Nieuwhof, Euphytica, Volume 47, Issue 2, pp 171??177, 1990). 또한, 무에서 웅성불임 회복유전자는 Rfo로 밝혀져 있으며, orf138의 기능을 억제하여 웅성불임을 회복하는 것으로 예상하고 있다(Desloire et al., EMBO reports, 4, 588-594, 2003). 무의 웅성불임 회복유전자 Rfo는 PPR(pentatricopeptide repeat) 도메인을 가진 단백질을 만드는 것으로 알려져 있다. PPR 유전자는 최근 애기장대의 염기서열이 완전히 해독되면서 알려진 유전자로서, 식물에서 이렇게 거대한 조직임에도 불구하고, PPR 유전자 군의 역할은 세포질과 핵 유전자간의 상호작용 관여하는 것으로 추정될 뿐 정확한 역할은 아직 알려진 바가 없다. 중국에서 F1을 생산하는 데에 가장 많이 이용되고 있는 CMS는 폴리마 CMS이고 atp6의 상류에 있는 orf224와 연관되어 있다. orf224와 atp6의 발현으로 웅성불임성이 조절이 되며, 이러한 웅성불임 회복을 조절하는 유전자가 Rfp로 밝혀져 있다(Singh and Brown., Plant Cell, 3:1349-1362. 1991).
한편, 식물 육종에 있어서 환경에 영향을 많이 받는 형태적 형질보다는 DNA 염기서열 수준에서 형질의 변이를 알 수 있는 분자 표지에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다. 그 이유는 식물체의 어린 유묘기에 DNA를 추출함으로써 세대 진전이나 포장 재배 등의 노동력을 감소시켜 조기선발이 가능하기 때문이다. 따라서 원예작물의 육종 효율 증진을 위해 전통육종과 상호보완적인 MAS(Marker-assisted selection) 기술이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 특히 유채의 웅성불임을 이용한 품종 육성의 경우 다양한 웅성불임 유지친과 회복친의 육성이 필요한데 육종 과정이 매우 복잡하여 우수한 유지친과 회복친을 확보하는데 오랜 기간과 많은 교배 노력이 소요된다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 웅성불임성 회복 유전자형을 판별하는 절차가 복잡하고 판별효율도 낮은 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 유채의 웅성불임성 회복과 관련된 유전자형을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 유전자 마커 및 상기 유전자 마커를 이용한 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형 및 표현형 판정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 77로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 78로 기재되는 핵산서열을 구성되는 역방향 프라이머를 포함하는 유채 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형 판별용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 유채로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 제1항의 키트로 PCR을 수행하는 DNA 증폭단계; 상기 증폭된 DNA 단편을 제한효소 EcoRⅤ로 절단하는 제한효소 처리단계; 및 상기 제한효소 처리단계의 반응물을 전기영동하여 밴드패턴을 확인하는 전기영동 단계를 포함하는, 유채의 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형 판별방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 유전자 마커를 이용하여 유채의 웅성불임성 회복에 관여하는 유전자형을 신속하고 정확하게 판별하여 효율적인 유채 육종 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 유채 웅성불임 회복인자의 유전자형을 판별하기 위한 유전자 마커의 개발을 위해 CAPS에 제한효소 처리함으로써 유전자형을 판별하는 개요도이다.
도 2는 DC2 가임 식물체와 DC2 웅성불임 식물체의 사진이다.
도 3은 Rfp 유전자형에 따른 제한효소 절단 산물의 패턴을 나타내는 겔 사진이다.
도 4는 NA227 유래 유전집단 3계통 42개체 Rfp 유전자형 분석 결과를 나타내는 겔 사진이다.
도 5는 DM4 유래 유전집단 3계통 42개체 Rfp 유전자형 분석 결과를 나타내는 겔 사진이다.
도 6은 유채 회복유전자형 RfpRfp인 회복계통인 'DC2'와 대조품종인 유지계통 '다올1'의 생육특성을 나타내는 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "웅성불임(male sterility)"은 식물의 웅성기관에 이상이 있어서 수분, 수정, 종자 형성이 이루어지지 않고 불임으로 되는 경우를 말하는 것으로 웅성불임의 원인은 환경불량이나 질병에 의한 경우와 유전적인 경우가 있으나 육종학에서는 유전적 원인에 의한 것을 웅성불임이라고 한다. 유전적 웅성불임에는 1)핵 내의 유전자에 지배되는 것(핵유전자형), 2)세포질 유전자(plasma gene)에 지배되는 것(세포질형), 3)세포질 유전자와 핵내 유전자가 공동으로 작용하는 것(세포질-핵유전자형)의 세 가지 유형이 있는데 잡종 1대(하이브리드종)의 육종에 사용되는 것은 2)의 유형이며 이것을 단순히 유전적 웅성불임이라고도 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "유채(rapeseed)"는 중국 원산의 두해살이풀로 키는 1 m 정도이다. 원줄기에서는 15개 안팎의 1차 곁가지가 나오고, 이 가지에서 다시 2∼4개의 2차 곁가지가 나온다. 줄기에 달린 잎은 잎자루가 있으며 다소 깃처럼 갈라진다. 잎자루의 가장자리에는 이 모양의 톱니가 있으며 표면은 진한 녹색, 뒷면은 흰빛이 돈다. 유채의 종자에는 38∼45%의 기름이 들어 있는데, 15∼20%의 가용성 질소질과 20% 가량의 단백질이 들어 있는 식용유로서 콩기름 다음으로 많이 소비하고 있으며, 탈지 유채박은 사료나 비료로 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "절단 증폭 다형성 시퀀스(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)"는 유전자 마커 분석을 위한 분자 생물학 기술로 PCR (polymerase chain reaction)을 사용하여 결과를 보다 신속하게 분석하기 위해 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 방법을 확장한 것이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "핵유전자 웅성불임성(genic male sterility, GMS)"은 웅성불임성이 핵내 유전자에 의해 지배되는 경우이다. 웅성불임성은 생존에 불리하게 작용하기 때문에 발견되는 것은 주로 열성유전을 하며 열성동형(homozygously recessive)인 경우에 불임성을 띠게 된다. 웅성불임인자는 Ms로 표시한다. 따라서 msms는 불임, Msms와 MsMs 는 가임이 된다. 불임주의 유지 증식은 불임주, msms에 이형(heterozygous) 상태인 Msms주의 화분을 교배하여 50%의 불임주를 얻는다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포질 웅성불임성(cytoplasmic male sterility, CMS)"은 웅성불임성이 세포질에 의해 일어나는 경우이다. 세포질에 있는 미토콘드리아에 들어 있는 유전물질에 의한 것으로 추정되고 있으며, 모계유전(maternal inheritance)을 한다. 세포질 웅성불임계에는 어느 가임계를 교배해도 100% 불임주가 나온다. 이 경우 웅성불임계의 유지는 매우 쉬우며, 잎, 줄기 등 영양기관을 이용하는 작물에는 이용하기에 편리하다. 그러나 재배목적이 생식기관, 즉 과실이나 종자를 이용할 목적으로 재배하는 작물에서는 이용에 곤란하다. 어느 것을 교배해도 불임주가 나오기 때문에 농가에 보급하게 될 일대잡종도 불임계가 되게 된다. 그러면 농가에서는 화분을 공급할 수 있는 수분주(授粉株)를 심어주어야 하는데 이것은 현실성이 없다. 세포질 웅성불임성의 실용성을 높이는데는 세포질 웅성불임성을 회복시킬 수 있는 핵내의 회복유전자를 찾는 것이다. 회복인자를 찾은 경우를 세포질핵유전형 웅성불임성(cytoplasmic genic male sterility)이라고 한다. 세포질핵유전형 웅성불임성은 고추, 양파, 당근 등에 이용되고 있으며 회복유전자는 단일우성유전자로 알려져 있다. 이 경우 웅성불임 세포질을 S, 핵내 회복인자를 Rf라고 하면 SRfRf, SRfrf 상태는 가임이 되고, Srfrf에서는 불임이 된다. 웅성불임계를 유지하기 위해서는 세포질웅성불임계(A-line)에 정상의 세포질을 가져서 가임이지만 회복인자는 갖지 않는 유지계(maintainer, B-line)를 교배하여 100%의 웅성불임주를 생산한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 77로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 78로 기재되는 핵산서열을 구성되는 역방향 프라이머를 포함하는 유채 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형 판별용 키트가 제공된다.
상기 판별용 키트에 있어서, 제한효소 EcoRⅤ를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 유채로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 제1항의 키트로 PCR을 수행하는 DNA 증폭단계; 상기 증폭된 DNA 단편을 제한효소 EcoRⅤ으로 절단하는 제한효소 처리단계; 및 상기 제한효소 처리단계의 반응물을 전기영동하여 밴드패턴을 확인하는 전기영동 단계를 포함하는, 유채의 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형 판별방법이 제공된다.
상기 판별방법에 있어서, 1,385 bp의 밴드만 확인될 경우 유전자형이 Rfp/Rfp인 것으로 결정하고, 268 bp, 1,117 bp 및 1,385 bp의 세 개의 밴드가 확인될 경우 유전자형이 Rfp/rfp인 것으로 결정하며, 268 bp 및 1,117 bp의 두 개의 밴드만 확인될 경우 유전자형이 rfp/rfp인 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로 품종 육성에서 웅성불임(male sterility)이란 웅성기관의 이상으로 정상적인 화분이 만들어지지 않아 종자가 형성되지 않는 현상을 말하는데 일반적으로 유전적인 원인으로 인한 웅성기관의 결함을 의미한다. 꽃에 암술과 수술이 함께 있는 자가생식성 식물(자가수분하는 식물)에서는 다른 품종의 화분이 수분되기 어렵고 잡종강세를 이용하는 잡종 1대를 육성하기 어려우나 세포질 웅성 불임을 사용하면 이것이 가능해진다. 육종에 이용할 수 있는 웅성불임을 만들려면 웅성불임 계통을 발견하여 이용하거나 종속간의 교잡에 의하거나 돌연변이 유기 물질에 의한 화학 물질(웅성 불임화제)을 사용하는 등의 방법이 있다. 화분의 불임이 일어나는 유전적 원인에는 염색체에 이상이 생겨 화분 모세포의 감수분열에 혼란이 일어나는 경우와 핵내 유전자나 세포질 인자의 돌연변이에 의해 화분 모세포를 둘러싸는 타페트 세포(tapetal cell)에 이상이 일어나서 화분이 성숙 도중에 파괴되는 경우가 있다. 전자의 경우에는 암술 등의 자성 기관에도 이상이 나타나지만, 후자의 경우에는 화분만 불임이 되고 자성 기관은 수정 능력을 가지고 있게 된다. 따라서, 자성 기관만 정상적인 수정 능력을 가지고 있는 계통을 교배모본으로 사용하면, 인공 교배에서 화분을 제거하는 제웅 작업을 거칠 필요가 없기 때문에, 잡종 종자를 개량 육성하는 잡종 강세 육종법에서의 F1 채종에 많이 이용되고 있다. 그러나 유채의 웅성불임을 품종 육성에 이용하는 경우 육종과정이 복잡하여 유지친과 회복친을 확보하는데 많은 어려움이 있다.
이에 본 발명자들은 유채 개체의 웅성불임성 회복 여부를 DNA 수준에서 쉽고 간편하게 판별할 수 있는 방법을 연구하던 중, 유채의 웅성불임성 회복에 관여하는 회복유전자 Rfp에 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)가 있으며, 이를 이용함으로써 회복유전자 Rfp의 유전자형을 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 유채 개체의 웅성불임성 회복 여부를 판단하는데 이용할 수 있음을 인지하였고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다(도 1). 본 발명에서는 유채 웅성불임성을 이용한 일대잡종 육성에 사용하는 불임친과 회복친을 포함하는 웅성불임계와 가임계 등 42점을 대상으로 웅성불임성을 조사한 후 'A Mitochondria-Targeted PPR Protein Restores polima Cytoplasmic Male Sterility by Reducing orf224 Transcript Levels in Oilseed Rape' 논문에서의 웅성불임 회복 유전자 다형성 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 유채 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 식물재료
본 발명자는 중국에서 도입된 유채 유전자원 중 'NA227'라 명명된 도입종으로부터 웅성불임 유채 식물체와 가임 유채 식물체를 분리하였다. 상기 도입종 NA227에서 분리된 웅성불임 개체(1001-1)와 가임 개체(1001-6, 1003-6)의 교배로 F1을 육성하여 임성조사를 실시한 결과 가임주 대 불임주의 분리비가 1:1로 확인되었다(파종번호 58, 60). 이는 가임개체 1001-6 및 1003-6이 보유한 회복유전자의 유전자형이'Rfp/rfp'형임을 판단할 수 있다. 상기 파종번호 58, 60의 후대 중 가임개체를 자가수정하여 얻은 3개의 집단(파종번호 75, 77, 79)을 임성조사한 결과 가임주 대 불임주의 분리비가 3:1로 확인되었으며, 후대에서의 웅성불임 표현형 조사를 실시함으로써 파종번호 75, 77, 79의 각 식물체의 유전자형을 Rfp/Rfp, rfp/rfp, Rfp/rfp로 판단하였다(도 2). 상기'NA227'의 웅성불임 관련 분리비 조사 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
순번 파종번호 계통명 개체수 가임주 불임주 분리비 (가임주:불임주)
1 58 1001-1(ms) x 1001-6(mf) 16 7 9 1:1
2 60 1001-1(ms) x 1003-6(mf) 24 10 14 1:1
3 75 {1001-1(ms) x 1001-6(mf)}-6 ⓧ 19 15 4 3:1
4 77 {1001-1(ms) x 1003-6(mf)}-16 ⓧ 16 13 3 3:1
5 79 {1001-1(ms) x 1003-6(mf)}-14 ⓧ 24 18 6 3:1
실시예 2: 식물체 DNA 추출
상기 실시예 1의 식물재료 각 개체들의 잎 50 mg에 CTAB 버퍼[2%(w/v) 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide), 1.4 M 염화나트륨, 30 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1%(w/v) PVP, 0.2%(v/v) 머캅토에탄올(mercaptoethanol)] 750 ㎕에 첨가하고 각각 마쇄한 후, 65℃에서 1시간 배양하였다. 그 후, 클로로포름:이소아밀알콜(24:1) 용액을 750 ㎕ 첨가하여 잘 섞은 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액 500 ㎕를 취하였다. 여기에 1/10 양만큼의 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 2배 양만큼의 100% 에탄올을 넣어 DNA를 침전시켰고, 10분 원심분리 하여 용액을 버리고 펠렛을 70% 에탄올로 세척한 후 RNase가 포함된 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)에 녹여 DNA를 분리하였다.
실시예 3: 프라이머 제작
본 발명자들은 폴리마 세포질 웅성불임성 회복에 관여하는 유전자의 유전자형을 판별하기 위한 특이적 마커 개발을 위해 프라이머를 제작하였다. 먼저, 유채 도입종 NA227이 폴리마 세포질 웅성불임성이라는 결과를 토대로 NCBI 검색엔진(www.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 기존에 보고된 유채의 웅성불임 회복 유전자를 확보하였다. 검색방법으로는 유전자명 polima CMS, orf224, orf138, atp8, atp6 을 검색어로 선정하였고 수집된 각각의 유전자 가운데, 배추과 식물인 유채의 염기서열을 선발하여 이들 염기서열의 특이적인 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 제작한 프라이머 세트의 정보를 하기 표 2 및 3에 나타내었다.
순번 프라이머 명 염기서열 (5'→3') 서열번호
1
 SCP4-F GGCTAATGGATGTCAACCCA 1
SCP4-R CTTCATCTAAGCGCTTGTCG 2
2
 SCP4-M1-F GCGAGCAAGAAACGTGCGTC 3
SCP4-M1-R GGGGGAAGAGAAGAGAAGCC 4
3
 SCP4-M2-F GTCTTGCCTCTTTGGGAGGG 5
SCP4-M2-R CCACCTCAGCTTTCTAGCAG 6
4
 Os20-F CGCTAAACAGCGACTCCAAT 7
Os20-R TGCAAATAAATCTTGTACCACCA 8
5
 Os31-F GCAGTCTAGGGCTGATGAGG 9
Os31-R CTGCTCCCCAGTTATCAACC 10
6
 Os36-F AAGCCCTAAGCCTTCATCGT 11
Os36-R CGGTGCTCAAGAAACGATCT 12
7
 Brs06-F ATATGGAGAGTGCCGCTACG 13
Brs06-R TGTCATTGGCTTCTGCTGTC 14
8
 BrIP14-F TGCTCCAACATTGCTTTCTG 15
BrIP14-R TTCCTGCCGATCCTACCG 16
9
 BrIP30-F GGAATGAGATGTGTGTGGCAG 17
BrIP30-R TTACCAAGTTTTGTCATCATCCA 18
10
 BrIP33-F AATCATTTGGCGATTTCCAC 19
BrIP33-R TTAGCTTCGGCTCATTGTCAT 20
11
 BrIP35-F ATCACTCCCGCCGATAGAAT 21
BrIP35-R GTGAACCCGTCTATCATCGTG 22
12
 BrIP43-F TTCCTCTCCACTCCAACAAGC 23
BrIP43-R TGACCTTGCGAGTTCCATCT 24
13
 BrIP53-F CGTTTGGACAAGTTTTCACG 25
BrIP53-R CTTTGAACTATTGCCGGTGA 26
14
 BrSC08-F ACTTGGTTTGGTGCTATCGT 27
BrSC08-R GCTGAATCGTCTGCTCCCT 28
15
 BrSC15-F TAGCCGATTGAATGACAGCA 29
BrSC15-R GTCTAAGCAAAACCTGCCACT 30
16
 BrSC47-F CTCTCCTCACTTCTCCGATT 31
BrSC47-R AAATCATTCCTTTCCTACGG 32
17
 BrSC08-M1-F CCTCCCTCACTGATAGGTTC 33
BrSC08-M1-R ACTTCCCGAGGCTTTGCATC 34
18
 BrSC15-M1-F CGCACCCATGCGTTGCATAA 35
BrSC15-M1-R CGTCAGCGTTTTCAACGAGC 36
19
 BnRf-M1-S1-F GTGGTGTTGGTGAATGGTGA 37
BnRf-M1-S1-R CACCTCCAAAGACCTTGATC 38
순번 프라이머 명 염기서열 (5'→3') 서열번호
20
 BrIP53-M1-F GCGTCGCGTAGGAAAGTAAC 39
BrIP53-M1-R AGTGTGGGAAAGTGACAAGG 40
21
 orf224-1F TCTTCCAAAGCCCATACGAC 41
orf224-1R CACTGAAAGTGACAACGTTG 42
22
 orf224-2F GATGATGGTGCACAGTTGCT 43
orf224-2R TCCAAAAGGACCAGAAAGCA 44
23
 orf224-s1F AGATAGAGTGTCTGAAGCAG 45
orf224-s1R GATCCAAGGCCGAGGCAGTG 46
24
 orf224-s2F GATGAAGCCAACCAGATGAT 47
orf224-s2R CCTCTCAGAGACATCTTTCG 48
25
 orf224-s3F GCACAAGTGTAAGATGGAAC 49
orf224-s3R TGAATATCACGCTTCACTCC 50
26
 orf224-snp1-F GAGATTGGTTCATCTCCGT 51
orf224-snp1-R GCTGGTGAGACCAGAGAAGC 52
27
 orf224-snp2-F AGAGAGATTGAGAAGTGGAC 53
orf224-snp2-R GAAGAGGACGAGACCGAAGC 54
28
 orf224-snp3-F GCAGAGTCTTTGAAGCTGTG 55
orf224-snp3-R GCCCATTGACAATAGTGTTG 56
29
 orf224-snp4-F CTCAGGAAGATGGAACATAG 57
orf224-snp4-R GAGTGCATCGTCGAGTCTCC 58
30
 orf224-snp5-F GGCTAAACAGGTTGATGATG 59
orf224-snp5-R GACAAAACCCTTGGATGAGA 60
31
 orf224-snp6-F AGAGATGGTCTCTCAAGGTG 61
orf224-snp6-R GATCAAGTATTCCCAAAGCC 62
32
 orf224-snp3-F GCAGAGTCTTTGAAGCTGTG 63
orf224-snp6-R GATCAAGTATTCCCAAAGCC 64
33
 orf224-s1F AGATAGAGTGTCTGAAGCAG 65
orf224-snp5-R GACAAAACCCTTGGATGAGA 66
34
 orf224-snp4-F CTCAGGAAGATGGAACATAG 67
orf224-snp5-R GACAAAACCCTTGGATGAGA 68
35
 orf224-snp4-F CTCAGGAAGATGGAACATAG 69
orf224-snp6-R GATCAAGTATTCCCAAAGCC 70
36
 orf224-s1F AGATAGAGTGTCTGAAGCAG 71
orf224-snp6-R GATCAAGTATTCCCAAAGCC 72
37
 orf224-1F TCTTCCAAAGCCCATACGAC 73
orf224-snp5-R GACAAAACCCTTGGATGAGA 74
38
 orf224-s1F AGATAGAGTGTCTGAAGCAG 75
orf224-snp5-R GACAAAACCCTTGGATGAGA 76
39
 orf224-1F TCTTCCAAAGCCCATACGAC 77
orf224-snp6-R GATCAAGTATTCCCAAAGCC 78
40
 orf224-s1F AGATAGAGTGTCTGAAGCAG 79
orf224-snp6-R GATCAAGTATTCCCAAAGCC 80
실시예 4: PCR 증폭
상기 실시예 3에서 제작된 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 1의 유채 도입종 NA227 유래 유전집단을 분석한 결과, 폴리마 세포질 웅성불임성 회복 유전자의 유전자형을 판별할 수 있는 특이적 마커를 개발하였다.
구체적으로, PCR 반응 조성물은 주형 DNA 50 ng, 10×PCR 완충액(1.5 mM MgCl2 포함), 25 mM MgCl₂, dNTPs 200 μM, taq DNA 중합효소 1 Unit, 100 pM 프라이머 0.1 ㎕를 혼합하여 증류수(D.W.)로 총 부피를 25 ㎕로 조정하였다. 그 후, PCR 반응액을 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 61℃에서 30초, 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 총 35회 반복 실시하였고, 72℃에서 10분간 반응시켜 합성하였다. 상기 반응산물들을 제한효소 EcoRⅤ로 37℃에서 1시간 처리한 후 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.
그 결과, 상기 제작한 총 40개의 프라이머 세트 중 유채 도입종 NA227 유래 유전집단의 표현형과 분석결과가 일치하는 39번 프라이머 세트를 선발하였고(도 3) Rfp 유전자형에 따른 제한효소 절단 산물의 크기를 하기 표 4에 나타내었다.
Rfp 유전자형
 제한효소 절단시 절단 산물의 크기(bp)
제한효소(EcoRⅤ)
동형접합체
 Rfp/Rfp 1385
rfp/rfp 1117, 268
이형접합체 Rfp/rfp 1385, 1117, 268
실시예 5: 개발 마커의 유용성 검정
5-1: 동일 도입종 유래 집단에서의 유용성 검정
동일 도입종에 대한 본 발명의 유전자 마커의 검정을 위하여 웅성불임성 회복 유전자형 식별용 CAPS 마커를 이용하여 도입종 NA227 유래 유전집단 3계통 42개체의 Rfp 유전자형을 분석하였다.
그 결과, 표현형(phenotype) 조사 결과와 일치하는 것을 확인하였고(도 4) NA227 유래 유전집단 3계통 42개체 Rfp 유전자형의 분석 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Rfp 유전자형 개체 수
동형접합체 Rfp/Rfp 8
rfp/rfp 10
이형접합체 Rfp/rfp 24
5-2: 다른 도입종 유래 집단에서의 유용성 검정
다른 도입종에 대한 본 발명의 유전자 마커의 검정을 위하여 상기 개발된 웅성불임 회복 유전자형 식별용 CAPS 마커를 이용하여 캐나다에서 도입된 유채 유전자원 중 하나인 'DM4' 유래의 임성 분리집단 3계통 42개체의 Rfp 유전자형을 분석하였다.
그 결과, 표현형(phenotype) 조사 결과와 일치하는 것을 확인하였고(도 5), DM4 유래 유전집단 3계통 42개체 Rfp 유전자형의 분석 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 상기 결과는 본 발명의 CAPS 마커가 NA227 유래의 웅성불임성 회복 여부의 판별뿐만 아니라 다른 계통의 웅성불임성 회복 여부를 판별하는데도 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
Rfp 유전자형 개체 수
동형접합체
 Rfp/Rfp 9
rfp/rfp 13
이형접합체 Rfp/rfp 20
실시예 6: 유채 회복유전자형 RfpRfp 인 회복계통 식물체 육성
상기 실시예 1의 유채 도입종 NA227 유래 유전집단의 후대를 분자마커를 이용하여 지속적으로 선발육성하여 회복유전자형이 Rfp/Rfp이고 다른 원예적 형질도 고정된 신규한 회복계통을 육성하여 'DC2'로 명명하였다(표 7참조). 또한 유채의 폴리마 세포질 웅성불임성을 회복시키는 회복계통 'DC2'와 대조품종인 유지계통 '다올1'의 생육특성을 비교하였다. 상기 선발육성을 위한 육성 모식도를 하기 표 7에 나타내었다.
년도 2014 2015 2016 2017
세대 인공교배 교잡후대(F1) F₂ F₃
DC2 MS(1001-1)
X
DC2 MF(1001-6)		 7:9(MF:MS) 15:4(MF:MS) 4계통 선발
DC2 MS(1001-3)
X
DC2 MF(1001-6)		 10:14(MF:MS) 13:3(MF:MS) 3계통 선발
18:8(MF:MS) 1계통 선발
육성계통수 2 3 8
비 고 교배조합작성 가임(MF)개체 selfing 가임(MF)개체 selfing Rfp/Rfp로 확인된 집단 육성
그 결과, 회복계통 'DC2'가 추대 및 개화가 빠르며, 강한 춘파성을 가지고 있다. 또한 초장이 길고, 협의 길이가 긴 특성을 나타내었다. 반면에 대조품종 '다올1'은 마커 분석 결과 rfp/rfp로 확인되었다(도 6). 따라서 상기 신규한 회복계통'DC2'는 폴리마 세포질 웅성불임성을 이용한 춘파성 유채 잡종종자 생산의 회복계통으로 활용도가 높을 것으로 사료된다. 본 발명의 회복계통 'DC2'와 대조품종인 유지계통 '다올1'의 생육특성 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
번호 특성 표현형태 계급 DC2 대조품종 (다올1)
계급치 실측치 계급치 실측치
1 Rfp 유전자형 Rfp/rfp Rfp rfp
2 잎: 가장자리의 톱니
(Leaf: indentation of margin)		 없다
적다
중간
많다		 1
3
5
7		 5 3
3 잎: 열편
(Leaf: development of lobes)		 없다(원형)
없다(장란형)
약하다
중간
강하다		 1
2
3
5
7		 5 3
4 개화기
(Flower times)		 이르다
중간
늦다		 3
5
7		 3 5
5 약(葯): 얼룩
(Anther: dotting)		 없다
있다		 1
9		 1 1
6 협: 길이
(Silique length)		 짧다
중간
길다		 3
5
7		 3.2 cm 2.4 cm
7 식물체: 키
(Plant height)		 짧다
중간
길다		 3
5
7		 182 cm 150 cm
8 성숙기
(Maturing times)		 빠르다
중간
느리다		 3
5
7		 3 5
9 식물체: 형
(Plant type)		 1형
2형
3형
4형		 1
3
5
7		 2형 2형
10 춘파성
(Spring growing
habit)		 매우 약하다
약하다
중간
강하다
아주 강하다		 1
3
5
7
9		 9 7
결론적으로, 본 발명의 유전자 마커는 유채 웅성불임 회복에 관여하는 유전자를 판별할 수 있는 분자표지 CAPS를 이용하여 유채 일대 잡종 품종 육성 과정에서 해당 웅성불임 회복유전자 분석을 통해 웅성불임 유지 계통 및 회복 계통의 육성 효율을 증진시키고, 유채 일대 잡종 육성 효율을 높이는데 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> FNP, Inc. <120> Markers for discriminating genotyping restorer gene involved in male sterility of Brassica napus and discriminating method using the same <130> PD16-5409 <160> 80 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP4-F <400> 1 ggctaatgga tgtcaaccca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP4-R <400> 2 cttcatctaa gcgcttgtcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP4-M1-F <400> 3 gcgagcaaga aacgtgcgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP4-M1-R <400> 4 gggggaagag aagagaagcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP4-M2-F <400> 5 gtcttgcctc tttgggaggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCP4-M2-R <400> 6 ccacctcagc tttctagcag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os20-F <400> 7 cgctaaacag cgactccaat 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os20-R <400> 8 tgcaaataaa tcttgtacca cca 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os31-F <400> 9 gcagtctagg gctgatgagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os31-R <400> 10 ctgctcccca gttatcaacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os36-F <400> 11 aagccctaag ccttcatcgt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os36-R <400> 12 cggtgctcaa gaaacgatct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brs06-F <400> 13 atatggagag tgccgctacg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brs06-R <400> 14 tgtcattggc ttctgctgtc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP14-F <400> 15 tgctccaaca ttgctttctg 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP14-R <400> 16 ttcctgccga tcctaccg 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP30-F <400> 17 ggaatgagat gtgtgtggca g 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP30-R <400> 18 ttaccaagtt ttgtcatcat cca 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP33-F <400> 19 aatcatttgg cgatttccac 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP33-R <400> 20 ttagcttcgg ctcattgtca t 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP35-F <400> 21 atcactcccg ccgatagaat 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP35-R <400> 22 gtgaacccgt ctatcatcgt g 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP43-F <400> 23 ttcctctcca ctccaacaag c 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP43-R <400> 24 tgaccttgcg agttccatct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP53-F <400> 25 cgtttggaca agttttcacg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP53-R <400> 26 ctttgaacta ttgccggtga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC08-F <400> 27 acttggtttg gtgctatcgt 20 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC08-R <400> 28 gctgaatcgt ctgctccct 19 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC15-F <400> 29 tagccgattg aatgacagca 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC15-R <400> 30 gtctaagcaa aacctgccac t 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC47-F <400> 31 ctctcctcac ttctccgatt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC47-R <400> 32 aaatcattcc tttcctacgg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC08-M1-F <400> 33 cctccctcac tgataggttc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC08-M1-R <400> 34 acttcccgag gctttgcatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC15-M1-F <400> 35 cgcacccatg cgttgcataa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrSC15-M1-R <400> 36 cgtcagcgtt ttcaacgagc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BnRf-M1-S1-F <400> 37 gtggtgttgg tgaatggtga 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BnRf-M1-S1-R <400> 38 cacctccaaa gaccttgatc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP53-M1-F <400> 39 gcgtcgcgta ggaaagtaac 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BrIP53-M1-R <400> 40 agtgtgggaa agtgacaagg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-1F <400> 41 tcttccaaag cccatacgac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-1R <400> 42 cactgaaagt gacaacgttg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-2F <400> 43 gatgatggtg cacagttgct 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-2R <400> 44 tccaaaagga ccagaaagca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s1F <400> 45 agatagagtg tctgaagcag 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s1R <400> 46 gatccaaggc cgaggcagtg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s2F <400> 47 gatgaagcca accagatgat 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s2R <400> 48 cctctcagag acatctttcg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s3F <400> 49 gcacaagtgt aagatggaac 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s3R <400> 50 tgaatatcac gcttcactcc 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp1-F <400> 51 gagattggtt catctccgt 19 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp1-R <400> 52 gctggtgaga ccagagaagc 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp2-F <400> 53 agagagattg agaagtggac 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp2-R <400> 54 gaagaggacg agaccgaagc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp3-F <400> 55 gcagagtctt tgaagctgtg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp3-R <400> 56 gcccattgac aatagtgttg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp4-F <400> 57 ctcaggaaga tggaacatag 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp4-R <400> 58 gagtgcatcg tcgagtctcc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp5-F <400> 59 ggctaaacag gttgatgatg 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp5-R <400> 60 gacaaaaccc ttggatgaga 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp6-F <400> 61 agagatggtc tctcaaggtg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp6-R <400> 62 gatcaagtat tcccaaagcc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp3-F <400> 63 gcagagtctt tgaagctgtg 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp3-R <400> 64 gatcaagtat tcccaaagcc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s1F <400> 65 agatagagtg tctgaagcag 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp5-R <400> 66 gacaaaaccc ttggatgaga 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp4-F <400> 67 ctcaggaaga tggaacatag 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp5-R <400> 68 gacaaaaccc ttggatgaga 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp4-F <400> 69 ctcaggaaga tggaacatag 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp6-R <400> 70 gatcaagtat tcccaaagcc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s1F <400> 71 agatagagtg tctgaagcag 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp6-R <400> 72 gatcaagtat tcccaaagcc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-1F <400> 73 tcttccaaag cccatacgac 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp5-R <400> 74 gacaaaaccc ttggatgaga 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s1F <400> 75 agatagagtg tctgaagcag 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp5-R <400> 76 gacaaaaccc ttggatgaga 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-1F <400> 77 tcttccaaag cccatacgac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp6-R <400> 78 gatcaagtat tcccaaagcc 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-s1F <400> 79 agatagagtg tctgaagcag 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf224-snp6-R <400> 80 gatcaagtat tcccaaagcc 20

Claims (4)

  1. 서열번호 77로 기재되는 핵산서열로 구성되는 정방향 프라이머 및 서열번호 78로 기재되는 핵산서열을 구성되는 역방향 프라이머를 포함하는 유채 웅성불임성의 회복에 관여하는 유전자의 유전자형 판별용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    제한효소 EcoRⅤ을 추가로 포함하는, 키트.
  3. 유채로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
    상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 제1항의 키트로 PCR을 수행하는 DNA 증폭단계;
    상기 증폭된 DNA 단편을 제한효소 EcoRⅤ으로 절단하는 제한효소 처리단계; 및
    상기 제한효소 처리단계의 반응물을 전기영동하여 밴드패턴을 확인하는 전기영동 단계를 포함하는, 유채의 웅성불임성 회복 여부 판별방법.
  4. 제3항에 있어서,
    1,385 bp의 밴드만 확인될 경우 유전자형이 Rfp / Rfp인 것으로 결정하고, 268 bp, 1,117 bp 및 1,385 bp의 세 개의 밴드가 확인될 경우 유전자형이 Rfp / rfp인 것으로 결정하며, 268 bp 및 1,117 bp의 두 개의 밴드만 확인될 경우 유전자형이 rfp/rfp인 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 판별방법.
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